文摘

内皮功能障碍是一个关键因素在糖尿病心血管并发症的起始。小檗碱能改善内皮功能障碍引起的糖尿病。然而,潜在的机制尚不清楚。本研究的目的是探讨小檗碱的保护作用和机制palmitate-induced内皮功能障碍在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。MTT比色HUVECs细胞生存能力的分析。一氧化氮(NO)水平和生产活性氧(ROS)在上层清液或培养HUVECs决定。的mRNA水平内皮一氧化氮合酶(以挪士)以rt - pcr来衡量,以挪士的蛋白质含量,p-eNOS, Akt, p-Akt, AMPK, p-AMPK, NADPH氧化酶(NOX4)进行了分析。结果表明,小檗碱明显没有水平升高和降低活性氧的生产。以挪士的表达明显增加,而NOX4蛋白表达减少berberine-treated HUVECs。此外,小檗碱调节蛋白表达的AMPK和p-AMPK palmitate-treated HUVECs,但没有影响一种蛋白激酶的水平。 Therefore, berberine ameliorates palmitate-induced endothelial dysfunction by upregulating eNOS expression and downregulating expression of NOX4. This regulatory effect of berberine may be related to the activation of AMPK.

1。介绍

心血管并发症引起的高死亡率和发病率的主要原因是肥胖、糖尿病和代谢综合症。内皮功能障碍被称为关键因素和主要病变在血管并发症的发展(1]。脂质代谢紊乱内皮功能障碍的发病机制中起着至关重要的作用在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病。所有这些障碍患者的异常增加血浆游离脂肪酸的浓度(FFA) (2]。高架FFA内皮可能引起一系列病理生理变化,包括内皮一氧化氮合酶(以挪士)解偶联,细胞内活性氧的积累(ROS)和细胞凋亡,进而有助于加速内皮功能障碍与过度加速动脉粥样硬化有关。研究表明,高浓度的FFA损害以挪士活动和减少生产和没有在内皮细胞的生物活性。FFA过载变弱Ca^{2 +}信号和以挪士活动,减少生产,间接导致内皮功能障碍在内皮细胞(1]。Ye-rong发现高架FFA可以抑制以挪士磷酸化及其基因表达,减少endothelium-derived没有生产,从而导致代谢综合症(损伤的血管舒张3]。此外,FFA-induced内皮功能障碍与NADPH氧化酶的活动,最重要的酶的生产_,在血管壁内。作为没有形成过氧亚硝基灭活(ONOO^{- - - - - -}),它触发一系列的有害事件,如减少没有生物利用度,减少生产的,导致受损的血管舒张(4]。猪等人报道高葡萄糖水平和FFA(棕榈酸酯)刺激ROS生产通过PKC-dependent NAD (P) H氧化酶的活化培养主动脉平滑肌细胞和内皮细胞,这部分占的过度加速动脉粥样硬化患者的胰岛素抵抗和糖尿病(5]。高架远期运费协议不仅抑制以挪士/没有信号通路,降低产量,而且激活NADPH氧化酶,增加生产,减少动脉粥样硬化和血栓形成的发展中没有生物活性与肥胖和糖尿病相关的血管并发症。的相关性,还建立了以挪士活动受损在棕榈酸酯刺激可能与toll样受体4 (TLR4)信号,这是一个关键的中介palmitate-induced IKKβ和NF -κB活化,随后减少胰岛素信号和内皮细胞(没有生产6,7]。

减少lipotoxicity可能是一个关键组成部分代谢综合征的心血管并发症的预防和治疗。黄连(根黄连从毛茛科)被用于中药1000多年。小檗碱、异喹啉生物碱的主要活性成分黄连(8],也报道了多向性的药理作用,包括抗菌、抗菌,抗炎,抗氧化性能,以及改善高脂血症和高血糖的影响。最近,动物和临床研究都表明,小檗碱改善胰岛素抵抗,降低血糖,调节脂质代谢,抑制肥胖和糖尿病的进展(8- - - - - -11]。小檗碱是否能改善内皮功能障碍,防止与这些疾病相关的心血管并发症会导致研究人员极大的兴趣。唐等人报道,小檗碱抗氧化效果和可能增加糖尿病并发症的保护作用[12]。豪等人表明,小檗碱改善糖尿病microendothelial损伤诱导的高葡萄糖和促进糖化结束的产品的组合在体外(13]。我们之前的研究表明,小檗碱不仅调节葡萄糖和脂类代谢,还改善了内皮功能障碍在糖尿病大鼠高脂肪饮食结合注射链脲霉素引起的。然而,小檗碱改善内皮功能障碍的潜在机制防止肥胖和糖尿病血管并发症尚不清楚。没有报告在lipotoxicity小檗碱的影响内皮功能障碍。因此,本研究旨在阐明小檗碱的保护作用和潜在机制在高剂量的棕榈酸酯引起的内皮功能障碍,这可能在未来小檗碱的临床应用提供依据。

2。材料和方法

2.1。材料

人类脐静脉内皮细胞从美国获得(通过传代形成细胞类型文化集合(写明ATCC,美国)。rpim - 1640中型和其他文化从Gibco试剂获得生活技术(美国纽约Gibco,大岛)。小檗碱是请提供东北制药总厂(长春,中国)。棕榈酸酯,二乙酸-nitro-L-arginine (L-NA), 2, 7-dichlorodihydrofluorescein (DCHF-DA)和噻唑基蓝色(MTT)购买的σ(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州,美国)。牛血清白蛋白(BSA,脂肪酸免费)和光纯化学工业公司购买kouichi(日本)。测量工具不提供从南京建成化工厂(中国南京)。以挪士引物被05合成生物技术(中国大连)。以挪士多克隆抗体,Akt, AMPK, NOX4买来圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯生物技术,CA)。化学药剂的免疫印迹和rt - pcr从西格玛奥德里奇获得。所有其他化学试剂购买从商业来源。

2.2。细胞培养

HUVECs rpim - 1640年培养中补充10%胎牛血清的边后卫和通道写明ATCC按照推荐程序。在段落4 - 8细胞用于实验;细胞受到外生游离脂肪酸(0.5 L更易与棕榈酸酯)12小时或24小时处理或不不同浓度的小檗碱(1.25,2.5和5μmol / L)。

2.3。准备的免费脂肪酸蛋白复合物

Lipid-containing媒体是由结合FFA BSA[描述使用修改后的方法14]。简单地说,棕榈酸酯溶解在0.1 M氢氧化钠溶液在70°C水浴充分溶解。那么0.1棕榈酸钠混合5%脂肪无酸的BSA在1:9比和离开一小时37°C孵化器。10毫米棕榈酸酯股票的解决方案是储存在−4°C。在实验之前,股票的解决方案是在完全培养基稀释所需浓度,调整pH值为7.5,过滤消毒。控制解决方案包含脂肪无酸的BSA准备以同样的方式。

2.4。细胞生存能力分析

MTT比色HUVECs是化验的可行性。简单,细胞被镀24 h在96孔板的密度1×10⁴细胞每200年μL媒介。当细胞融合上升到60%到70%,中了一个含有2%的边后卫和0.5更易与棕榈酸/ L(游离脂肪酸4.5%免费BSA)解决或处理不同浓度的小檗碱(1.25,2.5,和5μmol / L)。每一个6口井进行重复治疗。这些细胞被孵化20 h在37°C调湿室。MTT试剂(20μ在PBS L 5毫克/毫升)被添加到每个和孵化4 h。包含细胞的微型板块在1800转离心5分钟在4°C。MTT的解决方案被愿望从井中删除。甲瓒晶体于150年解散μL DMSO溶液。吸光度被记录在570 nm波长使用标。细胞生存能力计算如下:细胞生存能力(100%)=吸光度实验组/吸光度对照组×100%。

2.5。没有水平的测量

HUVECs种植在96 -好菜。当细胞融合增长到60%,中了一个包含2%的边后卫。细胞治疗0.5更易与棕榈酸/ L和各种浓度的小檗碱溶解在乙醇为24小时。同样体积的乙醇是包含在每一个对照组。没有在培养上清液由格里斯法(15]。

2.6。ROS水平测量

HUVECs镀在24-well菜6×10的密度⁴细胞每500年μL完全培养基。当细胞融合增长到60%,中了一个包含2%的边后卫。细胞治疗0.5更易与棕榈酸/ L和各种小檗碱浓度为12 h。2,7-Dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCFH-DA 10μM,σ)染色用于ROS分析如前所述[16]。

2.7。RNA提取和半定量rt - pcr

总RNA提取HUVECs使用试剂盒试剂(表达载体)。RNA样本量化通过分光光度法和完整性保证1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。的第一链互补dna合成了5 g总RNA,使用上标逆转录酶和益生元脱氧胸苷引物。的逆转录PCR产品放大,使用Taq DNA聚合酶和特定的引物对人类以挪士(转发:5′-GTGATGGCGAAGCGAGTGAAG-3′;反向:5′-CCGAGCCCGAACACACAGAAC-3′, 422个基点)和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH转发:5′-CCATGGAGAAGGCTGGG-3′;反向:5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′, 194个基点)。循环条件是94°C融化,60°C退火,和72°C扩展30秒(30周期以挪士GAPDH和28个周期)。放大条件优化的初步研究结果在线性范围内的放大。PCR产品可视化在1.5%琼脂糖凝胶由溴化乙锭染色法和凝胶在紫外光照射下拍摄。相对基因表达被被densitometrically量化分析使用图像软件。 GAPDH transcript abundance was considered as an internal control to which eNOS transcript abundance was normalized.

2.8。免疫印迹分析

蛋白质样本准备从培养HUVECs冰冷的细胞蛋白质溶解产物。蛋白质浓度测定用布拉德福德化验(Bio-rad蛋白质化验设备)。蛋白质样品(60μg)被煮沸5分钟,变性SDS-polyacrylamide凝胶分离的10%,然后在4°C和electroblotted转移到一个聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(Bio-Rad)。膜被封锁在5% (w / v)脱脂牛奶在室温下2 h,然后孵化与兔多克隆抗体(以挪士,1:800;一种蛋白激酶,1:1000;AMPK, 1: 1000;NOX4 1: 1000年,圣克鲁斯生物技术)在4°C与温和搅拌过夜。膜的清洗3次10分钟每15毫升TBST(10毫米Tris-HCl、150毫米氯化钠和0.1% (v / v) Tween-20)然后孵化第二抗体(1:1000山羊Anti-rabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶共轭,圣克鲁斯生物技术)在室温下2 h。增强化学发光的蛋白质被可视化解决方案和x射线胶片。加载纠正差异蛋白,膜的清洗和reprobed 1: 2000稀释山羊多克隆抗体肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术)。成像密度计是用来扫描蛋白质乐队和量化他们使用图像分析软件。

2.9。统计分析

所有数据都表示为均值±S.E.M.“”表示每组的样本大小。统计分析使用单向方差分析(方差分析)其次是图基因果检验。SPSS软件(Windows 13.0版)是用于统计分析。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。小檗碱对HUVECs生存能力的影响

HUVECs棕榈酸酯治疗组的生存能力下降%的价格相比没有棕榈酸酯治疗组。小檗碱后(1.25 ~ 5.0μ在HUVECs mol / L)治疗,细胞生存能力提高%,%(图1)。尽管这种差异没有达到统计学意义,但增加趋势可以观察到。在初步实验中,我们发现,小檗碱的浓度很高(> 5.0μmol / L)诱导毒性HUVECs(数据没有显示)。因此,不同浓度的小檗碱(1.25 ~ 5.0μmol / L)选择在以下研究。

3.2。小檗碱对没有水平的影响培养HUVECs媒介

HUVECs培养0.5更易与棕榈酸/ L显示显著降低没有释放比HUVECs没有棕榈酸酯治疗(图2)。小檗碱治疗显著增加没有释放与未经处理的棕榈酸酯HUVECs。小檗碱5.0μmol / L最强的影响没有释放。以挪士抑制剂L-NA部分抑制小檗碱在没有释放的影响。这些结果表明,棕榈酸酯可以降低在培养HUVECs没有合成和释放,而小檗碱能够明显救援没有生产可能与以挪士,没有在内皮细胞合成的关键酶。

3.3。在HUVECs小檗碱对活性氧的影响

如图3绿色荧光强度在HUVECs培养与棕榈酸酯显著增强的价格相比对照组,表明细胞内ROS水平在棕榈酸酯刺激HUVECs明显增加。小檗碱治疗减少细胞内荧光强度与棕榈酸酯组相比剂量依赖性的方式。这些结果表明,棕榈酸酯能明显刺激从HUVECs ROS增加生产和释放,这可能与氧化应激引起的细胞损伤有关。人们相信小檗碱治疗可以减少活性氧的生产棕榈酸诱导高培养HUVECs和内皮细胞起到保护作用。

3.4。小檗碱对以挪士mRNA表达的影响

棕榈酸酯治疗显著降低以挪士mRNA表达HUVECs与对照组(图4),而有趣的是,小檗碱治疗可以拯救以挪士mRNA在palmitate-HUVECs剂量依赖性的方式()。

3.5。以挪士小檗碱对信号的影响,一种蛋白激酶,AMPK

探讨小檗碱治疗能否激活以挪士及其上游激酶,Akt在培养HUVECs AMPK,以挪士,Akt, AMPK蛋白表达分析西方免疫印迹(图5)。以挪士和磷酸化的蛋白表达以挪士在HUVECs刺激显著降低棕榈酸酯比控制细胞(图5(一个))。小檗碱以挪士和以挪士的磷酸化蛋白表达明显增加。与集团没有棕榈酸酯相比,总Akt蛋白表达无显著变化与棕榈酸酯HUVECs培养,而一种蛋白激酶的磷酸化表达明显降低。小檗碱治疗并没有改变一种蛋白激酶的表达和刺激HUVECs p-Akt棕榈酸酯(图5 (c))。然而,AMPK的蛋白表达,以挪士的另一个上游激酶在内皮细胞,显著降低HUVECs培养与棕榈酸酯与对照组相比(没有棕榈酸酯)。小檗碱的增加不仅总AMPK的蛋白表达也AMPK的磷酸化(图5 (b))。这些结果表明,棕榈酸酯可能下调以挪士在培养HUVECs表达式。小檗碱治疗可以逆转这种变化可能有助于激活AMPK,促进以挪士磷酸化。虽然以挪士/ Akt信号通路可能不会参与。

3.6。NOX4小檗碱对蛋白表达的影响

以挪士表达相比,NOX4蛋白表达,在血管内皮细胞NADPH氧化酶的主要单元,在HUVECs刺激明显增强的棕榈酸酯(图6)。小檗碱治疗NOX4的蛋白表达降低HUVECs培养与棕榈酸酯与对照组相比(没有棕榈酸酯)。它表明,小檗碱能减少ROS水平下调NOX4表达式。

4所示。讨论

增加氧化应激和减少不重要的因素和生物利用度与炎症密切相关的信号通路如toll样受体4信号在内皮功能障碍的发病机制,高血压和心血管和肾脏疾病(17]。我们以前的研究表明,小檗碱恢复内皮血管舒张功能在糖尿病条件下提高生物利用度。在目前的研究中,在没有和ROS小檗碱生产的直接影响进一步观察palmitate-induced HUVECs内皮损伤。结果表明,HUVECs培养的存活率与0.5毫米棕榈酸酯为24小时显著下降。此外,小檗碱治疗显著增加没有内容HUVECs上层清液的培养与棕榈酸酯。这些结果表明,小檗碱的保护作用FFA引起的内皮功能障碍可能与高程的水平。

以挪士是一个关键酶,生产没有在血管内皮细胞。内皮细胞的研究表明,FFA高程的培养基可以显著减少的活动以挪士(18]。棕榈酸和油酸可以抑制以挪士的磷酸化ser1177网站,进而减少生产,可能导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化的发生18]。健康SD大鼠注射静脉输注脂肪乳剂和肝素;高架FFA水平抑制以挪士活动和表达,减少endothelium-derived生产反过来(19]。据报道,endothelium-derived生产被以挪士/ Akt介导的信号通路(20.]。根据这些结果,我们的结果表明,棕榈酸显著减少的表达在培养HUVECs以挪士。小檗碱治疗调节以挪士mRNA的表达和血清总蛋白的磷酸化和推广以挪士ser1177地点,从而增加了没有合成。以挪士之一,此外,L-NA抑制剂,部分由小檗碱减毒没有生产了。此外,在目前的研究可以看出,棕榈酸在HUVECs显著减少了一种蛋白激酶的磷酸化。然而,并不影响小檗碱一种蛋白激酶的表达及其磷酸化与软脂酸HUVECs培养。它可能表明,小檗碱可能发挥其监管效果以挪士活动通过其他方式。

腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK),作为受体细胞内的能量,吸引了更多的关注,成为一个新的目标治疗糖尿病及其心血管并发症由于其监管影响内皮细胞功能和能源近年来内稳态。AMPK的调节功能没有合成中扮演一个重要的角色在内皮细胞信号通路。以挪士AMPK,上游激酶,促进以挪士的磷酸化Ser1177网站。AMPK一半寿命可以促进形成以挪士和复杂,从而激活以挪士(17,21]。我们的研究结果表明,小檗碱能够显著上调AMPK和p-AMPK蛋白质的表达水平HUVECs培养与棕榈酸,但没有影响Akt p-Akt蛋白的表达。因此,我们推测,小檗碱的监管效果以挪士活动与生产可能与激活AMPK的部分。

此外,内皮功能障碍也与血管内皮细胞活性氧的产生除了减少生产。它已被广泛接受,ROS水平升高主要是来源于NADPH氧化酶的作用(NOX)。激活氮氧化物可以改善ROS的形成和导致内皮功能障碍(22]。NOX4亚型的NADPH氧化酶表达主要在血管内皮细胞的主要来源在内皮细胞生产。在目前的研究中,活性氧产量和NOX4蛋白表达在培养HUVECs测量。我们的研究结果表明,棕榈酸显著增加活性氧的生产和养殖HUVECs NOX4蛋白的表达。虽然小檗碱降低ROS生产和NOX4蛋白表达降低。这些结果符合我们之前发现的糖尿病动物模型。

几行表明,AMPK的研究是一个重要的心血管细胞NADPH氧化酶的抑制剂。激活AMPK减少活性氧的生产通过抑制NADPH氧化酶的活性,最终阻止了棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡(23]。AMPK催化剂如二甲双胍可能通过抑制氮氧化物发挥他们的心血管保护作用[24]。AMPK活化抑制氮氧化物活动可以阻止氮氧化物磷酸化和易位细胞膜或灭活转录因子包括NF -κB和统计(25]。因此,小檗碱可能阻止内皮功能障碍FFA-induced ROS生成的激活AMPK。综上所述,小檗碱抑制以挪士激活和NOX4-derived活性氧积累HUVECs FFA通过AMPK活化处理,这可能有助于保护小檗碱对内皮功能的影响。然而,在我们的实验中,AMPK的特定抑制剂是不习惯。还是未知的小檗碱对调节的影响是否以挪士和NOX4可以被AMPK抑制剂,应探索未来明确的分子机制研究。此外,据报道,小檗碱能够抑制TLR4-NFκB通路LPS-induced在小鼠肠道损伤,损伤的途径参与以挪士表达,没有生产。这可能是另一种机制参与了小檗碱的保护作用内皮功能障碍和仍然需要进一步的调查26]。

总之,本研究调查了小檗碱的保护作用诱导的血管内皮细胞功能损伤模型软脂酸孵化,并揭示底层机制小檗碱能够显著改善内皮功能障碍。小檗碱可能上调以挪士表达式,加强以挪士活动,促进生产。同时,小檗碱可能下调NADPH氧化酶表达和抑制其活性降低ROS生产然后抑制没有失活。因此,小檗碱治疗可以提高生物活性的保护血管内皮细胞的功能。在我们的研究中,我们还发现,小檗碱的监管效果以挪士和NADPH氧化酶活性可能与AMPK的激活。这些结果为应用程序提供了一个重要的理论证据小檗碱的预防和治疗肥胖、糖尿病和心血管并发症。

作者的贡献

张明和Chun-Mei王同样导致了纸。

确认

本研究的研究是由来自中国国家自然科学基金的资助(81170745,81170745)和国家重点实验室开放项目下的吉林大学超分子结构与材料的批准号SKLSSM201317。