文摘

丙酮酸乙酯(EP)已经证明对急性脑损伤神经保护作用通过其抗炎作用。核蛋白质高机动组框1 (HMGB1)可以激活炎症通路释放死亡细胞。本研究旨在探讨EP的保护作用与二次脑损伤后大鼠创伤性脑损伤(TBI)。成年雄性老鼠被随机分为三组:(1)假+汽车集团(2)创伤性脑损伤+汽车集团,和(3)创伤性脑损伤+ EP组(每组)。右顶叶皮层挫伤是由使用weight-dropping创伤性脑损伤的方法。在创伤性脑损伤+ EP组,EP是腹腔内接种剂量75毫克/公斤,5分钟1和创伤性脑损伤后6 h。创伤性脑损伤后大脑样本收获24小时。我们发现EP治疗显著抑制HMGB1及TLR4的表达,NF -κB DNA结合活性和炎症介质,如il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6。同时,EP治疗显著改善梁行走性能、脑水肿,皮质凋亡细胞死亡。这些结果表明,EP的保护作用可能由减少HMGB1介导TLR4 / NF -κB-mediated炎症反应在大脑受伤的老鼠。

1。介绍

创伤性脑损伤(TBI)通常会导致毁灭性的神经赤字和残疾(1]。然而,目前缺乏有效的治疗方法,可以改善临床结果。创伤性脑损伤被分为主要的受伤和二次损伤2]。主要的伤害是理解为机械力的结果作用于大脑受伤的。二次损伤是由于复杂的生化和病理生理变化,跟随主的侮辱(3]。的许多病理生理事件这个延迟可能导致受伤,已经提出创伤后炎症和细胞凋亡导致继发性脑损伤,导致神经功能恶化的结果(4,5]。

高机动组框1 (HMGB1)最初被确定为一个dna结合蛋白功能结构代数余子式的关键的转录调控在体细胞6]。可以主动或被动释放HMGB1的坏死细胞非凋亡细胞,然后触发炎症(7,8]。最近,很多证据识别HMGB1作为cytokine-like中介(9,10]。细胞外HMGB1的受体结合先进的糖化终端产品(愤怒)和其他受体,包括TLR2和TLR4 [6,11]。然后这些受体激活一个常见的信号通路激活的高潮核factor-kappa (NF - BκB)转录因子。通常作为一个最重要的下游分子信号通路,NF -κB是一个转录因子基因表达所需的许多炎症介质,如interleukin-1β(il - 1β)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素- 6 (il - 6) [12]。我们以前未发表的数据表明,HMGB1被调节和创伤性脑损伤后重新安置。HMGB1可能意味着一个重要的角色在促进创伤性脑损伤后炎症。

丙酮酸乙酯(EP)是一个稳定、亲脂性的酯来源于内源性代谢物丙酮酸(13]。的差别EP的药理作用包括对这些促炎细胞因子的分泌,改善redox-mediated细胞和组织损伤,抑制细胞凋亡的14]。EP保护各种炎性组织损伤,如致命的败血症和系统性炎症(15),出血性休克16),和中风17]。

一些先前的研究已经表明,治疗解决方案包含EP抑制促炎转录因子的激活,NF -κB,以及多种促炎的蛋白的表达,如肿瘤坏死因子-α,il - 6 (16,18]。最近,EP在脊髓损伤的保护作用和脑外伤已经报道19,20.]。然而直到现在,这仍然是未知的EP能否影响HMGB1 TLR4 / NF -κB通路和生产的创伤性脑损伤后的脑组织炎症因子。和EP是第一个描述药理抑制剂HMGB1分泌(13]。因此,当前研究的目的是确定EP是否可以减弱TBI-induced激活HMGB1 TLR4 / NF -κB信号通路在pericontusion地区。

2。材料和方法

2.1。动物的准备

男性Sprague-Dawley老鼠(250 - 300 g)购买从中国科学院动物中心,上海,中国。老鼠在一个12小时的暗光循环情况下免费的食物和水。协议包括所有外科手术和动物使用被批准的动物保健和使用委员会南京大学和符合指南的护理和使用由美国国立卫生研究院的实验动物。

2.2。试验协议

一个小修改捐助的重锤模型被用来诱导大鼠皮层挫伤创伤模型(21,22]。与戊巴比妥钠腹腔麻醉后(50毫克/公斤,i.p。),老鼠在立体定向固定装置。与碘载体头皮被清理过,手术中使用无菌技术。头皮被割开,5毫米直径骨窗(骨窗的中心是1.5毫米后和2.5毫米侧前囱)钻在右侧顶叶头骨。硬脑膜是暴露并保持完好无损。局灶性脑损伤是引起下降40 g钢拉杆的平端25厘米的高度到活塞(直径4毫米)放在硬脑膜。活塞被允许压缩脑组织最大深度为5毫米。然后头皮缝合。Sham-operated老鼠麻醉和安装在立体定向仪,光靠右顶叶开颅手术准备和没有痛苦的皮层挫伤。在从麻醉中复苏,老鼠被放置在一个温暖的加热垫和覆盖着一块热毛巾。 And then the rats were returned to their cages and the room temperature kept at 23 ± 1°C.

老鼠被随机分配到第二组:(一)创伤性脑损伤+ EP组:大鼠受到创伤性脑损伤和EP管理解决方案(生理盐水溶解在0.9%,10毫克/毫升)在通过腹腔内注射剂量为75毫克/公斤(i.p。) 5分钟,1小时和6小时后创伤性脑损伤(总);(b)创伤性脑损伤组:大鼠受到创伤性脑损伤+政府(i.p)等于体积0.9%的盐溶液(7.5毫升/公斤)没有EP, 5分钟,1小时和6小时后创伤性脑损伤(总);(c)虚假的组:大鼠受到上述手术的组织除了焦脑损伤,这些老鼠管理相同体积的0.9%生理盐水(7.5毫升/公斤)没有EP (i.p管理。5分钟、1小时和6小时后手术)(总)。剂量和时间点选择与小变化根据先前的研究19,23]。

在手术后24小时,beam-walking任务进行测试功能缺陷的老鼠。然后老鼠被一个剂量的麻醉代理。受伤的脑组织周围皮层(图1)的解剖区域小于3毫米的边缘挫伤网站在冰上和存储在液氮立即使用。每组六个老鼠牺牲了西方螺栓和酶联免疫吸附试验(ELISA),六个rt - pcr、6电泳迁移率改变分析(EMSA),六为脑水肿,和其他人是免疫组织化学研究。灌注在免疫组织化学研究中,老鼠transcardially 0.1 mol / L磷酸缓冲盐(PBS、4°C),其次是4%缓冲甲醛;大脑沉浸在一夜之间缓冲甲醛4%然后嵌入石蜡。

2.3。梁行走平衡任务

梁行走平衡任务是用来评估之前运动大鼠创伤性脑损伤后的功能描述(24]。老鼠接受了pretraining木梁的随机化前3天。所有大鼠正常分数(7)手术前。评估了在手术后24小时的牺牲。在培训和测试中,老鼠在一个地方长120厘米,宽2.5厘米,高(50厘米)的木梁,被迫进入一个黑暗的目标框(宽25厘米,长25厘米,25厘米高)。60 W光源的起点定位接近房间里的梁和提供唯一的照明测试会话期间,和白噪声(60 dB)被用来鼓励运动。噪音是动物穿过梁后终止了暗目标框。时间横向梁和进入黑盒也记录下来,和审判结束如果动物没有进入目标在90年代。Beam-walking表现被评为使用级评定量表,类似于先前发表的文章(24,25):(1)老鼠无法将影响后肢梁的水平表面上;(2)它将影响后肢梁和保持平衡的水平表面上但无法遍历梁;(3)大鼠穿越光束拖动影响后肢;(4)遍历梁,一旦地方影响后肢梁的水平表面上;(5)老鼠穿过梁和地方水平上的影响后肢梁表面援助少于一半的步骤;(6)大鼠使用影响后肢援助超过一半的步骤,和河鼠(7)遍历梁不超过2脚滑倒。beam-walking测试是由一个独立的观察者,没有先验知识的实验分组的协议和不知道。

2.4。脑水含量

脑水肿是决定使用wet-dry方法如前所述[26]。短暂,脑组织挫伤皮层立即迅速收获和体重增湿重。烤箱在110°C的样本干24小时,然后再重干重。大脑水水肿由公式:计算比例的大脑水=[(湿重−干重)/湿重)×100%。

2.5。rt - pcr分析

HMGB1的水平和TLR4 mRNA表达通过rt - pcr测定。总RNA提取试剂盒试剂(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)根据制造商的指示。总这个孤立的互补脱氧核糖核酸合成总RNA使用反向转录系统。简单地说,5μ使用0.5 g的总RNA反转录μg益生元(dT) 15 U禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(Biouniquer科技有限公司)。PCR的互补脱氧核糖核酸被放大。正向和反向引物如下:5′-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′, 5′-ATTCATCATCATCATCTTCT-3 HMGB1(646个基点)′,5′-TTGCCTTCATTACAGGGACTT-3′, 5′-CAGAGCGGCTACTCAGAAACT-3 TLR4(179个基点)′,5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′, 5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′β肌动蛋白(375个基点)27,28]。PCR扩增了35 30秒的周期在94°C, 50秒55°C,和50秒72°C,紧随其后的是7分钟的最后一步72°C。PCR检测的产品在2%琼脂糖凝胶电泳NuSieve琼脂糖凝胶(美国FMC)和溴化乙锭染色的可视化。乐队的强度是量化使用ImageJ软件,和每一个基因产物规范化的比率β肌动蛋白产品被认为是每个基因的表达。

2.6。免疫印迹分析

免疫印迹分析,适当的大小组织完全均质和离心机14000 g×15分钟在4°C。上层清液的收集。同等体积的6×SDS缓冲区添加样本,样本然后煮5分钟。样品(50μg每车道)受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳上10% 45分钟在100 V 80 V 100分钟紧随其后,然后转移到硝基1小时在100 V。膜被5%的脱脂牛奶在室温下2小时,培养1小时的anti-HMGB1单克隆抗体(epitomics稀释1:800年,Inc .,伯林盖姆,CA,美国),anti-TLR4多克隆抗体(稀释1:200年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)β肌动蛋白(1:1000稀释,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)作为内部控制。膜清洗后10分钟每六次在PBS +渐变20 (PBST),在适当的孵化HRP-conjugated二级抗体(PBST稀释1:400)为2小时。涂抹蛋白乐队被可视化增强化学发光(ECL)免疫印迹检测试剂(美国Amersham,阿灵顿高地,IL)和暴露在x射线胶片。发达的电影数字化完美使用爱普生2480扫描仪(精工集团、长野、日本)。光学密度得到使用Glyko Bandscan软件(美国Glyko,诺瓦托,CA)。

2.7。核内蛋白提取和EMSA

脑组织的核内蛋白提取和量化如前所述29日]。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸测定工具包bove血清白蛋白作为标准(皮尔斯生化药剂,罗克福德,生病,美国)。EMSA执行使用商业套装(凝胶转变分析系统;麦迪逊,Promega WI)如前所述30.]。共识寡核苷酸探针(5′agt TGA GGG广汽TTT CCCAGG颈- 3′)和[end-labeledγ- - - - - -³²P] atp(免费的生物技术。,Beijing, China) with T4-polynucleotide kinase. Nuclear protein (20 μg)是preincubated总量的20倍μL在绑定缓冲,组成10更易与L Tris-HCl (PH值7.5),1 L MgCl更易₂0.5更易/ L氯化钠,4%的甘油,0.5 L更易与EDTA, 0.5 L更易与德勤,2μ在室温下g保利dI-dC 20分钟。添加后1μl³²P-labled寡核苷酸探针,孵化是在室温下持续了20分钟。后加1μL(凝胶加载缓冲区,反应停止,混合物是通过在nondenaturing 4%聚丙烯酰胺凝胶电泳来解决0.5×此种缓冲(Tris-borate-EDTA) 390 V 1小时在4°C。凝胶干燥,暴露在x射线胶片(日本东京富士Hyperfilm)−70°C的加剧冗长。水平的NF -κB DNA结合活性被计算机辅助光密度分析量化。

2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)

大脑皮层组织均质玻璃均质器1毫升的缓冲区包含1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物,1 mg / L抑肽素,1 mg / L抑肽酶,和1 mg / L亮抑酶肽在磷酸盐溶液pH值(7.2),然后在12000×g离心20分钟在4°C。上层清液的收集,和总蛋白质是由使用bicinchoninic酸测定工具包(美国皮尔斯生化药剂,罗克福德,IL)。大脑组织的炎性细胞因子的水平量化使用指定的ELISA试剂盒鼠(TNF -根据制造商的指令α法国,从Diaclone研究;il - 1β比利时,il - 6从欧洲Biosource SA)和我们实验室之前的研究(31日]。大脑组织中细胞因子的内容表示为pg /毫克的蛋白质。

2.9。免疫组织化学检查和细胞计数

免疫组织化学进行了确定HMGB1及TLR4的免疫反应性。简单地说,组织部分(4μ米)在梯度酒精deparaffinized和水化。然后部分被孵化anti-HMGB1单克隆抗体(epitomics稀释1:500年,Inc .,伯林盖姆,CA,美国)和anti-TLR4多克隆抗体(稀释1:100年,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA,美国)一夜之间在4°C,其次是磷酸盐下半场洗。后部分是孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭免疫球蛋白(稀释1:500年,圣克鲁斯生物技术公司,圣克鲁斯,CA,美国)在室温下为60分钟。3、3′-Diaminobenzidine-H₂O₂解决方案是使用可视化HMGB1和TLR4。这些细胞,HMGB1从细胞核转移到细胞质被视为HMGB1-positive细胞。阳性细胞的识别、统计和分析部分通过病理学家受伤的皮质盲实验组。五个字段在0.5毫米挫伤皮层在每个部分中,每个老鼠大脑的三个部分样本,每组五个老鼠被随机选择和光学显微镜下观察(×400放大)(Eclipse E100、尼康、日本)。然后,HMGB1及TLR4阳性细胞的平均百分比计算每个部分的免疫反应性HMGB1 TLR4在老鼠的大脑。

2.10。TUNEL染色,凋亡细胞的定量

formalin-fixed组织嵌入在石蜡和分段4μ米厚的切片机。的部分是由终端检测到凋亡细胞原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)法。一个原位细胞死亡检测设备舱(ISCDD,勃林格,曼海姆,德国)是根据生产的协议使用的工具包和我们之前的研究29日]。部分是由显微镜观察染色的组织病理学家对实验组蒙蔽。TUNEL-positive截面受伤的皮层的细胞数。脑损伤的程度被凋亡指数评估,TUNEL-positive细胞的平均比例在每个部分计入10皮质微观领域(400×放大)。

2.11。统计分析

EMSA,光密度的量化和分析PCR和免疫印迹乐队与ImageJ软件完成。使用SPSS 16.0统计分析(IL SPSS, Inc .,芝加哥,美国)。所有数据都表示为±SEM。受到单向方差分析后的数据图基的因果检验。统计学意义是接受了。

3所示。结果

3.1。丙酮酸乙酯改善梁行走平衡大鼠创伤性脑损伤后的性能

所有大鼠手术前7的成绩。如图2老鼠在虚假的集团仍有许多7 sham-operation在24小时后。与假组相比,运动机能障碍引起的创伤性脑损伤是严重创伤性脑损伤组()。然而,EP治疗显著提高梁行走平衡性能的大鼠创伤性脑损伤后24小时()(图2)。(,每组;* * P与假组相比,^#P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.2。创伤性脑损伤后EP改善脑水肿

脑含水量平均约78.9%的骗局。虚假的组相比,脑含水量的显著增加周围组织中检测出大脑皮层受伤24小时后创伤性脑损伤()。然而,受伤的大脑的脑含水量下降了EP政府与创伤性脑损伤组()(图3)。这些结果表明,丙酮酸乙酯可以减弱老鼠脑水肿治疗创伤性脑损伤。(,每组;* * P与假组相比,^#P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.3。EP HMGB1的mRNA表达的影响和TLR4在创伤性脑损伤后的大脑

HMGB1及TLR4 mrna表达在低水平的老鼠大脑中虚假的组。HMGB1的mRNA表达TLR4在周围皮层挫伤核心在创伤性脑损伤后显著增加而虚假的集团()。但在EP组HMGB1的水平和TLR4 mRNA在受伤的皮层与创伤性脑损伤组相比均有显著降低()(图4)。(,每组;* P,* * P与假组相比,^#P,^{# #}P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.4。EP对HMGB1的影响和TLR4在大脑受伤的蛋白表达

确定EP对HMGB1的影响和TLR4表达大脑受伤后创伤性脑损伤,免疫印迹检测执行HMGB1的变化和TLR4蛋白质中描述的材料和方法。免疫印迹显示低水平的HMGB1和虚假的TLR4蛋白质组(图5)。但HMGB1的蛋白质含量和TLR4显著增加周围组织受伤皮层24 h后创伤性脑损伤与虚假的集团()(图5)。EP政府后,HMGB1含量的增加和TLR4在创伤性脑损伤显著抑制+ EP组()(图5)。(,每组;* P,* * P与假组相比,^#P,^{# #}P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.5。EP政府抑制NF -κ创伤性脑损伤后B DNA结合活性

NF -κB DNA结合活性受伤的脑组织被EMSA放射自显影法评估。如图6上面板,NF -低κB绑定活动(弱EMSA放射自显影法)被发现虚假的组。但与虚假的组相比,NF -κB绑定活动在创伤性脑损伤组显著增加()。后管理三个剂量的EP老鼠遭受了创伤性脑损伤,NF -κB绑定活动显著下调受伤皮层(周围的脑组织)(图6较低的面板)。(,每组;* * P与假组相比,^{# #}P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.6。丙酮酸乙酯减毒的生产管理促炎细胞因子在创伤性脑损伤后受伤的大脑

如图7,il - 1的浓度β肿瘤坏死因子-α和il - 6在老鼠的大脑虚假的低水平组。但遭受创伤性脑损伤后,这三种细胞因子的水平都大大增加。和EP治疗创伤性脑损伤后大鼠明显降低il - 1的生产β肿瘤坏死因子-α,il - 6在受伤的大脑。(,每组;* P,* * P与假组相比,^#P,^{# #}P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.7。EP治疗后大鼠创伤性脑损伤的抑制HMGB1的百分比和TLR4阳性细胞在大脑受伤

免疫组织化学进行了调查HMGB1的定位和表达和TLR4在老鼠大脑。这些脑细胞HMGB1从细胞核转移到细胞质被视为HMGB1-positive细胞。一些HMGB1和TLR4-positicve细胞中观察到虚假的组。HMGB1增加和TLR4-positive细胞在创伤性脑损伤组(图8(一个))。然而,EP治疗大鼠显著降低HMGB1和TLR4的表达。箭头表示HMGB1 TLR4-positive细胞周围地区的皮层受伤后创伤性脑损伤(图8(一个))。半定量的分析和免疫印迹分析免疫组织化学显示相同的结果。在创伤性脑损伤组,HMGB1的百分比和TLR4阳性细胞显著增加的价格相比虚假的集团()。在创伤性脑损伤+ EP组,与创伤性脑损伤组相比,HMGB1和TLR4阳性细胞百分比显著下降()(图8 (b))。这些结果表明,EP可以显著降低HMGB1和创伤性脑损伤后TLR4在大脑受伤的免疫反应性。(,每组;* * P与假组相比,^{# #}P相比之下,创伤性脑损伤组)。

3.8。在大脑受伤的EP政府抑制皮质细胞凋亡

几个TUNEL-positive凋亡细胞的老鼠的大脑中发现了虚假的操作(图组9(一个))。创伤性脑损伤组,凋亡指数在周围的皮质皮层受伤与虚假的集团(相比显著增加)(数据9 (b)和9 (d))。创伤性脑损伤+ EP组和创伤性脑损伤组相比,研究皮层的凋亡指数显著下降()(数据9 (c)和9 (d))。这一结果表明,EP治疗创伤性脑损伤后会抑制细胞死亡在周围的皮质皮层受伤(图9)。(,每组;* * P与假组相比,^#P相比之下,创伤性脑损伤组)。

4所示。讨论

有大量的证据表明,炎症在创伤性脑损伤的病理生理学中起着重要的作用。创伤性脑损伤启动炎症反应通过破坏血脑屏障,创建水肿和炎症细胞的渗透32]。临床缺乏有效的治疗。因此,它是一个重要的需要开发新的药物治疗创伤性脑损伤的治疗通过抑制炎症反应。

丙酮酸乙酯已被证明对cytoprotective行为和抗炎作用通过抑制多种促炎介导的表达以及HMGB1在几个在体外和在活的有机体内模型(14,15]。最近,EP报道提供对脑缺血神经保护作用[17),脊髓损伤(19),和创伤性脑损伤20.]。

在目前的研究中,我们表明,丙酮酸乙酯在创伤性脑损伤的老鼠weight-dropping模型施加有益的影响。结果表明,创伤性脑损伤导致脑水肿,凋亡细胞死亡,和运动功能缺陷。同时,创伤性脑损伤引起的炎症反应在大脑组织,以提高NF -κB激活,促炎介导的诱导表达,如il - 1β肿瘤坏死因子-α,il - 6。同时,HMGB1的表达式和TLR4在创伤性脑损伤后调节异常。此外,我们的研究结果表明,EP政府减少(1)脑水肿,(2)HMGB1及TLR4的mRNA和蛋白表达,(3)NF -κB DNA结合活性,(4)促炎细胞因子表达,(5)抑制HMGB1易位,抑制凋亡细胞死亡(6),(7)改善梁行走平衡在老鼠遭受了创伤性脑损伤的表现。所有这些支持的观点EP减少某种程度的创伤性脑损伤后继发炎症和改善运动功能恢复。据我们所知,这些研究结果首次证明EP可能减弱TBI-induced HMGB1 TLR4 / NF -κB信号通路激活可能施加的发展在大鼠创伤性脑损伤后继发性脑损伤。

HMGB1非组蛋白的核蛋白质具有双重功能。在细胞内部,HMGB1与DNA结合,在转录调控过程中发挥作用。在细胞外,HMGB1作为cytokine-like中介的炎症(6]。HMGB1可以主动或被动释放细胞坏死或死亡(7]。这两种机制可以产生大量的细胞外HMGB1的释放。HMGB1可以绑定到细胞表面,通过受体信号包括愤怒(受体对先进的糖化结束产品),TLR2和TLR4在被释放到细胞外环境(6,11]。然后,这些受体导致激活NF -κB信号并最终促进许多细胞因子的生产,如肿瘤坏死因子-α、il - 6和正-γ(6,33]。事实上,以前的研究在我们的实验室证明TLR2和TLR4受体和NF -κB信号通路发挥重要作用在创伤性脑损伤的炎症反应22,27,34]。但校长通常配体在创伤性脑损伤后大脑仍然未知。我们目前的研究表明,HMGB1信使rna和蛋白质的表达显著增加(数据4(一)和5(一个)),从细胞核转移到细胞质24 h后创伤性脑损伤(图8(一个))。这些结果表明,HMGB1参与了创伤性脑损伤的炎性应激反应。HMGB1可能充当TLR4的配体,通过TLR4 / NF -信号κB通路调节创伤性脑损伤后的促炎细胞因子的生产。

HMGB1被视为破坏准分子模式之一(抑制)参与许多无菌炎症疾病,缺血再灌注损伤和关闭等创伤(8,35]。此外,HMGB1被报道相关调节实验性脊髓损伤后神经细胞凋亡(36]。从目前的研究也获得了类似的调查结果。治疗Anti-HMGB1抗体或其他HMGB1抑制剂如EP是有益的在许多临床前炎性疾病模型37,38]。EP是第一个描述药理抑制剂HMGB1的分泌。此外,在这项研究中,我们表明,EP治疗显著地抑制HMGB1表达和细胞质易位(数字4(一),5(一个),8)。与此同时,相同的结果之前的研究(22,27),我们表明,TLR4 NF -κB绑定激活,促炎的介导,如il - 1β肿瘤坏死因子-α创伤性脑损伤后,il - 6显著调节(数字4- - - - - -8)。EP治疗受伤的老鼠可以深刻地抑制TLR4的表达和NF -κB DNA结合的激活,以及多种促炎的蛋白的表达,如il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和炎症介导。最近,莫罗和萨顿(20.)报道,EP或丙酮酸治疗显著提高梁的复苏走路,神经分数,和皮层挫伤损伤后海马神经元的损失。他们进一步表明,EP的显著的神经保护是伴随着抑制小胶质细胞激活和促炎细胞因子,改善新陈代谢。我们的结果进一步表明,EP政府创伤性脑损伤后可以减少凋亡细胞死亡受伤的皮层(图9)和脑水肿(图3)和改善运动功能恢复(图2)。总之,这些结果表明,抑制HMGB1 / TLR4 / NF -κB途径激活的EP导致更少的细胞凋亡和更好的功能恢复。

我们的研究有一些局限性。首先,我们开始治疗EP在创伤性脑损伤后5分钟。EP治疗不太可能会在这个时间点在临床实践中,这可能会限制EP的临床使用。但是,先前的研究表明,EP抑制脑缺血性损伤的治疗卒中后窗口直到24小时(17]。在进一步的研究中,我们将探索更实用和有效的治疗窗的EP在大鼠创伤性脑损伤模型。其次,我们使用单一EP浓度为75毫克/公斤。在未来的研究中,多个EP浓度应该评估来确定最合适的EP浓度最大在大鼠创伤性脑损伤后神经保护。第三,先前的研究表明,丙酮酸钠(SP)和EP在皮层挫伤损伤大鼠模型神经保护作用[20.]。但是,我们没有研究SP的保护作用在我们目前的研究。我们将进一步确认是否SP具有相同的保护机制EP和SP的有利影响与EP在创伤性脑损伤模型进行比较。

总之,我们的数据显示的影响在HMGB1 / TLR4 / NF - EPκ创伤性脑损伤后B通路在大脑受伤的。我们发现创伤性脑损伤可能引起HMGB1及TLR4的表达,下游因子(il - 1β肿瘤坏死因子-α和il - 6)和NF -增加κB DNA结合受伤的大脑的活动,它可以显著抑制EP治疗。这些结果表明,创伤性脑损伤诱导激活HMGB1 TLR4 / NF -κ受伤的老鼠大脑中B信号通路可能发挥核心作用的炎症反应可能导致创伤性脑损伤后继发损坏。抑制HMGB1分泌或释放表明小说和有前途的创伤性脑损伤的治疗策略。在weight-dropping EP治疗创伤性脑损伤大鼠的神经保护效应模型可能与抑制HMGB1 TLR4 / NF -κB途径激活。进一步研究EP在创伤性脑损伤的影响可能为创伤性脑损伤的治疗提供一个新颖的治疗剂。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。81070974)和江苏省重点学科(没有。X4200722)。作者要感谢Gengbao冯博士的技术援助。