HMGB1阻断对缺血再灌注心肌损伤的衰减是toll样受体2依赖的

摘要

基因或药物消蚀toll样受体2 (TLR2)可保护心肌缺血再灌注损伤(MI/R)。然而，内源性TLR2激活配体尚未被检测到。本研究的目的是确定HMGB1作为MI/R过程中TLR2信号的激活因子。C57BL/6野生型或TLR2^{- / -}-小鼠在心肌缺血前1小时(30分钟)和再灌注前(24小时)分别注射vehicle、HMGB1或HMGB1 BoxA。量化梗死面积、心肌肌钙蛋白T、白细胞浸润、HMGB1释放、TLR4-、TLR9-和rage表达。在冠状动脉搭桥术(CABG)患者中测定HMGB1的血浆水平。HMGB1拮抗剂BoxA减少WT小鼠MI/R期间心肌细胞坏死，并减少白细胞浸润。然而，注射HMGB1并没有增加WT动物的梗死面积。在TLR2^{- / -}-心脏，BoxA和HMGB1均不影响梗死面积。RAGE和TLR9表达无差异，TLR2表达无差异^{- / -}-小鼠显示TLR4和HMGB1表达增加。TLR2患者血浆HMGB1水平增加MI/R^{- / -}-小鼠冠脉搭桥术后携带TLR2多态性(Arg753Gln)的患者。我们在这里提供的证据表明，TLR2信号的缺失会破坏HMGB1封锁的梗死保护作用。

1.介绍

toll样受体是最重要的一类先天免疫受体，是抵御病原体入侵的第一道防线。除了宿主防御外，这些受体在大多数无菌炎症条件中也有作用。我们和其他人已经证明抗体封锁[1]，药理学预处理[2，3.，或遗传消融[4，5toll样受体2 (TLR2)信号通路在小鼠心肌缺血再灌注(MI/R)模型中具有保护作用。目前所报道的潜在机制包括增强磷酸肌醇-3-激酶/Akt信号，增加Connexin 43缝隙连接的保存，减少促凋亡信号，减少促炎症细胞因子，以及随后减少白细胞浸润的趋化因子释放[1- - - - - -5］．然而，目前还不清楚它所提出的内源性配体是哪一种导致MI/R中TLR2激活。

作为核蛋白的高迁移率组盒1（HMGB1）具有两个DNA结合结构域，并且参与核心核心和基因表达的调节[6］．作为一种细胞溶胶蛋白，它参与了自噬促进[7]，作为一种细胞外蛋白，它要么被动地从坏死细胞中释放出来[8或在促炎刺激下由免疫细胞积极分泌[9］．由于HMGB1释放出来或增强炎症反应[10，11]通常被视为原型损伤相关的分子图案（潮湿，而不是PAMP，病原体相关分子模式，这是典型的TLR配体）。然而，当在许多研究中，这种观点变化，高度纯净的HMGB1未能发挥促炎细胞因子样功能（在[12])。因此，我们推断HMGB1可能作为伴侣增强或调节促炎介质的作用。

Andrassy等人在一项研究中确定了HMGB1在MI/R中的作用，该研究与促炎的HMGB1细胞因子概念一致，当给药HMGB1时，心肌损伤增加，当HMGB1被其无功能片段Box A竞争性阻断时，坏死减少[13］．在没有受体的情况下不能观察到对先进的糖糖末端产物（RAGE）的受体来观察到这两种影响，这是神经炎和巨噬细胞中的第一个鉴定的HMGB1的受体[14，15］．然而，除RAGE外，其他受体包括TLR2、TLR4和TLR9已被鉴定为HMGB1受体[16- - - - - -18，而这些受体的利用在细胞类型和组织之间可能有很大的不同[19］．

因此，在本研究中，我们验证了以下假设:给药或药物阻断HMGB1影响MI/R后的心肌损伤，这些影响依赖于TLR2。除了在MI/R中假定的不良影响外，必须注意的是，在心肌梗死恢复过程中，大量研究表明外源性HMGB1注射可防止不良重塑和改善心功能[20.- - - - - -22］．本临床前研究，但是，进行以确定HMGB1作为负责在MI / R的急性期TLR2活化的配体物/辅因子。

在白种人人群中，非功能性TLR2多态性杂合子携带者(Arg753Gln)的发生率较高[23］．arg753GlN突变的载体在经皮透视冠状动脉血管成形术（PTCA）后冠状动脉恢复的风险更高24］．为了确定心肌梗死/R中HMGB1释放与Arg753Gln多态性存在之间的可能关系，我们量化了接受选择性冠状动脉旁路移植术(CABG)患者的血清HMGB1浓度。招募患者进行心脏外科手术中toll样受体多态性研究。对接受择期冠脉搭桥手术的Arg753Gln多态性携带者进行了亚组分析，并将其与研究集体中年龄和性别匹配的对照组进行了比较。

2.材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6JRj野生型（WT）和TLR2^{- / -}老鼠(B6.129 -/J，杰克逊实验室，巴尔港，缅因州，美国)，回交C57BL/ 6j背景9代。本研究中使用的动物的年龄在5到7个月之间。这些动物被安置在指定的无病原体条件下，并可获得标准的实验室动物饲料和水自由．所有程序都按照实验动物的护理和使用指南通过健康的美国国家研究院公布，由当地政府主管部门批准（批准参考编号F91 / 53，Regierungspräsidium达姆施塔特，德国）。

2.2。心肌缺血/再灌注（MIR）

如前所述进行实验性心肌缺血[25，26］．用腹膜内（I.P.）注射戊巴比妥（I.P.）的小鼠麻醉的戊巴比妥（Narcoren 90毫克/千克，Merial GmbH，Hallbergmoos，德国）。对于镇痛动物接受丁丙诺啡。（0.05 mg / kg）之前和干预后的8小时。使用闪闪发光的迷你活性（Hugo Sachs Elektronik-Harvard设备，德国3月 - Hugstetten，Germany）口头上口服并通风。 μ.L/g体重，频率110/min。设置为0.5。在第四肋间隙左开胸可以看到心脏的前部。采用7-0缝线(Seralene, Serag-Wiessner, Naila, Germany)结扎左前降支冠状动脉，其末端通过短PE管，拉紧，用微serrefine固定。心肌明显苍白，证实缺血。缺血30分钟后，释放线张力，目测再灌注。伤口愈合后，将动物从呼吸器中断奶。一旦自主呼吸充分，就取出气管导管。通过面罩给动物供氧，直到动物自己从呼吸机中取出。再灌注24小时后，按上述方法麻醉动物。用肝素注射器从下腔静脉取血，重新收紧结扎，经右心室注射EvansBlue染料(Sigma-Aldrich, Munich, Germany)。

在缺血前1小时给动物注射载具(Veh, 5% DMSO磷酸盐缓冲盐水)、HMGB1 Box A (300μ.g，无lps, HMGBiotech，米兰，意大利)或重组HMGB1 (600μ.G，无LPS，埃比斯科，法兰克福，德国）。

2.3。梗塞大小确定

伊文思蓝染心脏被切除，立即切成五等份。这些切片的照片在对硝基蓝四唑(0.5%，25分钟，37℃，Sigma-Aldrich, Munich, Germany)孵育前后拍摄。使用SigmaScan Pro图像测量软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)对梗死面积(IS)和危险面积(AR)进行平面量化。

２.４.心肌肌钙蛋白T

Blood samples were centrifuged for 7 minutes at 7000 ×g. Plasma was stored at −80°C until assayed. Samples were diluted 1 : 10 in whole blood of untreated WT animals and cardiac troponin T was quantified using the Cardiac Reader (Roche, Mannheim, Germany), according to the manufacturer’s instructions.

2．5．白细胞计数

白细胞浸润在定量多聚甲醛5嵌入 μ.m片苏木精伊红染色。每只动物10个显微镜视野，放大20倍，覆盖3.2 mm²对危险区域进行了分析

2.6。实时rt - pcr

根据制造商的说明，使用SybR绿色掺入（应用生物系统，Weiterstadt，Weiterstadt，Weiterstadt，Weiterstadt，Weiterstadt，Germany）进行实时PCR。分析样品的重复分析。结果用ΔδCT方法呈现为WT动物AnAR的X折叠表达。使用的引物是HMGB1（前进5'-TGC GTC TGC CTC CCG CTC TC-3'，REVERS 5'-AGT TGA TTT TCC TCC GCG AGG CAC-3'），RAGE（前进5'- CAC TTG TGC TAA GCT GTA AGGG-3';反向5'-cat cga caa ttc cag tgg ctg-3'），tlr4（前进5'-gcc ttt cag gga at aag ctc c-3';反向5'-gat caa ccg ATG Gac GTG TAAA-3'），TLR9（前进5'-ACA ACT CTG ACT TCG TCC ACC-3'; REVERSE 5'-TCT GGG CTC AAT GGT CAT GTG-3'），18S（前进5'-CAC GGG AAA CCT CACCCG GC-3'，反向5'-CGG GTG GCT GAA CCG CCA CTT-3'）。

2.7。免疫组织化学

使用山羊抗主母牛原发性抗体（＃AF1179，研发系统，Wiesbaden，德国）和兔抗原二抗（JAF017，R＆D Systems，Wiesbaden，Germany）的标准免疫组化方案评估rage表达。二氨基苯甲酸（DAB）可视化抗体结合。DAB阳性区域以覆盖3.2mm的倍率为10倍的10倍的微观区域的总面积的分数²．

2.8。血浆HMGB1

样品采用ELISA微量滴定板分析。水井被涂上50μ.L / HORE的抗HMGB1 / HMG1（UPSTATE BIOTECHNOLOGY，LAKE PLACID，NY）在1.5时 μ.克/毫升。在4°C孵育过夜后，用1%的BSA在PBS中阻断板。加入标准品和血清样品，室温孵育2小时。洗后,50μ.L生物素化抗hmgb1 (R&D Systems, Abingdon, UK)， 0.75μ.加入G / mL，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入链霉蛋白过氧化物酶并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入3,3'，加入5,5,5'-四甲基苯胺二盐酸盐（TMB）。用h后15分钟后停止反应₂所以₄(1 M) and read spectrophotometrically at 450 nm.

2.9。患者招聘

该临床试验旨在研究TLR多态性在心脏手术中的作用。纳入和排除标准已在其他地方公布[27］．简单地说，包括接受选择性心脏手术(冠状动脉旁路移植术(CABG)和/或瓣膜手术(VS)包括置换和重建)的患者。入选标准如下:患者年龄必须在18岁或以上，并有选择性心脏手术，体外循环(CPB)。排除标准为:无体外循环心脏手术、HPA轴疾患史、术前30天内应用糖皮质激素全身或局部治疗。该研究得到了当地伦理审查委员会(杜塞尔多夫大学医院)的批准，并按照赫尔辛基宣言和所有进一步修订确立的原则进行。获得了书面同意。用商业试剂盒(QIAmp, Qiagen, Hilden, Germany)从全血中提取DNA。TLR2 SNP Arg753Gln (rs5743708)的基因分型通过使用FRET探针和Lightcycler (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)进行熔化曲线分析，如前面所述[28］．该研究共收集了5例TLR2多态性杂合子患者，并将Arg753Gln与10例年龄和性别匹配的对照组进行了比较。术前及术后第3天测定血浆HMGB1水平。患者的人口统计资料见表1．

2.10。统计数据

使用Prism软件(GraphPad software Inc.， La Jolla, CA)进行统计分析。结果显示为n个观察的平均值±SEM。所有数据集都进行了正态性测试。组间比较采用曼-惠特尼法或学生-tests，在适当情况下。被认为是显著的。

3.结果

3．1.HMGB1拮抗剂A盒减少心肌损伤

风险（AR）相对于左心室（LV）面积的区域在所有实验组中相似（图1(一)）.Box A是HMGB1的一种非功能性成分和竞争性拮抗剂，相比于WT小鼠，Box A可降低梗死面积(IS)和肌钙蛋白T (TnT)血浆水平(图)1 (b)和1 (c)）.在TLR2^{- / -}结果显示MI/R后心肌损伤减少，Box A处理对梗死面积或TnT水平没有影响。

3.2。用HMGB1注射没有加重心肌坏死

相反，用纯化HMGB1注射液加重心肌损伤。然而，在WT和TLR2中，注射HMGB1对MI/R后梗死面积和TnT水平均无影响^{- / -}（数字1(一)和1 (c)）.

３．３．A盒治疗后白细胞浸润减少

注射用方框A减少白细胞浸润到WT动物相比VEH处理的对照的AR（图2）.伴随其未能加剧心肌损伤，用纯化的HMGB1注射也没有在WT动物中增加白细胞浸润。白细胞浸润在TLR2中^{- / -}没有受到任何盒A或HMGB1处理。

3．4．MI/R后HMGB1及其受体RAGE、TLR4、TLR9的表达水平

HMGB1 mRNA在TLR2的ANAR中中度升高^{- / -}与WT相比，MI/R后的动物(图3(一个)）.与wt相比，这伴随着显着较高的HMGB1血浆水平（图3 (b)）.然而，HMGB1在几种细胞类型中的主要受体RAGE的表达在基因型之间没有差异(图)3 (c)和3（d）），TLR9的mRNA表达也不是（图3（e））.TLR4，另一个受体HMGB1，表现出增加TLR2基因表达^{- / -}与野生型相比(图图3（f））.

3．5．Arg753Gln TLR2多态性杂合子的患者在冠脉搭桥术后显示HMGB1释放增加

在以下变量中，Arg753Gln多态性携带者与年龄、性别匹配的对照组之间无显著差异(表1）：体重指数（BMI），手术持续时间，与总CK释放有关的肌酸激酶（CK-MB）的心肌异构型或释放心肌异构型（CK-MB [])。

相比所有接受冠状动脉搭桥术体外循环手术的病人表现为增加了手术3天后HMGB1血浆水平基线（图4）.然而，在Arg753Gln多态性携带者中，HMGB1释放的诱导更为明显。

4。讨论

本研究结果确定了心肌缺血再灌注中HMGB1和tlr2信号通路之间的关系。

与先前的观察结果一致[13]，通过HMGB1亚基Box A竞争性拮抗可改善WT动物MI/R后心肌损伤，并伴有白细胞浸润减少。中性粒细胞浸润是再灌注损伤的标志之一[29]，使再灌注急性期组织损伤持续，是心肌创面愈合和瘢痕形成的先决条件。然而，在中性粒细胞中，RAGE仅在hmgb1诱导的NF-的促进中起次要作用κ..相比于TLR2和TLR4 [B活化16］．此外，HMGB1预处理使THP-1单核细胞对TLR2激动剂脂磷壁酸刺激反应减弱，这是一种独立于RAGE的机制[30.］．

在TLR2^{- / -}动物，其中如先前报道[4]，显示出降低的心肌坏死和白细胞浸润，没有进一步的保护可以与盒A，这将已经预期处理后可观察到，如果HMGB1信令是仅RAGE依赖性在MI / R [13］．在MI/R后，这些动物的内源性HMGB1释放显著增加，这在观察中更加突出。TLR2中RAGE或TLR9表达的补偿性改变^{- / -}可以排除心肌，而TLR4的中度上调在这些动物中变得明显。

本研究中使用的重组HMGB1制剂不能增加WT动物的心肌坏死，然而，这与最近质疑HMGB1本身作为促炎介质的看法的证据一致[31- - - - - -34］．与Andrassy等相关研究中使用的重组HMGB1不同，HMGB1治疗后心肌坏死加重[13]，本研究中使用的重组HMGB1制剂是一种市售的无脂多糖制剂。该制剂也在HL-1心肌细胞中进行了测试，其中它未能诱导促炎介质(肿瘤坏死因子)α，白细胞介素-6，趋化因子（C-X-C基序）配体2，数据未示出）。因此，在WT或TLR2中没有观察HMGB1处理的影响^{- / -}动物。

HMGB1是作为细胞因子本身还是作为其他DAMPs的辅助因子/伴侣，目前的研究还不能回答这个问题。然而，这里提供的数据允许这样的结论:MI/R中成功的抑制HMGB1的梗死保留治疗可能依赖于TLR2的存在。后者可能对发展针对HMGB1的治疗策略特别感兴趣，因为功能较弱的TLR2多态性经常在白种人人群中发现(9.4%)[23]和心脏手术病人（3.8％）27］．TLR2.^{- / -}同样，Arg753Gln多态性杂合携带者在冠脉搭桥术后第3天与对照组相比，血清HMGB1水平显著升高。提示这组患者可能对hmgb1靶向治疗有不同的反应。在经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的st段抬高型心肌梗死中，HMGB1血浆水平升高与死亡率和残余心室功能独立相关，因此这一研究更加有趣[35，36[Mi和PCI后，Arg753GlN多态性的载体是冠状动脉恢复的风险较高[24］．

5.结论

总之，本研究有助于了解HMGB1在心肌缺血和再灌注中的作用。除了已知的受体愤怒的参与之外，我们在这里提供了TLR2在急性心肌缺血再灌注过程中释放的内源HMGB1的介导效果的证据。

冲突或利益

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作是由德意志研究联合会格兰特（SFB815，A17），以扬Mersmann和凯Zacharowski支持。亚历山大·科赫是由来自Forschungskommission，杜塞尔多夫大学的资助。

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