文摘

Rett综合症(RTT)主要是由突变引起x连锁methyl-CpG结合蛋白(MeCP2)基因。通过绑定到甲基化促进剂CpG岛MeCP2蛋白质能够调节多个基因和重要的细胞通路。因此,突变MeCP2会严重影响到细胞的表型。今天,途径MeCP2在RTT突变能够影响还不清楚。我们的研究的目的是探讨外周血基因表达谱lymphomonocytes (PBMC)隔绝RTT病人试图证据新基因、新途径,参与RTT病理生理学。LIMMA(微阵列的线性模型)和萨姆(意义的微阵列分析)分析微阵列数据从12 RTT患者和对照组发现482基因在RTT调制,其中430是调节和52个表达下调。功能聚类共146个基因在RTT识别关键生物学途径与线粒体功能和组织,细胞泛素化和蛋白酶体降解,RNA加工,染色质折叠。我们的微阵列数据揭示基因的超表达ATP合成建议改变能源需求与增加蛋白质降解的活动。总之,这些发现表明,mitochondrial-ATP-proteasome函数可能会参与RTT临床特征。

1。介绍

Rett综合症(RTT)是一种罕见的自闭症谱系障碍(ASD),与世界范围内的流行率主要影响女孩范围从1:10000 - 1:20000活产1- - - - - -5]。RTT临床定义的条件有一个很大的光谱与多种基因型变异相关的表型(6,7]。经典的或典型的RTT,最常见的情况,造成大约90 - 95%的病例新创突变MeCP2,绘制X染色体上基因和编码methyl-CpG结合蛋白2 (7,8]。古典形式的临床进展通过四个阶段的特征是正常发展第一6到18个月,紧随其后的是有目的的手部运动,语言发展的失败,出自闭症行为,大脑,增长放缓,和精神发育迟滞9]。

到目前为止,我们不知道如何去做MeCP2突变导致RTT表型;因此,识别影响的途径MeCP2功能可以带来新的见解的RTT发病的机制。MeCP2最初是作为转录抑制因子通过绑定到甲基化CpG二核苷酸,而最近的研究个体更多的功能与MeCP2 [10,11]。事实上MeCP2现在被认为是一个多功能蛋白质,不仅因为它是涉及基因组转录沉默,而且在转录激活,通过调节染色质和核架构(11];因此,它的故障或突变可以导致严重的细胞功能的改变。

因此,它是非常困难的理解之间的联系MeCP2出现在RTT突变和临床特征。最常见的一种方法用于更好地理解所涉及的分子途径遗传病基因表达分析的决心,因为它提供了机会来评估可能的转录组变化的基因和基因网络的水平。这种方法不应被视为一个终点而是一个放大借给新方面参与了疾病可以被发现,然后进行了研究。

到目前为止,只有少数研究调查RTT儿童组织的基因表达谱,也就是说,后期大脑样本(12等),或在细胞克隆成纤维细胞与皮肤活检的13,14)和无限增殖lymphoblastoid细胞株(14- - - - - -16]。此外,一些研究已经进行微阵列基因表达分析使用在体外细胞模型代表MeCP2 siRNAs[引起的缺陷17)或细胞和组织从RTT小鼠模型(18),但我们的知识没有微阵列数据分析从“体外“新鲜样品。出于这个原因,本研究的目的是评估从RTT患者PBMC孤立的基因表达模式。这种方法允许我们绕过的一些局限性/变量前面的基因阵列研究RTT,如后期样品的使用、基因修饰细胞和小鼠组织并不总是反映人类疾病的所有功能。事实上,学习体外样品,如PBMC,提供了一些优势,可以概括的PBMC细胞是唯一可用的人类;各种研究表明disease-characteristic PBMC中基因表达模式,可以很容易获得。

我们的结果确定了明确的控制之间的基因表达谱差异和RTT的病人,有近500个基因被管制,暗示一些新的途径参与了这一障碍。

2。对象和方法

2.1。受试者人口

临床诊断的研究包括12个女性患者典型的RTT(平均年龄:年,范围:第6 - 22)MeCP2基因突变和7性别和年龄健康对照组(平均年龄:年,范围:4-32)。RTT诊断和包含/排除标准是基于最近修订的RTT命名一致(4]。所有患者连续承认Rett综合症国家参考中心的大学医院Azienda Ospedaliera大学联盟Senese(险)。表1礼物登记病人的人口和遗传特点进行微阵列分析。血液采样期间对照组进行常规健康检查,体育,或献血,而患者的血液样本中得到周期性的临床检查。批准的研究机构审查委员会和知情同意都来自父母或合法的导师招收患者。

2.2。血液标本收集、外周血Lymphomonocytes隔离和RNA提取

血液收集肝素化管和所有操作后30分钟内进行样品收集。PBMC从全血中分离了出来通过密度梯度离心法使用Ficoll-Paque +(通用电气医疗集团欧洲GmbH,意大利米兰)。PBMC隔离后,总RNA提取细胞使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国),根据制造商的指示。总核酸浓度和纯度估计使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)。质量检查的RNA安捷伦生物分析仪(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。孤立的RNA样本存储在−80°C到分析。

2.3。微阵列处理

对微阵列处理,RNA是放大和标签使用Affymetrix Whole-Transcript (WT)感觉目标标签协议。Affymetrix GeneChip人类基因第1.0位数组和标记的DNA,杂化洗涤、染色、扫描根据WT感觉目标标签描述的协议分析手册。

短暂,100 ng的总RNA反转录成双链cDNA用随机五个一贴上T7启动子序列。双链cDNA随后被用作模板和放大T7 RNA聚合酶,反义cRNA复印。第二周期互补脱氧核糖核酸合成、随机五个一被用来'逆转录的cRNA单链DNA从第一个周期产生的取向。dUTP成立于DNA在第二个周期,第一链反转录反应。然后这个单链DNA样本与DNA结合尿嘧啶糖基化酶(UDG)和apurinic / apyrimidinic酶1(猿1),特别是认识到自然的dUTP残留物和打破了DNA链。DNA标签是通过末端转移酶(TdT) Affymetrix专有DNA共价与生物素标记试剂。5μg标记cDNA是杂化的人类基因第1.0位数组在45°C 17小时。数组被洗,染色Affymetrix流体站450年和扫描使用Affymetrix GeneChip扫描仪3000。

2.4。微阵列数据分析

微阵列实验分析了oneChannelGUI包中可用R软件。每个芯片的信号强度与RMA初步规范化方法和过滤通过差过滤器选择阈值为0.25。这个特定的过滤器移除probesets不存在分析微阵列表达的变化。0.25的阈值是一个中间值,保留了probesets显示有意义的改变的信号至少在25%的微阵列分析。微阵列数据分析了山姆和LIMMA分析。山姆方法使用基于排列的统计和是一个有效的方法分析数据并不服从正态分布,表现优于其他技术(如方差分析和经典以及)承担平等的方差和/或独立的基因。LIMMA适合每个基因表达的线性回归模型测试significativity距离模型以及强劲的反对nonnormality差异和不平等。为了描述生物过程浓缩在调节基因的列表,统计分析过多基因本体论(去)条款执行(BP水平5)与大卫(数据库进行注释、可视化和综合发现)web服务器(DAVID生物信息学资源)19]。只有去丰富的条款值< 0.05纠正Benjamini和业务方法(20.选择和分层次clusterized(沃德的方法)根据他们的“语义”相似性估计与GOSIM R包默认参数。集群化最佳数量的集群被确认后根据轮廓的分析分数和medoid项在每个集群被选为代表的集群成员。每个集群代表一群生物过程具有类似e / o相关功能。

2.5。微阵列数据的验证RT-qPCR(逆转录定量实时PCR)

确认Affymetrix表达芯片结果,RT-qPCR分析如前所述[21]。验证、六个差异表达的基因,3调节-GSTO1,PSMB10和COX8A——3表达下调,HIST1H1B,MMP9和ARHGAP11B——微阵列,选择。验证了在原始样本的一个随机选择的子集(微阵列分析提交),其中包括3健康对照组和3 RTT的病人。引物对得到的实时PCR基因库底漆杂交独特的地区适当的基因序列:GSTO1(弗兰克-威廉姆斯:5′aga GTT GTT TTC TAA GGT TCT GAC条t - 3′)和(RW: 5′法柠檬酸TTG CTT CCA GCC GT-3′),产品长度116个基点;PSMB10(弗兰克-威廉姆斯:5′aca广汽GTG亚美大陆煤层气有限公司有条件现金援助AGC AG-3′)和(Rw: 5′acc棉酚TCG TTA GTG GCT CG-3′),产品长度294个基点;COX8A(弗兰克-威廉姆斯:5′gcc亚美大陆煤层气有限公司TCG ATC猫TTG CC-3′)和(RW: 5′tct GGC CTC CTG标签GTC TC-3′),产品长度137个基点;HIST1H1B(弗兰克-威廉姆斯:5′ccc GGC TAA棉酚棉酚GGC AA-3′)和(RW: 5′aca GCC TTG GTG ATC AGC TC-3′),产品长度99个基点;MMP9(弗兰克-威廉姆斯:5′gtc CGT GAG GGT GTT GAG TG-3′)和(RW: 5′法GCT CAA AGC CTC CAC AA-3′),产品长度145个基点;ARHGAP11B(弗兰克-威廉姆斯:5′aac TGC CAG AGC CCA TTC TC-3′)和(RW: 5′gtc TGG TAC ACG CCC TTC TT-3′),产品长度295个基点。所有的反应都是一式三份。GAPDH(弗兰克-威廉姆斯:5′tga公司治理文化TGG GGC TGG猫TG-3′和RW: 5′GGC TGG TGG太极拳gg GGT CT-3′, 134 pb)是用于我们的实验作为内部标准。如前所述,样本比较使用相对周期阈值(CT)方法(Livak和Schmittgen 2001)。更稳定的mRNA GAPDH正常化后,褶皱增加或减少决心控制,使用公式,ΔCT感兴趣的基因(CT)−(CT)参考基因和ΔΔCT(ΔCT实验)−(ΔCT控制)。意味着±SEM的结果是三个独立的实验中,每分析一式三份。与控制(单向方差分析Bonferroni期末测验)紧随其后。

3所示。结果与讨论

3.1。不同RTT患者的调节基因

鉴于RTT转录调制器MeCP2功能障碍的结果,几个策略也已经被开发出来,以确定其目标基因为了获得洞察疾病发病机理(12- - - - - -18]。在我们的研究中,确定相关基因表达的变化和潜在的相关MeCP2突变和描绘与疾病相关通路的改变,我们评估和比较转录组概要文件在PBMC RTT患者和对照组。

这项工作表明第一次,据我们所知,改变大量的基因的表达可能有助于阐明和解释之间的联系MeCP2和一些分子和细胞方面RTT病人中观察到。在我们先前的研究在RTT,都不能显示噪音水平的提高氧化应激(OS)标记,如isoprostanes (IsoPs)和4-hydroxynonenal蛋白加合物(4-HNE PAs) [22,23),并增加氧化改性蛋白质的泛素化和降解24),但是MeCP2突变能够影响细胞氧化还原平衡和蛋白质周转仍然需要定义。

使用SAM和LIMMA方法,我们定义了一组基因差异表达RTT患者对控制(健康受试者)和一个重要的重叠被发现通过比较两种方法的结果。基于最少1-fold截止电平变化表达导致482个常用管制的基因,而10基因只认为只有山姆和1基因被LIMMA表示。之间共享基因,430显示重大upregulation, 52在RTT相比控制(图表达下调1和补充表1和2)。的11个基因表示只有一个方法被进一步分析。基因与最强的表情的变化,调节(FC≥2)和表达下调(FC≤1.2−),在表中列出2和3,分别。差异表达基因的完整列表,调节和表达下调(FC±1),补充表1和2所示。

很明显从这个第一组数据突变MeCP2影响更多的基因upregulation。差别就对这些这部分符合第一个函数被归因于MeCP2,如基因表达抑制因子(10,11]。此外,它是值得强调,筛选方法用于这项研究(LIMMA和山姆)他们之间几乎重叠使结果更可靠。

接下来,使用大卫数据库,我们执行的重要基因的功能注释和识别它们的生化途径。比较不同监管mRNA转录的RTT PBMC与对照组相比显示了显著的细胞通路的变化。特别是,我们确定了10个主要簇对应于62年生物过程丰富了146个基因(表4)。这些集群突出关键生物学途径与线粒体功能和组织(即有关。,mitochondrial ATP synthesis coupled to electron transport, inner mitochondrial membrane organization such as:ATP5A1,COX6C,ETFA,UQCRQ,TIMM10,TSPO),细胞蛋白质代谢过程(即。,regulation of protein ubiquitination, regulation of ubiquitin-protein ligase activity, and proteasomal ubiquitin-dependent protein catabolic process such asPSMA2,PSMD6,UBE2E3,生),RNA加工(即。,nuclear mRNA splicing and spliceosome assembly and RNA elongation from RNA polymerase II promoter such asRPL15),在染色质DNA组织和细胞大分子复杂装配(即。,核小体组装、DNA包装、和蛋白质等复杂生物起源HIST1H4L,H2AFZ,TOP2A,HMGB2)。

3.2。线粒体相关基因在RTT的病人

在这些集群中,最重要的是监管记录包括编码几个单元相关的线粒体呼吸链复合物,因此线粒体ATP生产和直接,间接地对潜在的活性氧(ROS)生成。特别是,NDUFA1,NDUFAB1,NDUFA2,NDUFB6,线粒体复杂我的所有组件(NADH:泛醌氧化还原酶),显示了更大的改变与FC超过2。此外,其他子单元复杂的我(NDUFV2,NDUFS4,NDUFA9,NDUFS6,NDUFB10,NDUFB4,NDUFC2,NDUFB2,NDUFS5,NDUFC1,NDUFB9,NDUFA8)显然是调节在RTT组。

复杂的我在细胞ATP生产起着至关重要的作用,许多关键过程的主要的能源在活细胞。它将电子从NADH和通过一系列不同蛋白质耦合电子受体泛醌氧化还原中心。因为复杂的我是能源生产的核心单元,据报道,其故障导致广泛的神经肌肉疾病(25]。有些是由于线粒体基因组的突变,但是其他人,这源于复杂的活动减少或增加活性氧的生产,并不清楚。活性氧的生产复杂的我与帕金森病和老化(26,27]这是符合RTT现在良好的文档记录以来增加操作系统在这个病理条件(22,23]。

另一个基因参与复杂的函数NDUFV2显然这也是调节在我们的研究中。这个基因的突变与帕金森症,双相情感障碍和精神分裂症和在一个案例中发现的早发性肥厚性心肌病和脑病;也已被证明NDUFA2蛋白质亚基的疏水部分的复杂。这个基因的突变与利综合征相关,早期出现进行性神经退行性疾病。值得注意的是NDUFAB1,这是一个日益增长的脂肪酸链的载体在线粒体脂肪酸生物合成和脂肪酸水平的改变已经在ASD (28,29日]。

我不仅复杂的子单元在RTT调节,但我们也发现基因的upregulation五电子传递链的复合物。事实上,也SDHB(琥珀酸脱氢酶复合体亚基B,铁硫(Ip))亚基的基因编码线粒体复合体II(琥珀酸:泛醌氧化还原酶)显著调节。这个单元负责将电子从琥珀酸转移到泛醌(辅酶Q)。复杂的呼吸链的二世,这是专门参与琥珀酸的氧化,把电子从FADH公鸡。还值得注意的是,3基因,UQCRQ,UQCRFS1,和UQCRH编码单元的复杂三世(ubiquinol-cytochrome c氧化还原酶),调节平均FC = 1.60。这个复杂的中起关键作用的生化代的ATP,导致代电化学势泛醇的催化电子转移反应细胞色素c加上质子跨膜易位。证据报告,在小鼠模型的一些发起人ubiquinol-cytochrome c还原酶亚基由MECP2蛋白质,能够有针对性的对病理学的发展(30.]。

此外,细胞色素c基因(赛克)与线粒体的基因编码单元复杂IV(细胞色素c氧化酶)(COX14,COX7A2,COX6C,COX7C,COX8A)是调节平均FC 1.5左右。值得注意的是细胞色素c的upregulation基因。编码的蛋白质从细胞色素b和接受电子转移到细胞色素氧化酶复杂。这种蛋白质也参与细胞凋亡的启动,这是符合先前的研究显示可能参与细胞凋亡的RTT [31日,32),尽管只有很少有研究调查RTT和当前文献中细胞凋亡的作用仍有争议。此外,一些第四单元复杂的调节。它接受一个电子从四种细胞色素c分子和转移一个氧气分子,分子氧转化为两个分子的水。在这个过程中,通过一个质子移位,它能够产生ATP。这些数据表明,RTT患者在连续新ATP合成,这可能是一个新的蛋白质合成的结果。

我们的数据与之前的工作由Kriaucionis作者分析了基因在大脑的RTT动物模型30.]。他们已经表明,有几个线粒体异常和upregulation复合物我和第三单元。特别是他们也能够显示upregulation配合物我之间的相关性和三世和动物的症状严重程度显著增加线粒体呼吸能力和减少呼吸效率。与呼吸相关的缺陷似乎是复杂的三世,也是调节在我们的研究中,包含Uqcrc1蛋白质。此外,它已被证明,MeCP2结合Uqcr基因的启动子在活的有机体内这Uqcr mRNA表达升高的大脑Mecp2空的老鼠获得神经症状,这是符合我们的结果。

最后,我们还观察到在RTT PBMC upregulation线粒体复杂的V (ATP合酶)的子单元(ATP5A1,ATP5EP2,ATP5J2,ATP5O)和atp酶抑制因子1基因(ATPIF1)。线粒体膜ATP合酶是能量代谢和细胞命运的主监管机构;因此,misregulation相关基因可以改变ATP生产和细胞代谢。有趣的是,还atp酶抑制因子1 (ATPIF1),抑制线粒体H的活动⁺ATP合酶是调节,这让我们推测存在异常进行新的ATP和抑制其生产之间的循环。此外,最近的发现表明ATPIF1有额外的功能通过促进适应性反应的细胞ROS (33),一个条件(OS)被记录在RTT [22,23]。

同样,其他与ATP合成的基因显示显著的表达变化(例如,CYB5A,CYB561D2,ETFA,LDHB,PDHB,和SURF1)。例如,ETFA(电子转移黄素蛋白α多肽)作为一个特定的电子受体之间的几个线粒体脱氢酶和航天飞机电子主要黄素蛋白脱氢酶和膜结合电子转移黄素蛋白泛醌氧化还原酶。此外,LDHB编码乳酸脱氢酶B,一种酶,这种酶催化乳酸和丙酮酸的可逆转换和NAD和NADH、糖酵解途径,因此与ATP生成。值得注意的是upregulationSURF1(过量1)基因编码一种蛋白质局部内线粒体膜和被认为是参与细胞色素c氧化酶的生物起源复杂。

有关线粒体结构/组织,我们发现7 upregulation移位酶基因(TIMM10,TSPO,TIMM9,TIMM17A,TOMM7,TIMM13,和TIMM8B)参与蛋白导入线粒体(1.34意味着FC)和几个线粒体核糖体蛋白(MRPL13,MRPL20,MRPL21,MRPL33,MRPL51,MRPL52,MRPS25,MRPS30,MRPS33,MRPS36,RPL10A,RPL13,RPL15,RPL22,RPL22L1,RPL26,RPL31,RPL32,RPL39L,RPS10,RPS25,RPS26,RPS26P11,RPS29,RPS5,和RPS7)的意思是FC 1.5。

在一起这些证据似乎表明增加线粒体活动可能与病理表型的观察。无论如何在这个阶段的研究中,它是不可能确定是否增加ATP水平。可以推测,增加线粒体相关基因子单元可以增加细胞的结果要求的能量(ATP)。这个假设符合作者最近研究显示减少大脑鼠标RTT的ATP水平(34]。

最近讨论的一个可能的RTT和线粒体功能障碍之间的关系产生了巨大的兴趣。这些讨论相关的基础部分RTT一方面的共同特性和线粒体功能障碍。感兴趣的是,患者的症状通常与线粒体相关疾病存在突变MeCP2基因(35]。RTT和线粒体紊乱的症状之间的重叠回忆起早期的报告结构异常(36,37电子传递链[]和缺陷37,38在线粒体RTT皮肤和肌肉活检的患者。此外,据报道,大约一半的RTT患者的循环乳酸和丙酮酸水平升高,这可能是由于缺陷在呼吸链的效率和尿素循环复合物,这两个是线粒体39- - - - - -41]。几个障碍相关的大脑线粒体改变的结果合成操作系统和在某些情况下增加细胞凋亡。RTT不是神经退行性疾病(42内河货运),任何贡献的线粒体功能障碍症状可能采取慢性线粒体的形式表现不佳,而不是灾难性的失败导致神经元死亡。

迄今为止,没有系统研究线粒体功能的个人RTT提出了这些发现是否代表了主要或次要效果;也就是说,他们是直接参与RTT还是他们的临床特征反映了这些临床特征对线粒体功能的影响?之前的突变的识别MeCP21999年,一些报告似乎与线粒体结构和功能(36- - - - - -54]。然而,自2001年以来,出版物可能线粒体在RTT的发病机制中的作用已经很少(36,54]。在最近的一次工作,调查人员在澳大利亚报道基因表达的结果死亡的脑组织的RTT和正常对照组55]。一个基因相关的线粒体酶,细胞色素c氧化酶亚基1,降低了表达式在RTT组织提高的可能性损失MeCP2函数可能是负责任的。然而,这是一个主要或次要发现是否仍有待建立和提供了进一步研究的一个重要目标。

总之,虽然线粒体结构和功能异常相关报道,缺乏足够的信息,这样的异常在RTT的精确作用。如上所述,改变线粒体的功能通常是与操作系统和相关,特别是线粒体网站,经常被作为最重要的线粒体超氧化物生产商呼吸配合物我和III (56,57),这可以解释OS RTT病人发现水平增加。

3.3。氧化应激相关基因在RTT的病人

氧化还原的不平衡在RTT upregulations证实的多个基因参与氧化还原内稳态如超氧化物歧化酶1、过氧化氢酶和酶类1 (SOD1,猫,PRDX1),1.6,1.14,和1.12 FC分别。此外,谷胱甘肽S-transferaseω1,微粒体谷胱甘肽S-transferase 2,微粒体谷胱甘肽S-transferase 3 (GSTO1,MGST2,MGST3)也在RTT FC = 2.1。例如,SOD1upregulation会导致别人的过氧化物生产增加了异常激活复杂的我和三世和超氧化物歧化作用的H₂O₂可以解释表达的增加猫和PRDX1。很可能认为,补充抗氧化系统并不足以解渴ROS生产这可以解释高操作系统级别出现在RTT [22,23]。因为这个原因的谷胱甘肽S-transferaseω₁(GSTO1)并不奇怪。这种酶参与的解毒机制通过接合减少谷胱甘肽(GSH) oxidativelly修改蛋白质(羰基和4-HNE PAs)。事实上,GST基因调节,以应对操作系统。此外,我们的结果显示upregulationMGST2和MGST3这是微粒体谷胱甘肽S-transferases;这个数据关联与我们之前的结果很好,RTT病人显示4-HNE水平增加,MGST2也能够与谷胱甘肽共轭4-HNE [58]。我们还观察到mRNA的表达增加酒精脱氢酶5 (ADH5),aldo-keto还原酶家族成员A1 (AKR1A1)和醛脱氢酶1的家庭,成员A1 (ALDH1A1),解毒酶参与脂质过氧化所有产品(59]。

3.4。Ubiquitin-Proteasome RTT患者的相关基因

我们的研究结果也证明upregulation退化和泛素化相关基因的蛋白质。事实上,RTT PBMC微阵列数据显示与蛋白相关基因的表达水平增加营业额,如蛋白酶体亚基编码的基因组成(PSMA2,PSMA3,PSMA5,PSMA7,PSMB1,PSMB10,PSMC5,PSMC6,PSMD6,PSMD9);此外,蛋白酶体成熟蛋白(盛况)、参与蛋白酶体装配和基因调节普遍性的活动连接(RBX1,UFC1,CCNB1IP1,DAXX规范(表)2),建议增加细胞和蛋白质降解过程。这也可能是由于氧化蛋白质和4-HNE PAs的存在。这个证据支持的观察upregulation ubiquitin-conjugating酶E2E3 (UBE2E3FC = 1.19),接受复杂的泛素E1和催化其他蛋白质的共价连接。然而,这是在与一些证据,链接RTT泛素的差别,对这些基因的接合酶(UBE3A)的MeCP2 [60]。整体的效果MeCP2UBE3A监管仍是有争议的。事实上,甚至有一个最近的研究,没有发现任何差异UBE3A表达野生型与突变的RTT鼠标R168X [61年]。一般来说,蛋白质泛素化的水平,是降低改性蛋白质的步骤之一,是增加RTT [24]。

3.5。染色质折叠RTT患者的相关基因

另外几组蛋白相关基因(HIST1H1B,HIST1H2AB,HIST1H2AI,HIST1H2AJ,HIST1H2AL,HIST1H2BB,HIST1H2BH,HIST1H2BM,HIST1H3B,HIST1H3F,HIST1H3I,HIST1H3J,HIST1H4D,HIST1H4F,HIST1H4)下调意味着FC−1.28建议减少生产所必需的蛋白质的DNA染色质组装。

一般来说,组蛋白修饰非常动态,包括乙酰化、甲基化、异构化、磷酸化、泛素化(62年]。这种修改带来巨大变化的组合对环境刺激的细胞信号。很容易理解,修改如组蛋白甲基化可以显示额外的复杂性,因为甲基化的程度是非常变量(mono - di -或trimethylation) (63年]。此外,组合或顺序添加不同的组蛋白标记可以影响染色质组织和随后改变相应的目标基因的表达。

在我们的案例中,一些组蛋白相关基因表达下调,这可以极大地影响基因的表达。例如,组蛋白H1蛋白核小体之间的链接器DNA结合形成大分子结构称为染色质纤维。组蛋白H1是必要的凝结核小体链的高阶结构的纤维。行为也作为管理者通过染色质重塑个体基因的转录,核小体间距和DNA甲基化。我们发现一个下调几个H1子单元从2 - RTT患者的三倍。

3.6。验证选择PBMC qPCR mrna的分析

接下来,我们想确认选定的mrna的微分表达式观察,在个体基础上,由RT-qPCR。六个基因选择基于他们不同的表达模式(3 - 3表达下调)。评估他们的信使rna表达水平RT-qPCR法所得结果准确地反映了微阵列分析(图2),从而证实我们的芯片结果的有效性。三个信使rna编码谷胱甘肽的水平S-transferaseω1 (GSTO1),蛋白酶体(prosome macropain)亚基,βtype-10 (PSMB10)和细胞色素c氧化酶亚基VIIIA (COX8A)由2.5 -调节RTT患者,分别为2 - 2.2倍(图2),非常类似于水平衡量基因阵列。相比之下,组蛋白集群H1b (HIST1H1B),矩阵metallopeptidase 9 (MMP911),ρGTPase激活蛋白b (ARHGAP11B)下调了~50% RTT病人,健康受试者相比(图2),也在这种情况下类似的表达式是由基因阵列检测分析。

3.7。结论

我们的微阵列数据揭示基因表达谱的改变在RTT lymphomonocytes upregulation泛素介导的线粒体生物学和通路相关的基因。特别是,ATP合成过程中相关基因的超表达意味着细胞表现出的趋势改变了能源需求,也许是为了应对活动的增加蛋白质降解。另一方面,应该注意的是,线粒体在调解ROS的产生中扮演重要角色,这些反过来破坏蛋白质,脂类和核酸。移除损坏的分子,在一种恶性循环,增加细胞蛋白水解活动需要一个额外的线粒体ATP生产进一步ROS生成。这张照片是符合我们先前的报道(24),表明RTT患者的氧化还原状态的改变,再加上增加氧化改性蛋白的泛素化和退化(计划1)。

总之,这些发现在RTT转录分析病人RTT表型揭示新的分子机制,表明mitochondrial-ATP-proteosome可能直接行动氧化还原平衡RTT综合症。此外,它证实了一个可能的间接操作系统在发病机制中的作用和发展的障碍。因此,应该考虑RTT mitochondriopathy。

确认

作者感谢基金会蒙特悠久,Associazione Italiana Rett (AIRETT)和托斯卡纳地区(2009年也免不了敬礼,“抗氧化剂(ω3多不饱和脂肪酸,硫辛酸)补充Rett综合症:一种新型治疗方法”),提供部分支持。

补充材料