体外羟基琥珀酮衍生物的抗溶液，血红素聚合和细胞毒性

抽象的

之前的研究表明，X吨酮具有抗癌症活性。合成具有额外羟基的X吨酮以增加其抗血浆活性。评估可以开发成抗疟药的化合物的策略之一是通过在抑制血红素聚合中测试其机制。在酸性条件下，血红素可以聚合到β-Hematin体外，这是血液沸蛋白的类似物疟原虫．进行该研究以评估羟基琥珀酮衍生物衍生物对两种菌株的抗癌活性疟原虫疟原虫3D-7和FCR-3，评估血红素聚合活性的抑制并确定羟基琥珀酮衍生物化合物的选择性。测试每种化合物的抗溶液活性疟原虫疟原虫3D-7和FCR-3, 72小时潜伏期，显微镜下三次重复。采用流式细胞术检测抗疟原虫活性最佳的化合物。采用体外血红素聚合抑制活性(HPIA)法进行血红素聚合抑制试验。以50%抑制浓度(IC)表示抗疟原虫活性和血红素聚合抑制活性₅₀）.使用MTT测定法在Vero细胞系上测试体外细胞毒性以确定其选择性指数。结果表明，在5-羟基琥珀酮衍生物化合物中，1,6,8-三羟基吡吡酮具有最好的体外3D-7和FCR-3的抗癌症活动疟原虫疟原虫菌株用IC.₅₀6.10±2.01和6.76±2.38的值 μm分别。1,6,8-三羟基吡喃蒽与IC显示血红素聚合的抑制活性₅₀值为2.854 mm，并显示出具有502.2-556.54的选择性指数的高选择性。总之，在测试的5-羟基琥珀酮衍生物中，1,6,8-三羟基氧基Xantone显示出最佳的抗蛋白活性，具有血红素聚合抑制活性和高选择性。

1.介绍

疟疾是由A引起的传染病疟原虫寄生虫通过女性传播按蚊蚊虫叮咬[1］．有五种类型的疟原虫导致人类疟疾的物种：疟原虫，疟原虫，疟原虫卵子，疟疾疟疾疟原虫，和疟原虫疟原虫。疟原虫疟原虫（P. falciparum.）是疟疾的原因，具有严重症状，可能导致死亡[2］．

抗疟药机制之一是抑制血红素的聚合。血红素的聚合是将自由血红素变为血液沸素的过程。具有抑制血红素聚合的作用机制的药物之一是氯喹3.，4］．氯喹和血红素复合物的形成可以抑制血液沸素形成[5］．氯喹靶是结合血红素。免费血红素疟原虫的消化液泡对细胞膜有毒性疟原虫蛋白水解酶。然后通过聚合游离血红素疟原虫进入无毒血液沸石以保护疟原虫生活。血液沸素形成只发生在疟原虫红细胞循环感染。血液化有类似的结构β-Hematin，而血红素类似于血红素。因此，通过评估该方法，可以使用血红素聚合的作用机制来发展化合物抗疟药剂。体外血红素可以聚合成β- 在酸性条件下，与现有的血液血素具有相同的性质疟原虫［6］．

疟原虫疟原虫对抗疟药的抗性是疟疾治疗失败的因素之一[7- - - - - -9］．需要进行更先进的研究才能找到新的抗疟疾药物。其中一种策略是从已知具有抗疟原虫活性的导向化合物中合成新的化合物。作为导向化合物的化合物的测定可基于其化学结构与已知具有高抗疟原虫活性的其他化合物的相似性[10］．

承诺作为抗蛋白替代方案开发的化合物之一是X原酮衍生物化合物。X吨酮是已知具有抗溶酶体活性的天然酚类化合物。各种研究表明，天然材料的X原酮化合物被证明具有抑制作用疟原虫增长(11，12］．虽然令人鼓舞的候选人，但是来自天然化合物的这些潜在的抗癌，其数量有限，因此不能保证其可用性。因此，为了确保其生产的可用性和可持续性，有必要开发一种可以以大量再制造的合成化合物。由Amanatie等人进行的一项研究。据报道，番茄衍生的2-羟基琥珀酮化合物具有抑制浓度为50％（IC）的抗溶酶体活性₅₀）4.385 μ克/毫升。该研究表明，羟基影响了X吨酮框架中羟基琥珀酮的高抗催化活性。向X原酮衍生物中加入羟基使得化合物的抗溶性活性高于X原酮化合物，然后呈羟基化合物粘附在羟基上[13］．

一些羟基X蒽衍生物衍生物已经通过FATMASAR合成[14，但其抗疟原虫活性尚不清楚。以往的研究表明，酚类化合物与血红素电子系统之间存在相互作用。带有羟基的苯酚化合物可以结合亚铁血红素[6］．与血红素结合的羟基团簇可以形成复合物，抑制其形成β-Hematin体外．血红素聚合抑制试验可用于确定抗疟原虫药物的作用机制。通过对Vero细胞的细胞毒性测试，可以评价羟基口山酮衍生物的安全性。为了开发治疗疟疾的羟基口山酮衍生物，需要对其抗疟原虫活性、血红素聚合抑制活性和对Vero细胞的细胞毒性进行测试。

2。材料和方法

２.１.检测化合物和疟原虫

Fatmasari合成了五种羟基琥珀酮衍生物[14]，即1,6,8-三羟基山酮(HX1);1, 6-dihydroxyxanthone (HX2);1、5、6-trihydroxyxanthone (HX3);1-hydroxy-5-chloroxanthone (HX4);1, 6-dihydroxy-5-methylxanthone (HX5)。的疟原虫疟原虫3D-7(氯喹敏感株)和FCR-3(氯喹耐药株)从印度尼西亚日惹大学医学、公共卫生和护理学院药理学和治疗系实验室收集。

2.2。疟原虫培养

抗癌症的试验开始于培养物P. falciparum.3D-7和FCR-3使用改进的Trager和Jensen方法[15］．疟原虫在人体O红细胞中培养，稀释至3％血细胞比容的RPMI 1640培养基中，互补10％的人O血清。通过加入10.43g粉末RPMI 1640,6g Hepes，2g Nahco制备培养基_3.，25毫克庆大霉素和无菌蒸馏水，最高可达1磅。调节培养基pH，使其达到±7.2。它使用0.22灭菌 μM过滤并在4°C下储存。通过在培养基中加入浓度为10％的人血清来制备完整的疟原虫培养基。将疟原型培养物在培养箱中在培养箱中温育，温度为37℃，每24小时观察一次。

2.3。体外抗溶质活性测定

通过添加5%的d -山梨醇使疟原虫同步环状。将疟原虫从培养瓶转移到锥形管中，以1000转/分的速度离心10分钟。处理上清后，加入无菌的5%山梨醇，37℃孵育10分钟。再次离心疟原虫悬液;处理上清，加入培养基洗涤疟原虫。再将疟原虫悬液离心，弃上清，形成仅处于环期的疟原虫。从薄血制剂计算出寄生虫血症。该试验使用1%的疟原虫在2%的红细胞压积在RPMI培养基中补充10%的人O血清。

将每个测试化合物溶解在RPMI培养基中。在各种浓度的测试化合物，体积为100 μL被掺入96孔微孔板中，然后加入100 μl疟原虫加入悬浮液。每一系列浓度都被复制三次。将微孔板在37℃的温度下温育72小时。在孵育结束时，使用10％Giemsa污渍制备薄的血液涂片，并在1000x放大率下在光学显微镜下观察。根据薄血的制备计算寄生虫（计数至少1,000个红细胞）的百分比，然后用于计算疟原虫生长抑制的百分比。作为一种对照，没有任何测试化合物的疟原虫培养物被认为具有100％的生长。抗癌症活动被表示为IC₅₀，这是50％抑制疟原虫生长所需的化合物的浓度。IC.₅₀使用SPSS软件（IBM Corp.，Chicago）进行探测分析计算值。IC较低₅₀获得的值，抗癌症活性越大。将抗癌活性分为5类，即优秀（IC50 <1 μm），好（IC50 1-20 μM)、中等(IC50 20-100μm），低（IC50 100-200 μm）和无效（IC50> 200 μ米)(16，17］．

２.４.流式细胞术方法

的疟原虫疟原虫在该方法中使用3D-7菌株。通过加入5％的D-山梨糖醇同步以获得环阶段。具有1％寄生虫的疟原虫在96孔微孔板中培养。将测试化合物一式两份加入并在37℃下孵育72小时。将样品以1000rpm的速度离心10分钟，并在100中洗涤两次 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）。将样品与50℃孵育 μl 1：1000 sybr绿色我和20μL在室温下CD235A-PE 15分钟。洗涤细胞并重新悬浮在PBS中。使用FACSCALIBUR获得数据，获取每种样品的1,00,000个事件。初始浇注是用未感染和未持有的红细胞完成的，以考虑红细胞自发荧光。对照疟原虫感染的红细胞称为100％的生长，以计算用测试化合物处理后的生长抑制百分比。

2．5．体外血红素聚合抑制活性测定

血红素聚合抑制活性（HPIA）根据Basilico等人进行。的改良方法[6］．100年μ将1mM的血红素中加入0.2米NaOH中的L中。然后，50 μ在各种浓度下测试化合物（20.475; 10.238; 5.119; 2.580; 1.269 mm）。蒸馏水用作阴性对照。50. μL将冰醋酸（pH2.6）的溶液加入MicroTube中以引发聚合反应，并在37℃的温度下孵育24小时。将微管以8000rpm离心10分钟，弃去上清液，然后使用200的三次洗涤三次 μL二甲基亚甲醚（DMSO）。然后，血红素晶体的沉积溶于200 μl为0.1米NaOH和100 μ将L溶液加入到96孔微孔板中。

使用ELISA读者阅读吸光度λ405海里。用标准曲线说明血红素浓度与其吸光度的关系。不同浓度的血红素(250;125;62.5;31.25;15.6;7.8;和3.9 mM)制成标准曲线。血红素聚合抑制作用用IC表示_50，这是测试化合物的浓度，可以抑制50％的形成β血色素。IC.₅₀使用SPSS软件（IBM Corp.，Chicago）进行探测分析计算值。如果它具有IC，则化合物显示血红素聚合抑制活性₅₀价值低于IC₅₀氯喹的价值作为参考（37.5mm）[17］．

2.6。体外Vero细胞的细胞毒性试验

的体外使用Anderson等人在Vero细胞系培养上使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基-2-基）2,5-二苯基溴溴化物（MTT）测定法进行细胞毒性试验。改良方法[18］．

2.7。Vero细胞系文化

从冷冻培养基中除去细胞。然后，将细胞在37℃下解冻。随后将液体细胞转移到管中，加入培养基至10ml的体积中。然后，将悬浮液离心15分钟，使其形成细胞粒料。除去上清液，向细胞颗粒中加入1ml培养基。最后，将悬浮液转移到培养皿中并在培养箱中孵育5％的CO₂在37°C时。

2.8。细胞收获

除去Vero细胞培养的培养基，然后使用PBS溶液洗涤细胞，其具有初始培养基体积的PBS±1/2。该步骤进行了两次，加入了1ml胰蛋白酶0.25％。随后，将细胞在CO中温育₂37℃培养3分钟。然后用2 mL培养基重悬细胞，PBS溶液加至10 mL。将悬浮液离心15分钟，使其形成颗粒。加入1ml培养基，重悬。需要10μ计算细胞悬浮液和细胞密度。

然后，将细胞用培养基加入至10mL。总共100 μ将这种悬浮液转移到96孔微孔板的每个孔中，但是井中的三个孔作为培养基对照。随后，将微孔板孵育在5％CO中₂培养箱在37°C。

2.9。测试化合物的制备

将每种羟基口山酮衍生物溶于DMSO中，在培养基中制备不同浓度的化合物。每个浓度的测试化合物加入96孔微孔板三次。细胞对照和培养基对照均不给予试验复合溶液。培养基对照为空白，细胞对照仅含培养基。氯喹作为阳性对照。然后，细胞在5%的CO中孵育₂在37℃下培养箱24小时。

2.10。MTT和SDS添加

将细胞孵育24小时后，弃去培养基并用PBS洗涤。然后，每个井都加100 μl为5mg / ml的MTT溶液。在CO的培养箱中再次孵育96孔微孔板₂37°C, 4小时。然后,100年μ添加了0.01MHCl中的10％SDS的L.将细胞在室温下置于暗室中24小时。

2.11。测量吸光度和IC₅₀价值

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)阅读器在595 nm波长处测定吸光度。通过计算Vero细胞对所测化合物吸收值的抑制率、细胞对照和培养基对照，对Vero细胞进行细胞毒性试验。细胞毒性作用以IC表达₅₀．IC.₅₀使用SPSS软件(IBM Corp.， Chicago)进行probit分析获得。选择性程度用选择性指数表示。通过IC之间的比值得到了选择性指数₅₀细胞毒性对Vero细胞和IC的影响₅₀抗血浆活动疟原虫［19］．如果选择性指数的值> 10 [20.］．

结果

3.1。体外抗溶质活性测定

越来越多的测试化合物的浓度显示出增加百分比疟原虫生长抑制。百分比疟原虫羟基琥珀酮衍生物和氯喹对生长抑制作用P. falciparum.3D-7和FCR-3显示在表格中1．IC.₅₀羟基琥珀酮衍生物的价值P. falciparum.3D-7和FCR-3显示在表格中2．最低的IC.₅₀羟基口山酮衍生物的值P. falciparum.3d-7 6.10±2.01μM在HX1中发现。相反，最高的IC₅₀羟基口山酮衍生物的值P. falciparum.应变3D7 85.30±4.87 μ在HX4中发现M。最低的IC.₅₀羟基琥珀酮衍生物与微观方法的价值P. falciparum.HX1中也发现FCR-3(6.76±2.38)μm）虽然最高的IC₅₀羟基口山酮衍生物的值P. falciparum.FCR-3为89.85±17.69μM在HX4中找到。这些结果表明，HX1显示出良好的抗血浆活性，而HX2，HX3，HX4和HX5具有中等的抗血浆活性P. falciparum.3D-7和FCR-3。氯喹作为阳性对照有IC₅₀值0.01±0.001开启P. falciparum.应变3D-7和0.11±0.052P. falciparum.菌株FCR-3。

3.2。流式细胞术方法

在流式细胞术测定中，化合物HX1具有102.38的最佳浓度 μm表现出抑制活性P. falciparum.3于经济增长。化合物HX1浓度较高，浓度为204.75μm表现出较高的抑制活性超过90％。复合HX1的流式细胞术分析图P. falciparum.3D-7显示在图中1．

3.3。体外血红素聚合抑制活性测定

结果表明，HX1浓度越高，其含量越低β-hematin的形成，抑制率越高β血色素。浓度为20.475mm的HX1能够抑制血红素的聚合用IC₅₀值为2.854 mM。相比之下，IC₅₀阳性对照氯喹的值为1.478 mM。IC.₅₀1,6,8-三羟基口山酮(HX1)化合物和氯喹在抑制β-血红素列于表3.．

3.4。体外Vero细胞的细胞毒性试验

在测试的5-羟基吡啶化合物中，化合物HX1显示了最高IC₅₀价值体外vero细胞的细胞毒性试验（3394.90±435.44 μm）。化合物HX1显示了选择性指数的最高值（细胞毒性/抗蛋白比例P. falciparum.菌株3D-7和FCR-3）范围为502.20-556.54。IC.₅₀在表中提出了Vero细胞上羟基琥珀化合物的值4．羟基琥珀化合物和氯喹的选择性指数在表中提出5．

4。讨论

4.1。体外羟基口山酮衍生物的抗疟原虫活性

该研究表明，测试的羟基琥珀衍生物化合物显示出不同水平的抗蛋白酶活性。化合物1,6,8-三羟基吡吡纶（HX1）在使用微观方法测试的五种羟基琥珀化合物中显示出最佳的抗蛋白活性。根据Batista等人确定羟基琥珀化合物的抗溶液活性类别。的标准[17将化合物分成五类，即非常好(IC₅₀ < 1 μm）;好（IC.₅₀1-20 μm）;中等（IC.₅₀20 - 100μm）;低（IC.₅₀100 - 200μm）;无效（IC₅₀> 200μm）。体外进行抗溶液活性测定疟原虫3D-7和FCR-3的菌株显示了IC₅₀值为6.10±2.01 μM和6.76±2.38 μm对于1,6,8-三羟基吡喃酮（HX1），表明该化合物具有良好的抗血浆活性。Sybr Green I和CD235A的流式细胞术分析表明，随着感染的红细胞的清晰分离P. falciparum.和未感染的红细胞（图1）.该方法识别P. falciparum.根据核酸含量[21］．

Based on its structure, HX1 consists of a hydroxyl group, C-H, aromatic (C=C), cluster that characterizes the xanthone compound, which is the top of the carbonyl group (C=O) (carbonyl number 9) and the ether group (C-O-C) (Carbon numbers 4a and 4b) [14］．口山酮化合物的羟基可以与羧基血红素结合，对羟基口山酮-血红素配合物的稳定性起芳香作用，而口山酮化合物的羰基可以与血红素铁结合，形成羟基口山酮-血红素配合物[22］．与自由血红素的相互作用最有可能有助于血红素排毒的机制。它是已知的抗癌症作用机制之一。

Amanatie报道了羟基口山酮化合物的活性，该化合物中有明显数量的羟基簇P. falciparum，并确定2-羟基吡酮化合物具有抗癌症活性P. falciparum.带IC的应变3D-7₅₀20.69 μ米,而集成电路₅₀2,7-二羟基X蒽的值为1.342 μm [13］．X吨酮框架上的羟基簇越多，抗蛋白酶活性越好[23］．这些结果与本研究发现HX1和HX3 IC较低的结果一致₅₀结果表明，这些化合物的活性高于羟基簇数较少的HX2、HX5和HX4。除羟基的数量不同外，抗疟原虫活性的差异还可能是羟基取代基和羟基位置不同造成的。HX5化合物有一个甲基，它是电子给体。然而，簇合物的电子给体强度比羟基弱，并且HX4化合物是一个电子拉者，氯取代基[14］．该研究表明，向5-羟基吡喃蒽化合物的碳位置添加甲基和氯群，不能提供具有更高IC的HX5和HX4化合物中显示的更好的活动₅₀比HX2价值。

先前关于羟基吡啶化合物的研究报道，X原酮化合物在碳位置2,3,4,5和6处取代羟基簇体外抗蛋白酶的潜力[13］．Ignatuschenko等人也报道了同样的研究[11[发现X原酮，在4或5时加入1-羟基，并具有中度的抗血浆活性。相反，在两个位置4和5中加入羟基的X吨酮具有更活跃的抗蛋白酶活性。该数据符合该研究，即在具有较低IC的化合物HX1，HX3，HX2和HX5中加入碳位置6中的羟基₅₀比在碳6的位置具有羟基的HX4。

4.2。羟基琥珀酮衍生物化合物的聚合抑制活性

什么时候疟原虫感染人的红细胞，它将血红蛋白从红细胞中带到疟原虫'消化液泡。疟原虫通过胞饮作用产生酸性pH [24］．血红蛋白被氧化成甲基酚，通过天冬氨酸蛋白酶（Plasmepsin I，II，II，IV和Histo-天冬氨酸）水解成游离血红素和球蛋白）。球蛋白通过半胱氨酸蛋白酶（恶性脂）和含锌金属肽酶水解肽。然后，通过细胞溶溶胶外肽酶将肽水解成氨基酸，其将被使用疟原虫用于粉丝膜的蛋白质合成疟原虫细胞质(25，26］．

血红蛋白的降解的结果是自由血红素对其毒性有毒疟原虫因为它产生反应性氧物质（ROS）并诱导氧化应激，这导致细胞裂解和寄生虫的死亡[27］．所以，疟原虫解决了自由血红素与血红系解毒系统的毒性[28］．原发性血红素排毒系统是血液沸蛋白的形成，发生在此时疟原虫消化泡。相反，次级血红素解毒系统，通过H₂O₂和谷胱甘肽(GSH)，并与蛋白-血红素结合，发生在胞质中。在疟原虫在消化液体中，30-50％的游离血红素将转化为无毒血液沸蛋白，而另一个游离血红素通过疟原虫对消化液泡疟原虫然后用谷胱甘肽、H₂O₂，血红素蛋白质键[29］．

游离血红素即血红素单体，通过血红素聚合酶的作用转化为聚合物血红素。疟原虫素是一种稳定无毒的疟疾色素。血红素聚合物与铁羧化酶键连接，铁羧化酶键连接一个血红素的铁中心和另一个血红素的丙酸侧链。疟原虫素的形成是抗疟药的靶点，如氯喹。目的活性是抑制血红素的聚合[10，30.，31］．

测试了该研究中最好的抗癌症活性的HX1化合物体外对于其血红素聚合抑制活性。该测试涉及自发血液沸素形成机制（β-Hematin）。在该测定中使用血红素，因为它具有与游离血红素相似的结构，而模仿模型疟原虫的消化液泡，具有酸性pH并引发形成的反应β-Hematin;施用冰醋酸。在酸性环境中，血液将聚合到晶体中β-hematin [24］．

较小的金额β-血红素的形成，更抑制了血红素的聚合。本实验提示给药HX1可抑制细胞的形成β血色素。化合物浓度越高，抑菌率越高β血色素。HX1化合物可抑制β- 用ICMATIN₅₀值为2.854 mM。口山酮的分子特性使其不溶于水，同时对有机溶剂具有较高的溶解性。非污染特性使大多数口山酮化合物具有一些生物效应，可影响膜[32］．

氯喹会扩散疟原虫消化液泡膜脂双分子层。在疟原虫芳啉，氯喹是质子化的，不能扩散出来使氯喹积聚在疟原虫消化泡。氯喹然后结合形成稳定的氯喹血络合物，抑制血红素的聚合，导致消化液泡的结构和损伤以及血液的破坏以及疟原虫死亡。从4,5-二羟基吡啶（45×2）化合物的活性结构轮廓（45x2）化合物的活性结构轮廓证明一致的结果体外抗溶质活性[11，24］．

光谱核磁共振（NMR）研究报道说，羟基琥珀酮（45x2） - 血清复合物的结构由铁血红素和X原酮化合物中的羰基之间的相互作用形成。两个芳族系统有助于血红素-45x2复合物的稳定性以及血红素中羟基簇之间的羟基簇之间的氢键与血红素中的羧基。债券可以描绘45x2型号μ含氧的二聚体血色素。该研究表达了与血红素的45X2键亲和力几乎相同的血红素抗疟复合物，如氯喹和奎宁。45X2-血红素相互作用化学计量学显示两个血红素单元与一个45X2分子结合[22］．数据概述了羟基X蒽化合物如何与血红素结合的概述。

早期用核磁共振氢谱进行的研究也显示了氯喹与血红素的相互作用。该研究报告了氯喹分子与四种血红素分子的相互作用。氯喹主要以。的形式结合μ-oxodimerhematin。结构稳定μ-Oxodimerhematin阻碍了血液沸蛋白的形成。血红蛋白衍生物，键入血管可以以血红素稳定血管μ- 氧化二聚体，从而减少将血液单体的量组合成血液沸素并抑制血红素的聚合[33］．然而，氨基喹啉衍生物与血红素相互作用，但不妨碍血红素聚合。因此，化合物与血红素的结合并不一定会抑制血红素聚合。血红素的抑制聚合不仅取决于化合物结合血红素的能力，还取决于其抑制血红素聚合物与其他血红素结合的专业性[31］．血红素的置换可能是由与不稳定的血红素结合引起的，例如在喹啉衍生物环的第7位的一个特殊簇与血红素有一个牢固的结合。然而，当基团移到喹啉衍生物环上的第6位时，与血红素的键变得不稳定，不能抑制血红素的聚合[24］．

血红素聚合抑制活性（HPIA）测定显示HX1具有低IC₅₀（2.854毫米），氯喹（1.478毫米）。氯喹有潜在的抗癌症活性，低IC₅₀价值疟原虫3D-7和FCR-3（0.001和0.11 μM,分别)。HX1的抗疟原虫活性低于氯喹₅₀价值疟原虫3D-7和FCR-3（6.10和6.76 μM,分别)。数据表明，血红素抑制聚合与抗血液淋巴瘤之间存在相关性。但是，这些结果不一定是线性的。Ignatuschenko等人。表示，从X吨酮的衍生物，即五甘油酰基蒽和五乙酰X蒽获得的抗溶液活性和血红素聚合抑制活性存在差异。它们在血红素聚合抑制中无活性，但具有潜在或优异的抗抗癌能力[11］．这些数据表明，血红素聚合抑制活性与抗蛋白酶活性之间没有直接相关性。可以抑制血红素聚合的化合物不一定具有良好的抗抗蛋白酶活性。具有良好的抗溶液活性的化合物不一定抑制血红素聚合。

一些理论描述了通过糖酵解途径抗疟原虫作用的其他机制。它可以抑制乳酸脱氢酶(LDH)和减少三磷酸腺苷(ATP)的产生，这可以导致疟原虫死亡。此外，不同的作用机制可以通过DNA复制途径抑制拓扑异构酶II酶，从而最终导致疟原虫死亡 [34，35］．

4.3。羟基琥珀酮衍生物对Vero细胞的细胞毒性

进行这种细胞毒性测试以确定羟基琥珀化合物对正常细胞（Vero细胞）的安全性。给予羟基X蒽化合物的VERO细胞培养物表明，浓度越高，VERO细胞的生长抑制率越高，并且根据浓度对细胞变得更大毒性。

结果表明，化合物HX1、HX2、HX3、HX4和HX5对Vero细胞具有细胞毒性₅₀价值观（3283.72; 389.66; 230.28; 334.90; 458.94 μm或801.88;88.92;56.23;82.60;111.17 μ总计克/ ml）。五种羟基琥珀化合物具有弱细胞毒性效应（IC50> 30 μg/mL)在Vero细胞上[36］．在Fatmasari进行的研究中提出了相同的结果[14[显示HMF-7，WIDR和HeLa细胞系上的化合物HX1，HX2，HX3，HX4和HX5的弱细胞毒性。

insilico.通过分子对接方法进行HX1化合物与拓扑异构酶酶II之间的相互作用。分子对接的过程涉及预测靶蛋白的结合位点（结合侧）的配体的构象和取向。化合物或配体用作互补的蛋白质，而蛋白质是受体。含有毒素（混合物）是一种具有与酶Topoisomerase II中发现的X吨酮的基本帧工作的配体。而且，两者都具有在活性侧的形状和体积的匹配，然后发生相互作用配体和蛋白质。能量值越低，配体越稳定，使得用蛋白质产生的相互作用更强。因此，各种强相互作用的存在会导致拓扑异构酶II酶的性能。酶在活细胞中发现并用于改善受损DNA的结构。当酶功能中断时，将DNA的复制过程和转录成RNA不能进行，以便细胞会经历细胞凋亡。该过程也是来自抗蛋白酶的作用机制之一，例如氯喹。

分子对接的结果表明DNA链，即氢相互作用（DG C：13）和PI- acked（DA F：12和DC C：8）的相互作用，结合亲和值-8.0kcal / mol．然而体外细胞毒性试验显示HX1对MCF-7、WIDR和Hela细胞株有较弱的细胞毒活性₅₀45;61.9;67.7μ克/毫升。这些结果表明HX1化合物的作用机制也可能在抑制拓扑异构酶II的作用中起作用。来确定与DNA的键是否存在体外可以用分光光度法用DNA-甲基绿色测定进行测试[37］．

化合物的选择性在新药的发育中至关重要。如果选择性指数大于10并且具有良好的抗癌效应，则据说该化合物是选择性的，但对宿主没有毒性。选择性指数从（IC之间的比率₅₀对Vero细胞的细胞毒性作用）和（IC₅₀抗癌症活动P. falciparum.3于和FCR-3)。HX1的选择性指数为>10，这意味着它对宿主是安全的，因此它有可能被开发为抗疟原虫药物。

5.结论

在测试的5-羟基琥珀酮衍生物中，1,6,8-三羟基Xantone显示出最佳的抗血浆活性，具有血红素聚合抑制活性和高选择性。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

利益冲突

作者宣布没有关于出版物的利益冲突。

致谢

作者感谢Wagimin先生和MOSA女士进行实验室援助。本研究和出版物由Accentsitas Gadjah Mada，Yogyakarta，Yogyakarta，Indonesia提供资金。

参考

1. N.阿巴斯，T. Saba, A. Rehman等人，"疟原虫物种意识到基于光学显微镜薄血涂片的疟疾寄生虫的量化，“显微镜研究与技术，第82卷，第2期7，页1198-1214,2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术
2. K. E. MACE，P. M. Arguin和K. R. Tan，“疟疾监督 - 美国，2015年，”MMWR调查摘要，第67卷，第5期7、2018年第1-28页。查看在：出版商的网站|谷歌学术
3. A. F. G. Slater， <氯喹的药物作用机制和耐药性疟原虫疟原虫，“药理学与治疗方法(第57卷)2-3，pp。203-235,1993。查看在：出版商的网站|谷歌学术
4. X. NQORO，N.Tobeka和B.A.Aderibigbe，“基于喹啉的杂种化合物，具有抗疟疾活动”分子第22卷第2期12日,2017年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
5. T. S. Macedo, W. Villarreal, C. C. Couto等，“铂(II)-氯喹复合物是通过损害线粒体功能而对抗血液和肝脏阶段的抗疟剂，”金属化学，卷。9，没有。11，PP。1548-1561,2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
6. N. Basilico，E.Pagani，D. Monti，P.Olliasro和D. Taramelli，“一种测量抗疟药的血液聚合抑制活性（HPIA）的基于微量幂的方法”抗菌化疗杂志CHINESE，卷。42，不。1，pp。55-60,1998。查看在：出版商的网站|谷歌学术
7. L. M.B.B.URSOS和P. D. ROEPE，“疟原虫血管抗血管抗性，”疟原虫疟原虫，“药用研究评论第22卷第2期5，pp。465-491,2002。查看在：出版商的网站|谷歌学术
8. R. Abdul-Ghani，M.A.K.Mahdy，J.C.Beier和L.K. Basco，“抗性寄生虫隐藏的水库：消除恶性疟疾疟疾的链接”传染病的贫困，卷。6，不。1，pp。4-9,2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
9. E. A. Ashley和A. P. Phyo，“开发中的疟疾药物”，毒品，卷。78，没有。9，pp。861-879,2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术
10. P. J. ROSENTHAL，“抗疟药药物发现：旧和新方法”实验生物学杂志第206期21，第3735-3744页，2003。查看在：出版商的网站|谷歌学术
11. M. V. Ignatushchenko, R. W. Winter, H. P. Bächinger, D. J. Hinrichs, M. K. Riscoe，“口山酮作为抗疟疾药物;研究一种可能的行为模式"费用字母，卷。409，没有。1，pp。67-73，1997。查看在：出版商的网站|谷歌学术
12. F. Martin，A.-e.Hay，D. Cressend等人，“来自叶子的抗氧化C-葡糖糖苷蒽arrabidaea patellifera，“自然产品杂志，卷。71，没有。11，pp.1887-1890,2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术
13. A. Amanatie，J.Jumina，M. Mustofa，M.Hanafi，L.O.Kadidae和S. Sahidin，“来自Xanthone的2-HIDroxyX蒽作为新的抗疟药的基本材料”，“亚洲药物与临床研究杂志，第10卷，第5期。12，页242,2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
14. N.FATMASARI，“合成，抗氧化和抗癌活动评价以及羟基吡啶衍生物对Topoisomerase II的分子对接研究，”大学生Gadjah Mada，Yogyakarta，Indonesia，2019，论文。查看在：谷歌学术
15. W. Trager和J. B.Jensen，“人类疟疾寄生虫在不断的文化中，科学，卷。193，PP。673-675,1976。查看在：出版商的网站|谷歌学术
16. R.Baelmans，E. deharo，V.Munoz，M. Sauvain和H.Ginsburg，“测试氯喹的抑制活性的实验条件β-Hematin，“实验寄生虫学，卷。96，没有。4，pp。243-248,2000。查看在：出版商的网站|谷歌学术
17. R. Batista，A. de Jesus Silva Jr.和A. B. de Oliveira，“植物衍生的抗疟剂：新的铅和有效的植物植物。第二部分。非组分天然产品，“分子第14卷第2期8，pp。3037-3072，2009。查看在：出版商的网站|谷歌学术
18. M. M. Anderson，M.J. O'Neill，J. David Phillipson，以及D.C.Warhurst，“来自一系列QuAssinoids的体外细胞毒性Brucea Javanica果实对抗KB细胞，“Planta Medica.(第57卷)1，页62-64,1991。查看在：出版商的网站|谷歌学术
19. E. N.Sholikhah，M.A.Wijayanti，L.H. Nurani和M. Motofa，“Aktivitas抗药Dan Sitotoksisitasisitas Isolat Akar Pasak Bumi（Eurycoma Longifolia杰克）Secara体外，“MajaLah Farmaseutik.第14卷第2期2，第54页，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术
20. G. E. de Souza，R.V.Bueno，J.O. de Souza等，“来自疟疾盒的选定化合物的抗溶浆概况：invitro评估，作用速度和药物组合研究”疟疾杂志，卷。18，不。1，pp。1-13,2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术
21. J. W.Jang，J. Y.Kim，J. Yoonetal等，“流动细胞计量序列促血清素文化疟原虫疟原虫用SYBR green I和CD235A染色，科学世界杂志，卷。2014年，第536723号，6页，2014年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
22. J. X.Kelly，R.冬季，M. riscoe等，“4,5-二羟基吡啶和血红素”，费用，第86卷，第617-625页，2001。查看在：谷歌学术
23. J. Fotie, A. E. Nkengfack, G. Rukunga等，“一些含氧口山酮的体内抗疟活性”，热带医学寄生虫学年鉴，卷。97，没有。7，pp。638-688，2003。查看在：出版商的网站|谷歌学术
24. S. Kumar，M. Guha，V.Choubey，P. Maity和U. Bandyopadhyay，“抗疟药抑制血液沸石（β-HemaTin）形成：机械更新，“生命科学，卷。80，不。9，pp。813-828,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学术
25. S. R. Hawley，P.G.B.Bray，M.Mungthin，J。D.Atkinson，P.M.O'Neill和S. A.病房，抗疟药活性，积累和血红素聚合的抑制之间的关系疟原虫疟原虫体外。”抗菌药物和化疗，卷。42，不。3，pp。682-686，1998。查看在：出版商的网站|谷歌学术
26. K.K.Gegleson，K.L.Duffin和D.E.Goldberg，“Falcilysin的鉴定和表征，一种参与疟原虫寄生虫血红蛋白分解代谢的金属肽酶疟原虫疟原虫，“生物化学杂志第274期45, pp. 32411-32417, 1999。查看在：出版商的网站|谷歌学术
27. S. W.Ryter和R.M. Tyrrell，“血红素合成和降解途径：在氧化剂敏感性中的作用。血红素氧合酶具有亲和抗氧化性能，“自由基生物学与医学，卷。28，不。2，pp。289-309,2000。查看在：出版商的网站|谷歌学术
28. A. V.Pandey，H.Bisht，V.K.Babbarwal，J.Srivastava，K.C.Pandey和V.S. Chauhan，氯喹的疟原虫释放抑制的机制，“生物化学杂志第355期2，页333 - 338,2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术
29. A. F. G. Slater和A.Cerami，“通过新型血液聚合酶酶活性的氯喹啉在疟疾滋养中的抑制作用”自然第355期6356，PP。167-169,1992。查看在：出版商的网站|谷歌学术
30. T. oida，K。kamei，D.T.T.T.Trang等，“血红素结晶的简单比色抑制测定，用于抗疟疾化合物的高通量筛选”抗菌药物和化疗，卷。51，没有。1，PP。350-353,2006。查看在：出版商的网站|谷歌学术
31. R.A.Syarif，M. Mustofa，N.Ngatidjan和M. S.H.H. Wahyuningsih，“血红素聚合抑制Tithonia Diversifolia（Hemsley）灰色叶子分数作为抗癌剂及其在Vero细胞上的细胞毒性，“MajaLah Obat Tradisional.，卷。23，不。3，p。106,2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术
32. J.P.Cejas，A. S. Rosa，H.A.Pérez等，“Xanthone和1-羟基Xanthone对脂膜偶极电位的影响”，“胶体与界面科学通讯，卷。26，pp。24-31,2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术
33. S. Moreau, B. Perly, C. Chachaty和C. Deleuze，“抗疟药物与卟啉相互作用的核磁共振研究”，Biochimica et Biophysica Acta（BBA） - 一般性受试者，卷。840，没有。1，pp。107-116，1985。查看在：出版商的网站|谷歌学术
34. S. N. Froelich Ammon和N. Osheroff，“Topoisomerase Poisons：利用酶机制的黑暗面，”生物化学杂志，卷。270，没有。37，PP。21429-21432,1995。查看在：出版商的网站|谷歌学术
35. a . Cameron, J. Read, R. Tranter等，“具有乳酸脱氢酶定向抗疟疾活性的一系列以唑为基础的化合物的鉴定和活性”，生物化学杂志，卷。279，没有。30，pp。31429-31439,2004。查看在：出版商的网站|谷歌学术
36. K. Jenett-Siems, F. P. Mockenhaupt, U. Bienzle, M. P. Gupta, E. Eich，“中美洲药用植物的体外抗疟原虫活性”，热带医学和国际健康，卷。4，不。9，pp。611-615，1999。查看在：出版商的网站|谷歌学术
37. S. Van Miert, T. H. M. Jonckers, L. Maes et al.，“新隐甲肾上腺素衍生物的合成、细胞毒性和抗疟原虫活性”，Acta Horticulturae。，卷。3，2005年。查看在：谷歌学术

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