文摘

白介素(IL)升高1滑液的浓度与关节骨和软骨的破坏。以前,我们表明,il - 1刺激前列腺素(PG)受体的表达EP4通过增加生产。然而,il - 1的影响通过破骨细胞形成软骨细胞尚不清楚。因此,我们研究了il - 1的影响和/或塞来昔布对巨噬细胞集落刺激因子(csf)的表达受体激活剂NF -B配体(RANKL), osteoprotegerin人类软骨细胞(功能),和il - 1的间接影响在osteoclast-like使用RAW264.7细胞形成细胞。功能与il - 1和RANKL表达增加;而csf表达减少。塞来昔布挡住了il - 1的刺激效应。条件培养基从il - 1治疗软骨细胞减少陷阱在RAW264.7细胞染色。这些结果表明,il - 1抑制osteoclast-like细胞的形成通过增加功能生产和减少软骨细胞- csf生产功能和生产可能会增加通过自分泌机制涉及celecoxib-related后卫。

1。介绍

关节骨重建涉及骨基质的合成成骨细胞和成熟破骨细胞的吸收。许多细胞因子和因素,如白介素(IL) 1、巨噬细胞集落刺激因子(csf)和NF -受体激活κB(排名)配体(RANKL),众所周知,诱导单核细胞/巨噬细胞的分化为破骨细胞;而osteoprotegerin(功能),可溶性诱饵受体的RANKL与军衔RANKL绑定,众所周知,抑制分化(1,2]。在成骨细胞RANKL表达高度/基质细胞,软骨间叶原基周围的原始间充质细胞,肥大软骨细胞(3]。csf和功能是生产和发布的激活成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞(2,4- - - - - -6]。

il - 1在放大和延续炎症中扮演关键角色7),骨和关节软骨的退化(8]。两个已确定il - 1亚型:il - 1和il - 1。滑液中il - 1的浓度升高已经涉及到关节骨和/或软骨破坏(9]。此外,il - 1与csf的表达密切相关,RANKL和成骨细胞和软骨细胞的功能。il - 1增加RANKL表达成骨细胞和软骨细胞1,10]。在成骨细胞il - 1刺激促使csf生产(2];而il - 1 - csf表达在软骨细胞的影响尚不清楚。冲突的结果已报告关于功能表达il - 1的影响,主要可能因为不同的细胞用于每项研究[1,2,5]。

我们假定一个骨骼和软骨的新陈代谢不平衡状况负责颞下颌关节的关节(颞下颌关节)。颞下颌关节的关节是伴随症状如疼痛和关节声音在下颌运动(11),结果一个失衡主要chondrocyte-controlled合成代谢和分解代谢的过程。它的特点是组件的逐步退化的关节软骨细胞外基质和与炎症有关的因素12- - - - - -14]。几项研究[15- - - - - -18发现高浓度的细胞因子il - 1在从颞下颌关节骨关节炎患者滑液样本,和il - 1的浓度升高在滑液与关节软骨的破坏。由于这些原因,我们试图澄清il - 1的影响对软骨细胞的功能。

以前,我们表明,il - 1抑制软骨基质蛋白的表达通过抑制骨形成蛋白(BMP)的自分泌作用2使用人类软骨肉瘤细胞株,OUMS-27 [19]。我们还表明,il - 1刺激软骨矩阵营业额主要通过增加矩阵metalloproteinase-13生产在人类软骨细胞(20.]。此外,il - 1促进软骨基质的失衡营业额通过增加炎症细胞因子的生产在人类软骨细胞(21]。相比之下,il - 6和可溶性白介素受体似乎抑制软骨细胞的分化和诱导滑动关节的软骨的修复软骨基质蛋白的表达增加,骨形成蛋白(BMP) 7日在人类软骨细胞和骨形态发生蛋白受体(22]。此外,我们最近报道说,il - 1增加前列腺素E的生产₂(铂族元素₂),cyclooxygenase-2 (cox - 2)和前列腺素受体EP4人类软骨细胞,这表明il - 1可以促进EP4增加铂族元素的表达吗₂生产在软骨细胞(23]。

然而,il - 1的影响在破骨细胞的形成通过软骨细胞仍不清楚。出于这个原因,我们检查了il - 1的影响和特定的cox - 2抑制剂塞来昔布(24,25],csf的表达,RANKL和人类软骨细胞功能,il - 1的间接影响osteoclast-like细胞使用RAW264.7细胞形成的破骨细胞前体。

2。材料和方法实时PCR

软骨细胞在DMEM培养含有10% (v / v)的边后卫0,10或100 U /毫升il - 1β,有或没有1米塞来昔布28天。细胞总RNA分离出1天,7、14、21日和28日使用一个RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。使用人类的mRNA水平正常化β肌动蛋白竞争PCR试剂盒(豆类生物、志贺、日本)。信使RNA是转化为互补使用RNA PCR试剂盒(GeneAmp;优秀的,Branchburg,新泽西,美国)。

互补脱氧核糖核酸混合物被稀释1:5在无菌蒸馏水,和2 -L整除受到实时PCR使用SYBR绿色染料(BioWhittaker分子应用,大我,美国)在25 -l反应包含1×R-PCR缓冲区,1.5毫米核苷酸混合物,1×SYBR绿色我MgCl 15毫米₂0.25 U Taq交货(R-PCR版本;豆类生物),0.2引物(感觉和反义),如表所示1。使用Primer3 PCR引物设计软件(怀特黑德生物医学研究所,剑桥,妈,美国)。PCR是使用智能循环II执行系统(美国造父变星,桑尼维尔CA) 45的循环5 s和CC 10 s;最后的测量C退火步骤。数据分析使用智能周期计软件(版本2.0 d)。所有实时PCR实验一式四份。基因表达是规范化的计算值的水平glyceraldehyde-3phosphate脱氢酶(GAPDH) mRNA在同一时间点。

2.1。软骨细胞细胞培养

软骨细胞来源于正常人股骨软骨细胞获得应用程序(美国圣地亚哥,CA)。这些细胞被维护在杜尔贝科修改鹰的媒介/营养混合物F-12 (DMEM;Gibco BRL,美国马里兰州罗克维尔市)含有10% (v / v)胎牛血清(的边后卫;HyClone实验室、洛根、UT、美国),1% (v / v) insulin-transferrin-selenium-X补充(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和1% (v / v) penicillin-streptomycin解决方案(σ化学,圣路易斯,密苏里州,美国)C在湿润的气氛中低于5%的有限公司₂。

治疗与il - 1(Genzyme / Techne,明尼阿波利斯,美国),细胞被播种到100毫米的组织培养密度5×10菜⁶细胞/厘米²。隔夜孵化后,细胞在DMEM培养长达28天含有10% (v / v)或2% (v / v)和0的边后卫,10或100 U /毫升il - 1,有或没有1米塞来昔布(阿斯特拉制药、东京、日本)。一个单位(U) il - 1对应单位的活动比色与CTLL-2细胞MTT试验(26]。的il - 1浓度是相同的使用在我们先前的研究[19- - - - - -21,23),类似发现在炎症性颞下颌关节滑液(15]。本研究中使用的塞来昔布的浓度决定报告的基础上Itthipanichpong et al。25),检查了血液水平注入塞来昔布后,和我们之前的研究中,发现il - 1增加了铂族元素的生产₂、cox - 2和EP4受体在相同的软骨细胞,是研究[23]。塞来昔布专门抑制cox - 2 (24,25]。我们已经证实,1米塞来昔布挡住了铂族元素₂产量在100年通过抑制cox - 2 U /毫升il - 1β刺激软骨细胞(23]。

2.2。酶联免疫吸附试验(ELISA)

软骨细胞在DMEM培养含有10% (v / v)的边后卫0,10或100 U /毫升il - 1β21、28天。培养基是改为DMEM含有2% (v / v)的边后卫0,10或100 U /毫升il - 1β,然后细胞培养24小时C在湿润的气氛中低于5%的有限公司₂。

的水平- csf, RANKL和功能蛋白质的培养基测定使用商用酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。每个标本化验进行了一式三份和数据被转换为pg / mL或ng / mL。

2.3。Tartrate-Resistant酸性磷酸酶染色的破骨细胞前体(陷阱)

细胞在DMEM培养含有10% (v / v)的边后卫有或没有100 U /毫升il - 1β7、28天。培养基是改为DMEM含有2% (v / v)的边后卫没有il - 1β,这些细胞被孵化C在湿润的气氛中低于5%的有限公司₂。24小时后的培养基收集和稀释同等体积的DMEM含有2% (v / v)的边后卫,补充了50 ng / mL可溶性RANKL (Wako纯化学、日本大阪),然后作为条件培养基。RANKL浓度相当于使用,用于研究酶的表达与骨吸收RAW264.7细胞(27]。

对破骨细胞的分化,我们使用了小鼠单核细胞/巨噬细胞细胞系,RAW264.7(日本制药、日本大阪)。RAW264.7细胞被镀成96 -文化板块(6×10³细胞/厘米²),在条件培养基培养7天。与两种类型的细胞培养条件培养液(IL-1-untreated和治疗软骨细胞生长条件)是固定和染色使用陷阱和碱性磷酸酶double-staining工具包(豆类Bio)根据制造商的协议(287天的文化。TRAP-positive多核的细胞有超过三个核被认为是osteoclast-like细胞,和数据转换成的百分比TRAP-positive多核的细胞总数的细胞。

2.4。统计分析

所有的实验进行了一式三份或一式四份。值所代表的意思标准偏差(SD)。使用学生的显著差异被发现t以及与Bonferroni调整或方差分析(方差分析)值<。05年被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。在软骨细胞RANKL基因和蛋白质表达

在缺乏il - 1β基因表达是不变的文化从第一天到21岁。在il - 1的存在β相比,基因表达显著增加(图控制在每一个时间点1(一))。

与基因表达的结果一致,RANKL蛋白表达明显高于在il - 1的存在β比未经处理的控制细胞在天21日和28(图1 (b))。

3.2。在软骨细胞- csf基因和蛋白质表达

尽管总体下降趋势,csf基因表达il - 1一直较低β治疗细胞比未经处理的控制文化(图5天后2(一个))。

与基因表达研究中获得的结果一致,csf蛋白表达显著低于il - 1的存在β比未经处理的控制细胞在天21日和28(图2 (b))。

3.3。在软骨细胞功能基因和蛋白质表达

在缺乏il - 1β功能,基因表达逐渐下降超过28天。在il - 1的存在β功能,mRNA表达显著高于控制细胞在每一个时间点(图3(一个))。

与基因表达研究中获得的结果一致,功能蛋白表达明显高于在il - 1的存在β比未经处理的控制细胞在天21日和28(图3 (b))。

3.4。il - 1的影响β和塞来昔布在RANKL、csf和功能基因的表达

在缺乏il - 1β,RANKL、csf和功能基因表达被塞来昔布的存在影响。然而,塞来昔布抑制IL -的存在β全身的功能增加RANKL和mRNA表达控制水平。相比之下,塞来昔布不影响il - 1β全身的csf基因表达上的天测试(图4)。

3.5。陷阱Osteoclast-Like细胞的染色

il - 1的间接影响βosteoclast-like细胞的形成是使用陷阱染色检查,破骨细胞的分化标记。在这个实验中,细胞培养与可溶性RANKL和条件培养基从100 U /毫升il - 1β治疗或治疗软骨细胞7或28天。许多TRAP-positive多核的细胞观察与媒介文化后il - 1β未经处理的软骨细胞细胞培养相比,il - 1的媒介β治疗软骨细胞(图5)。TRAP-positive多核细胞的数量明显降低,当介质与il - 1是由软骨细胞培养的条件β(图6)。此外,il - 1的比例β处理/控制几乎是相同的在7天、28天的文化:文化的比例在7天、28天的0.100和0.098,分别。

4所示。讨论

细胞因子在炎症和感染的网站可以发布改变软骨的正常流程周转,导致其病理破坏或形成(29日),和炎性细胞因子的水平高于正常患者的颞下颌关节关节滑液的(30.,31日]。il - 1β在滑液不仅起着核心作用在软骨损伤的病理生理学和退化,但也与颞下颌关节疼痛和痛觉过敏有关。

最近,我们表明,il - 1β增加了铂族元素的生产₂、cox - 2和PG受体EP4人类软骨细胞,这表明il - 1β通过自分泌机制促进EP4的表达涉及提高铂族元素₂生产在软骨细胞(23]。根据这一发现,我们假设il - 1β促进骨骼和软骨的不平衡矩阵营业额包括铂族元素通过自分泌机制₂由软骨细胞。因此,我们专注于破骨细胞的形成通过等级/ RANKL /功能系统之间通信的破骨细胞前体和软骨细胞。本研究进行了澄清il - 1的影响β和/或塞来昔布,特定的cox - 2抑制剂(24,25],csf的表达,RANKL和人类软骨细胞功能,il - 1的间接影响βosteoclast-like细胞使用RAW264.7细胞形成的破骨细胞前体。在这项研究中使用的软骨细胞强烈表达II型胶原蛋白和aggrecan,即共同的表型表达的增殖软骨细胞和肥厚性软骨细胞;X型胶原蛋白的表达,而表达的表型的肥厚性软骨细胞,很低的细胞(数据未显示)。因此,我们认为本研究中使用的软骨细胞增殖软骨细胞。

在设计这些实验,我们首先确定一个适当的文化段长度。在许多先前的研究- csf, RANKL和软骨细胞功能表达,文化时期短暂(24小时;(4,5,32- - - - - -34])。然而,由于颞下颌关节的关节通常展品慢性进展,我们审查了软骨细胞的基因和蛋白质表达更长的文化时期的28天。的il - 1β当前研究中使用浓度是相同的那些用于我们的先前的研究[20.,21,23]。塞来昔布的浓度是相同的,以往的研究中使用的23,25]。

在这项研究中,RANKL和功能表达显著增加与il - 1细胞培养β,而csf表达减少。此外,功能蛋白质水平显著高于RANKL的细胞。鉴于排名的重要作用,RANKL和功能在骨代谢和免疫功能,有人建议等级/ RANKL /功能系统和细胞因子共同努力,可能导致骨吸收功能通过调节RANKL /比率(35]。功能等级、RANKL和mRNA表达在软骨和骨骼(1,4]。Deschner et al。33)报道,fibrochondrocytes持续低水平的RANKL表达,但高水平的功能;作者报道,il - 1β调节RANKL的表达和合成;而4和24小时后功能表达的影响。小室等。4)报道,在软骨细胞功能表达增加对il - 1的回应β刺激24 h。在成骨细胞RANKL表达增加与il - 1刺激后,il - 6, IL-11 [1];而功能表达下降(1,10]。另一方面,csf表达成骨细胞与il - 1刺激后增加(10];而il - 1的影响α在软骨细胞- csf表达还不清楚。在这项研究中,RANKL的表达模式,csf,软骨细胞功能的改变没有il - 1β刺激;在长期的文化。此外,我们检查RANKL的表达,功能- csf,后长期文化没有il - 1β其次是短期il - 1β刺激。因此,与il - 1功能和RANKL表达增加β刺激,而csf表达下降(数据没有显示)。我们认为,这种改变与细胞分化有关。以前,我们表明,在相同的软骨细胞碱性磷酸酶活动逐渐增加从7天到28没有il - 1的文化β刺激或il - 6 (20.,22),活动明显减少文化与il - 1的第十天β刺激与控制(20.]。另外,X型胶原蛋白的表达在相同的软骨细胞逐渐增加从14天没有il - 1的文化β、21天、28天的表达显著降低文化与il - 1β刺激与控制(数据未显示)。这些结果表明,增殖软骨细胞逐渐分化成肥厚性软骨细胞在长期的文化。因此,我们的研究结果表明,il - 1β不仅影响RANKL的表达、csf和软骨细胞的功能,但也可能影响细胞分化的过程。此外,il - 1βRANKL的表达表现出同样的效果,csf,功能和任何文化段,而控制改变了长期的文化价值。因此,这些先前的研究表明,il - 1的影响在成骨细胞和软骨细胞RANKL的表达是一样的;而在功能和csf表达il - 1的影响根据不同细胞类型和il - 1亚型。我们将研究il - 1的效果的原因β表达不同- csf成骨细胞和软骨细胞在未来。

澄清铂族元素的间接参与₂在RANKL的表达、功能和csf在软骨细胞,我们检查了il - 1的影响β在培养细胞和/或塞来昔布。根据我们的结果,塞来昔布,特定的cox - 2抑制剂(24,25),阻止il - 1的刺激效果β在功能和RANKL的表达;而这并不影响il - 1β介导的减少- csf表达。以前,我们发现il - 1β通过自分泌刺激EP4受体的表达机制涉及铂族元素₂生产在人类软骨细胞(23]。本研究的结果也表明,il - 1β诱发功能和RANKL的表达在人类软骨细胞通过自分泌机制,提高铂族元素₂生产。坂田et al。5报道称,il - 1β全身的功能水平增加人类牙周韧带细胞抑制通过铂族元素的从头合成₂。相比之下,黑人et al。36)报道,基线水平的RANKL和功能表达cox - 2基因敲除比野生型成骨细胞成骨细胞减少。考虑到我们的研究结果,这些研究结果表明,铂族元素的影响₂根据细胞类型功能表达上可能有所不同。

田边et al。2)报道,条件培养基包含csf和铂族元素₂产生的il - 1α对成骨细胞和可溶性RANKL增加陷阱在RAW264.7细胞染色。因此,我们使用人类软骨细胞进行了类似的实验。根据我们的结果,从il - 1条件培养基β治疗软骨细胞减少陷阱在RAW264.7细胞染色。这些结果表明,il - 1的功能分化的RAW264.7细胞通过等级/ RANKL /功能系统可能在不同的成骨细胞和软骨细胞。

总之,我们的研究结果表明,il - 1β抑制osteoclast-like细胞的形成功能通过增加生产和减少- csf生产,至少在某种程度上,在人类软骨细胞在这项研究中,使用功能,生产可能会增加通过自分泌机制涉及celecoxib-related后卫。进一步加强这一结论,有必要使用各种软骨细胞进行类似的实验,比如建立软骨细胞细胞系,在未来或其他临床标本。

确认

本研究支持科学研究补助金(C)和年轻科学家的补助金(B)从日本促进社会科学(19592182和19592182,分别地。),和一个日本大学科研资助助理和年轻研究人员(2008)。本研究也支持通过特殊研究资助的高等教育的发展促进和互助公司日本私立学校(2008年),和日本大学牙科学院的佐藤基金(2008)。