中断Nrf2增强Upregulation核因子-B活性、促炎细胞因子和细胞间粘附Molecule-1创伤性脑损伤后在大脑中

文摘

炎症反应中起着重要的作用在创伤性脑损伤后继发性脑损伤的发病机制(创伤性脑损伤)。核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)是一个关键的转录因子在cytoprotection炎症中扮演着关键角色。本研究调查的作用的脑upregulation Nrf2 NF -B活性、促炎细胞因子和创伤性脑损伤后ICAM-1。野生型Nrf2(+ / +)和Nrf2(−−)缺陷小鼠受到适度头部受伤严重的重锤的影响。电泳迁移率改变分析(emsa)进行分析核转录因子的激活(NF -κBB)。酶联免疫吸附分析进行量化生产的肿瘤坏死因子-(肿瘤坏死因子-),interleukin-1(il - 1)和白细胞介素- 6 (il - 6)。免疫组织化学染色实验检测细胞间粘附的表达molecule-1 (ICAM-1)。Nrf2(−−)老鼠有更多NF -B激活炎性细胞因子TNF -,il - 1和il - 6生产,ICAM-1表达式在创伤性脑损伤后大脑与野生型相比Nrf2 (+ / +)。结果表明,Nrf2起着重要的保护作用,限制了脑upregulation NF -B活性、促炎细胞因子和创伤性脑损伤后ICAM-1。

1。介绍

大脑炎症的发病机制中发挥着重要作用二次脑损伤后创伤性脑损伤(TBI) (1,2]。促炎核转录因子(NF -κBκB)信号通路在以前的研究中已经被很好地记录下来了我们实验室的3,4]。水平的提高与大脑受伤的炎性因子,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)和细胞间粘附分子1 (ICAM-1),被认为有助于脑损伤(5]。他们的中介NF -κB的转录激活增强促炎细胞因子(6),已知细胞因子激活NF -κB (7]。积极的反馈被认为用来放大炎症信号和创伤性脑损伤后加重脑损伤。

最近的研究表明,核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2),一个关键的转录因子调节细胞抗氧化反应,发挥更广泛的作用在调节急性炎症反应8,9]。在基础条件下,Nrf2隐藏在细胞质的胞质监管Keap1的蛋白质。在氧化条件或异型生物质压力,Nrf2把从细胞质到细胞核,并绑定到一个启动子序列顺序称为抗氧化反应元素(是),导致cytoprotective响应的特点是upregulation抗氧化酶和敏感性降低氧化损伤(10- - - - - -12]。这些抗氧化酶也可以保护细胞免受急性炎症反应(13]。

大量研究报道,Nrf2在抗击炎症中扮演着一个关键的角色在不同的实验模型。Nrf2防止allergen-mediated气道炎症(14),香烟烟雾诱发肺气肿(15),葡聚糖硫酸酯钠(DSS)介导结肠炎(16],inflammation-mediated结肠肿瘤发生[17在皮肤伤口愈合,炎症反应(18]。此外,Nrf2也被报告为一个至关重要的监管机构的先天免疫反应和生存在实验脓毒症(19]。在我们先前的研究中,我们已经表明,创伤性脑损伤可能引起Nrf2-ARE途径激活的大脑(20.]。

因此,它可能是合理的假定Nrf2扮演着一个重要的角色在限制大脑创伤性脑损伤后炎症反应。在我们的研究中,我们评估的影响Nrf2基因型的脑upregulation NF -κB活性、促炎细胞因子和创伤性脑损伤后ICAM-1。

2。材料和方法

2.1。动物

我们的实验是符合指南的护理和使用从美国国立卫生研究院的实验动物,动物保健和使用委员会批准的南京大学。育种对Nrf2-deficient ICR小鼠请由托马斯·w·Kensler博士(美国马里兰州巴尔的摩约翰斯·霍普金斯大学)。纯合子的野生型Nrf2(+ / +)和Nrf2(−−)缺陷小鼠产生近交杂合的Nrf2(+ /−)老鼠10]。Nrf2基因型(+ / +)和Nrf2(−−)小鼠经PCR扩增基因组DNA孤立的血液。PCR扩增是由使用三种不同的引物,-TGGACGGGACTATTGAAGGCTG -(意义上对基因型),-CGCCTTTTCAGTAGATGGAGG -(反义为野生型),-GCGGATTGACCGTAATGGGATAGG -LacZ(反义)。年龄和weight-matched成年雄性老鼠(6 - 8周,28-32 g)分为四组(每组):组我,假的野生型(Nrf2 + / +);组II,受伤的野生型(Nrf2 + / +);第三组,sham-deficient (Nrf2−−);第四组,injured-deficient (Nrf2−−)。虚假的老鼠和受伤的组织受到相同的麻醉单独或实验性创伤性脑损伤,分别。动物被斩首,虚假的或受伤后24小时。每组5只老鼠牺牲了电泳迁移率改变分析(EMSA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析和免疫组织化学研究。

2.2。诱导实验性创伤性脑损伤

创伤性脑损伤的小鼠模型是采用描述(21)与最近小修改(22]。与戊巴比妥钠腹腔内注射的小鼠麻醉(50毫克/公斤)。一个圆形,平,6毫米直径聚四氟乙烯扣押是集中在耳朵和眼睛之间。创伤性脑损伤是引起100克体重下降从12厘米高度沿不锈钢字符串,翻译成1200克/厘米。脑创伤性窒息与100%的氧气政府当时治疗3分钟和胸部压缩刺激呼吸。这个模型通常是与第一个5分钟内20%的死亡率postinjury观察,没有延迟的死亡率。操作规程后,老鼠回到笼子里。动脉血压、心率、和直肠温度监控,直肠温度保持在在实验物理降温(如果需要的话)。

在虚假的或受伤后的24小时内,小鼠牺牲样本集合。EMSA和ELISA分析,老鼠通过心脏穿刺抽血。大脑皮层组织迅速从新鲜的病变(图1),并立即保存在液氮。免疫组织化学,用冷盐水灌注小鼠(4^°C),其次是neutral-buffered 4%福尔马林。大脑皮层组织拍摄,存储在neutral-buffered 4%福尔马林,然后嵌入石蜡。

2.3。核内蛋白提取和EMSA

核内蛋白提取和量化描述23]。大脑短暂、冷冻样本均质0.8毫升冰冷的缓冲区组成的10更易与L消息灵通的pH值7.9,10更易与L氯化钾,2更易与L德国0.1 L更易与EDTA 1更易与L二硫苏糖醇(德勤)和0.5更易与L phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF)(所有从西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)。匀浆孵化在冰30分钟和涡添加50后30秒L 10% NP-40(σ化工有限公司,密苏里州,美国)。混合物然后离心10分钟(5000×g, 4^°C),颗粒悬浮在100年L冰冷的缓冲B由50更易与L消息灵通的pH值7.9,50 L更易与氯化钾,300毫米氯化钠,0.1 L更易与EDTA, 1更易LDTT,和0.5更易与L PMSF和10% (v / v)甘油和孵化与频繁的混合冰30分钟。离心后(12000×g 4^°C) 15分钟,上层清液收集70−核提取和存储^°为进一步使用C。蛋白质浓度测定用bicinchoninic酸试验装备与牛血清白蛋白标准(皮尔斯生化药剂,罗克福德,生病,美国)。

EMSA执行使用商业套装(凝胶转变分析系统;美国威斯康星州麦迪逊Promega)方法后在我们的实验室23]。共识寡核苷酸探针(agt TGA GGG广汽TTT CCC gg C -)是end-labeled与(γ- - - - - -]ATP(免费的生物技术。,Beijing, China) with T4-polynucleotide kinase. Nuclear protein (10 g)是preincubated总量的9L在绑定缓冲,组成10更易与L Tris-HCl (pH值7.5),4%的甘油,1更易与L MgC0.5,0.5更易/ L M EDTA,更易与L德勤,0.5 L更易与氯化钠和0.05 g / L保利- (deoxyinosinic-deoxycytidylic酸)在室温下15分钟。添加后1l-labled寡核苷酸探针,孵化是在室温下持续了20分钟。通过添加1反应停止L凝胶装入缓冲区和混合受到nondenaturing 4%聚丙烯酰胺凝胶电泳在0.5×此种缓冲(Tris-borate-EDTA)。电泳是在390 V进行1小时后,凝胶vacuum-dried,暴露在x射线胶片(日本东京富士Hyperfilm)−70^°C强化冗长。水平的NF -κB DNA结合活性被计算机辅助光密度分析量化。

2.4。ELISA分析

冻脑样本均质1毫升的缓冲区包含1更易PMSF / L, 1 mg / L的抑肽素,抑肽酶1 mg / L、1 mg / L的亮抑酶肽在PBS溶液pH值(7.2)与玻璃均质器然后在12000 g离心20分钟在4^°c .当时上层清液收集和总蛋白是由布拉德福德决定方法。炎性细胞因子的水平量化使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒特定的鼠标根据制造商的指示(TNF -α从Diaclone研究、法国;il - 1β比利时,il - 6从欧洲Biosource SA)和我们实验室之前的研究(24]。大脑中的细胞因子内容样本表示为pg /毫克的蛋白质。

2.5。免疫组织化学染色

石蜡包埋的部分(4米)被用于免疫组织化学分析,执行和一只山羊antimouse ICAM-1 (CD54)抗体(稀释1∶研发系统,Inc .,明尼苏达州,美国),根据先前的研究我们的实验室7]。在一夜之间,部分被稀释抗体孵育4^°C在潮湿的房间,洗,阻止了1.6%在磷酸盐(PBS) 10分钟。再次与PBS洗涤后,部分被孵化与生物素化的第二抗体室温1小时。Diaminobenzidine (DAB)作为发色体,用苏木精复染色。在每个部分阳性微血管数的数量在10微观领域(100×放大)和平均每视野积极应用容器的数量。

2.6。统计分析

用于统计分析软件SPSS 13.0。所有数据都表示为±SEM,学生的t以及用于分析虚假和创伤性脑损伤组之间的差异在一个基因型和基因型之间。统计学意义是接受。

3所示。结果

3.1。EMSA NF -κB

NF -κB激活核提取物被EMSA评估。如图2、低NF -κB分班活动(弱EMSA放射自显影法)在sham-operated老鼠的基因型。创伤性脑损伤诱导激活NF -κB在皮质的Nrf2(+ / +)和Nrf2(−−)老鼠。Nrf2(−−)老鼠增加易感性TBI-induced激活NF -κ比野生型Nrf2 B (+ / +)。

3.2。ELISA对炎性细胞因子

肿瘤坏死因子的浓度,α,il - 1β在大脑中,il - 6样品通过ELISA测定。如图3,低浓度的TNF -α,il - 1βsham-operated小鼠,观察il - 6基因型。创伤性脑损伤诱导upregulation TNF -α,il - 1β,il - 6的皮质Nrf2(+ / +)和Nrf2(−−)老鼠。Nrf2(−−)小鼠皮层TNF水平,显示更大的增加α,il - 1β比野生型,il - 6 Nrf2(+ / +)创伤性脑损伤后的同胞。

3.3。免疫组织化学的ICAM-1

为评估大脑ICAM-A创伤性脑损伤后的表达,免疫组织化学研究ICAM-1。如图4中,观察到了一些ICAM-1-immunostained脑微血管sham-operated老鼠的基因型。在创伤性脑损伤后的24小时之内,ICAM-1积极船只的数量显著增加的皮质Nrf2(+ / +)和Nrf2(−−)老鼠。Nrf2(−−)小鼠显示更大数量的增加ICAM-1积极比野生型血管Nrf2(+ / +)创伤性脑损伤后的同胞。

4所示。讨论

本研究最重要的发现是,Nrf2(−−)老鼠有更多的炎性细胞因子TNF -α,il - 1β和il - 6生产,ICAM-1表达式及其中介NF -κB在创伤性脑损伤后大脑激活与野生型相比Nrf2 (+ / +)。这些发现报道首次表明,Nrf2可能发挥重要作用在限制脑创伤性脑损伤后炎症反应通过调节促炎核转录因子(NF -κBκB)信号通路。

激活NF -κB信号通路已被证明是中央脑创伤性脑损伤引起的炎症反应的病理生理学(6,7]。NF -κB可以激活lesion-induced氧化应激、细菌内毒素、细胞因子(25]。NF -功能的重要性κB在炎症是基于其有能力调节多个炎症基因的启动子,其中包括TNF -α,il - 1β、il - 6和ICAM-1 [4]。肿瘤坏死因子-α报告的主要发起者炎症和释放后早期炎症刺激(26]。il - 1β被认为是被“多功能”细胞因子,诱导多种细胞类型的后果(27]。肿瘤坏死因子-后il - 6的分泌增加α和被认为是一个重要的促炎细胞因子的贡献都“不受控制”炎症的发病率和死亡率在条件(28]。ICAM-1免疫球蛋白超家族的成员,可以深刻的诱导后细胞因子的挑战,最重要的是在炎症过程中白细胞的招聘(29日]。这个炎症代理网络被认为是重要的一代的急性炎症反应。NF -κB提高了促炎细胞因子的转录激活,反过来激活已知细胞因子NF -κB (5]。积极的反馈被认为用来放大炎症信号和创伤性脑损伤后加重脑损伤。在目前的研究中,我们评估的影响Nrf2基因型TBI-induced激活的促炎NF -κ在大脑中B信号通路。结果表明,中断引起的小鼠Nrf2激活NF -更大κB信号通路中发挥了关键作用的病理生理学脑创伤性脑损伤引起的炎症反应。观察到的Nrf2和NF -之间的相互作用κB信号对应的实验研究脓毒症的结果,这表明Nrf2-deficient老鼠显示增加了NF -κB激活在脂多糖(LPS) [19]。

尽管许多体内研究报道,Nrf2发挥了至关重要的作用抵消炎症在多种实验模型14- - - - - -19),我们已经证实的发现和扩展在创伤性脑损伤模型在目前的研究中,这个网络的确切机制尚不清楚。一些证据显示,Nrf2调节炎症反应通过抑制促炎NF -κB激活通过氧化还原体内平衡的维护。氧化应激与活性氧(ROS)被认为是参与二次脑损伤后创伤性脑损伤的发展(30.]。激活的NF -κB信号通路已被证明是对过量的活性氧,是重要的炎症的一代19]。Nrf2,作为一个关键抗氧化剂转录因子参与细胞内的抗氧化防御系统,已经被证明可以限制ROS水平发挥重要作用,从而影响redox-sensitive NF -κB信号通路参与了炎症(8,10- - - - - -12]。Nrf2的保护功能主要是由一群Nrf2-regulated抗氧化和解毒酶。因此,增强细胞抗氧化和解毒系统通过激活Nrf2-regulated酶导致减少生产促炎细胞因子和粘附分子表达通过失活的NF -κB代表一个可能的抗炎机制减弱炎症反应在大脑从Nrf2(+ / +)老鼠但不是Nrf2(−−)创伤性脑损伤后小鼠。然后我们在这项研究中假定Nrf2调节TBI-induced大脑炎症反应可能至少部分通过调节大脑和促炎NF -氧化还原状态κB信号通路。额外的工作有必要阐明整个机制参与这些复杂网络。

总之,本研究表明,Nrf2具有保护作用TBI-induced脑upregulation炎性因子的老鼠。我们发现Nrf2(−−)小鼠更容易TBI-induced脑NF -κB激活炎性细胞因子TNF -α,il - 1β和il - 6生产,ICAM-1表达式,然后导致创伤性脑损伤后加重脑损伤。我们所知,这是第一个研究,阐明了Nrf2和促炎NF -之间的相互作用κB信号通路在创伤性脑损伤后的大脑。这些发现提出了这样的可能性,那就是Nrf2将是一个新的治疗创伤性脑损伤的治疗目标。

确认

这项工作是支持由金陵医院。作者要感谢博Wu博士和Geng-bao冯技术援助。

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