α胰腺癌细胞侵袭的2整联蛋白依赖性抑制激肽释放酶涉及到相关的胞外结构域调节肽酶-5-

摘要

以前的报告表明：α2-integrin (α2） 介导胰腺导管腺癌（PDAC）细胞与胶原的相互作用α2仅在胶原蛋白上粘附和迁移，分化较差的PDAC细胞对胶原蛋白的依赖性降低或完全丧失，α2.由于高分化的PDAC线表现出减少的体外入侵和α2 .我们假设，阻断剂完全抑制了分化良好的细胞系的入侵α2可能抑制PDAC的恶性表型。因此，异位表达α2迟钝体外胶原蛋白的侵袭和维持加重了这种作用。Affymetrix分析显示，kallikrein相关肽酶-5 (KLK5)被特异性上调α2,减少α2和KLK5在低分化PDAC细胞中表达原位因此，高分化PDAC细胞系表达KLK5，而KLK5阻断增加了KLK5阳性细胞系的侵袭α2-细胞质结构域对于这些效应是不必要的，这表明α2-ectodomain和KLK5协调PDAC中的侵入性表型较少。

1.导言

胰腺导管腺癌(PDAC)是所有癌症中死亡率最高的之一;尽管它只占美国每年新发癌症病例的2%，但它是癌症死亡的第四大原因[1]尽管如此，对PDAC的生物学仍知之甚少。与PDAC起始相关的突变使PDAC病因学的时间线得以发展[2];然而，导致疾病进展的因素尚不明确。PDAC与显著的纤维组织增生相关，其特征是I、II和IV胶原的显著沉积[3.].胶原蛋白结合α2-integrin (α2）由正常的胰腺导管上皮和PDAC表示原位［4，5]之前的研究表明α2β1整合素作为PDAC细胞的主要胶原受体[6]．然而，免疫组化研究未能证明一致的模式α2在PDAC中的表达原位［3.- - - - - -5，7，8]，使确定α2在PDAC病因学和/或进展中的作用。重要的是，PDAC细胞分化良好，转移不良α对胶原蛋白的2依赖反应，低分化和高转移的MIAPaCa2细胞完全缺乏胶原蛋白相互作用[6]．此外,α2与其他上皮组织的组织结构和细胞分化的维持有关[9]．事实上,虽然分化良好型的α2阳性PDAC细胞已被证明可产生广泛的原发肿瘤，侵袭局部，分化较差α2-阴性PDAC细胞产生小的原发性肿瘤，并有明显的远处播散[10]．因此，虽然α2-阳性胰腺上皮细胞利用这种整合素进行胶原相互作用，克服这种相互作用可能有利于恶性PDAC细胞，尤其是在PDAC特征性的富含胶原的促结缔组织增生反应的情况下原位．

我们评估了α2.调节PDAC细胞的侵袭体外．我们的数据表明了α2是高分化至中分化PDAC细胞侵袭的关键介质，这些细胞表现出较小的侵袭性，主要依赖于激肽释放酶相关肽酶（KLK）。相反，高转移、低分化PDAC细胞表现出较高的体外入侵在很大程度上α2和KLK独立。我们进一步致力于α2外结构域介导了这种表型，并证明持续暴露于胶原蛋白会加剧这种表型α2依赖的侵袭抑制效应，表明存在α2对持续暴露于富含胶原蛋白的结缔组织增生（PDAC的特征）的细胞具有额外的抑制作用原位．

2。材料和方法

2．1.细胞

CAPAN1、CAPAN2、BxPC3、MIAPaCa2和Panc1细胞最初来自ATCC，并根据ATCC进行培养。永生化、未转化的HPDE-E6E7c7（HPDE）细胞由M.Tsao（加拿大多伦多健康网络）提供，并在补充有EGF和垂体提取物的角质形成细胞培养基中培养（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市因维特罗根市）PT45P1细胞是H.Kalthoff（Kiel，DE）的慷慨馈赠，并在RPMI/10%胎牛血清（FBS）中培养。COLO357细胞由M.Korc（UCI，Irvine，CA，USA）提供，并在DMEM/10%FBS中培养。无血清（SF）培养基由除血清外的所有成分组成，适用于细胞系，补充0.5%的牛血清白蛋白（BSA）。细胞系分化特征见补充表S1，可在线访问doi:10.1155/2011/365651。

2.2.抗体和试剂

功能阻断抗整合素抗体来自Santa Cruz生物技术公司（美国加利福尼亚州Santa Cruz）或Chemicon/EMD公司（美国加利福尼亚州圣地亚哥），包括：α1（5E8D9）;α2（P1H5）；α3 (P1B5);β1（P4C10）。抗-α用于免疫印迹的2个单克隆抗体（611016）和IHC来自BD转导实验室（肯塔基州列克星敦）。山羊抗hKLK5（AF1108）和抗hKLK6（AF2008）亲和纯化的PAB来自研发系统（明尼苏达州明尼阿波利斯）。抗肌动蛋白来自西格玛（密苏里州圣路易斯）。纯化的牛胶原蛋白（Purecol）来自Advanced Biomatrix（加利福尼亚州圣地亚哥）肽基激肽释放酶抑制剂（RP10161）来自GenScript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）。HRP-和FITC结合的二级抗体来自Jackson免疫化学公司（美国宾夕法尼亚州西格罗夫）。pGEX载体编码GST标记的tenascin FN_三,域名由K. Crossin (TSRI, La Jolla, CA, USA)慷慨提供，并如前所述生产[11]．

2.3.表达构建和转染/选择

含有野生型人的pBS(KS+)α2-integrin CDS(克隆2.72F)来自ATCC。的α用KpnI切除2个CDS并连接到pCDNA3.1（zeo）中以产生pCDNA3.1/α二,α2Δcyto插入物通过pCDNA3.1的PCR产生/α2用T7测序引物(正向)和α2Δcyto/XbaI引物(补充表S2)^＇stop密码子和XbaI位点。所得产物经XbaI酶切并穿梭于pEF4a中。用KpnI和NotI从pEF4a中切除插入片段，插入pCDNA3.1(zeo)上的这些位点。pCDNAIneo /α9DM1和pCDNAIneo/α9α2由D. Sheppard（UCSF，旧金山，CA，USA）慷慨地提供，并以前描述了[11]．从COLO357 cDNA中扩增出KLK5和KLK6 CDS，利用XbaI酶切位点工程引物(supplementary Table S2)。将得到的产物用XbaI切割并插入pCDNA3.1(zeo)的XbaI位点，该位点位于一个与湿霉素磷酸转移酶基因相连的IRES的上游(碱基构建如前面所述;［12]).序列在Moores UCSD癌症中心DNA测序共享资源处进行验证。根据Lipofectamine2000（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）制造商的说明转染MIAPaCa2细胞。MP2/α2和MP2 /α2Δcyto细胞在涂有25 μg/mL胶原蛋白，用5%BSA/PBS封闭，用zeocin.MP2选择/α9DM1和MP2/α9α2个细胞在G418培养液中孵育μg / mL GST-TnFN_三,用潮霉素筛选表达KLK的细胞。在选择剂存在下维持稳定的细胞群。瞬时转染采用pEF4-LacZ和x-gal共转染来鉴定转染细胞。

2.4。免疫印迹

细胞在NP40裂解缓冲液(50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40)中裂解，该缓冲液含有含有10 mM PMSF、1 mM NaF和10 mM Na的Complete Protease Inhibitor Cocktail_3.签证官₄．样品的制备和分析如前所述[12]．

2．5．酶联免疫吸附试验(ELISA)

将等体积的条件培养基一式三份涂于96孔微量滴定板上。在与一级抗体孵育之前，用0.5%明胶封闭孔。用TBS-T清洗孔，并与HRP结合的二级抗体孵育。用过氧化物酶底物SureBlue TMB检测抗体复合物（KPL；马里兰州盖瑟斯堡）。反应以0.2%停止 N HCl和在450处读取的吸光度 纳米。

2.6.流式细胞术

在Moores UCSD癌症中心流式细胞术共享资源的FACScalibur（BD Biosciences，Bedford，MA，USA）上进行流式细胞术。闸门设置为仅用FITC结合二级抗体处理的细胞，5 μ包括g/mL碘化丙啶以排除死亡和死亡细胞。

2.7.粘附试验

将子环戊细胞接种在2.5×10的SF-MEDIO中⁵非组织培养处理板每48孔细胞25μg/mL(除非另有说明)，用5% BSA/PBS阻断。细胞粘附45分钟(除非另有说明)，然后清洗，用1%甲苯胺蓝染色，用10%乙酸手工计数或提取染料，并在595 nm处定量吸光度。在有指示的地方，细胞用抗体预培养(50μg/mL）5分钟 在播种到井中之前的分钟。

2.8。迁移试验

无菌培养基插片(8μm pore；Millipore Corp.，Billerica，MA，USA）在底面涂上20 μ在插入含有SF培养基的培养板前，g/mL胶原蛋白。细胞（2.5×10⁵)在SF培养基中加入50%或不加入50%的溶液至上腔 μg/mL功能阻断抗体在37°C下。在指定时间固定插入物，用1%甲苯胺蓝染色，去除未融合的细胞并计数迁移的细胞。如有说明，抗体（50 μg/mL)。

2.9。入侵检测

亚流动细胞（2.5×10⁵)在SF培养基中接种到含有全生长培养基的井中的BioCoat生长因子减少基质凝胶侵入室（BD Biosciences，Bedford，MA，USA）。腔室在37℃下孵育24小时 h（48 h（对于COLO357细胞），或如固定前所示，用1%甲苯胺蓝染色，去除未侵入的细胞并手动计数。如有说明，抗体（50 μg/mL)。

2.10。逆转录PCR

从1μg总RNA用oligo-dT引物。1μL的总cDNA，引物见补充表S2。

2.11.免疫组织化学

根据UCSD部门的批准的机构审查委员会议定书提供了组织样本。将样品脱酸盐，再水化，并与1％H温育₂O₂使内源性过氧化物酶失活。玻片用50 mM甘氨酸淬火，用2%马血清/5% BSA/磷酸盐缓冲盐水(PBS)封闭，pH 7.4，使用目标检索液(DAKO North America;Carpinteria, CA, USA)α2或抗hklk5 pAb 2.5μ克/毫升。冲洗载玻片，根据VectaStain Elite ABC Kit (Vector Labs;伯林盖姆、钙、美国)。切片用DAB显影，苏木精反染，脱水，裱片。

2.12. Affymetrix基因阵列分析

补充资料部分详细介绍了代表性基因变化表（补充表S3和S4）。全套阵列数据可通过登录号GSE18277在地理信息库中获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=zreftooauqiuupq&acc=GSE18277）.

2.13。统计数据

基因阵列统计在补充方法中描述。粘附、迁移和入侵由双尾学生分析t以及。

3.结果

3.1. 胰腺胶原结合整合素表达反映分化状态

流式细胞术分析胰腺细胞的分化谱(见补充表S1)显示了一种独特的胶原相互作用整合素表面表达模式体外(图1（a） ）。所有细胞均表达显著性差异α3整合素。然而，未转化的HPDE和分化良好的CAPAN1 (G1)和CAPAN2 (G1)细胞表现明显α2.表达和否α中分化的BxPC3 (G2)和COLO357 (G2)细胞表达显著α2和边际α1.相反，分化差的PT45P1 (G3/G3+)细胞表达两种蛋白α1,α而分化极低的MIAPaCa2 (G3+)细胞则完全缺乏这两种整合素。的collagen-binding整合蛋白α10,α11个未被研究，因为它们的表达受限，事实上我们细胞中所有的胶原相互作用都可以被解释为α1,α二,se data demonstrate the differential expression of collagen-interactive integrins in a manner coincident with differentiation.

3.2.低分化PDAC细胞表现出依赖性降低或完全丧失细胞功能α2整合蛋白相互作用

未转化的HPDE细胞以及分化良好和中等的PDAC细胞显示完全依赖于α2β1整联蛋白用于胶原蛋白的粘附和迁移（图1 (b)和1 (c)）.相比之下,α2 .对分化较差的PT45P1细胞进行阻断对其与胶原蛋白的粘附作用不大。事实上,虽然α1 -(图1 (b))及α3-阻断剂（未显示）同样未能抑制结合，结合α1-及α双功能阻断抗体几乎完全消除了PT45P1与胶原蛋白的粘附(图)1 (b)）.虽然α2-阻断显著抑制PT45P1在胶原上的迁移，联合阻断α1促进增强抑制（图1 (c))进一步证明这些低分化细胞对细胞生长的依赖性降低α重要的是，分化非常差的MIAPaCa2细胞在胶原蛋白上没有粘附或迁移（图1 (b)和1 (c))，与他们缺乏α1,α2整合素表达与以前的报道相似[6]．

３．３．异位表达α2在MIAPaCa2细胞中重现胶原相互作用

由于miapaca2细胞缺乏α2整合素与胶原蛋白不粘附，我们异位表达α2在病毒（巨细胞病毒）启动子下，并在胶原蛋白（MP2）上维持一个群体-α2/CI），以及标准组织培养（MP2）中的一个群体-α2 / TC)(图2（a）).MP2-α2/CI细胞表现出明显的高表达α2整合素表面水平高于MP2-α2/TC细胞(平均FL1 77.0 vs 31.3)(图2（b）)，这种较高的表面表达也反映在转录本上(图)2（c）（i） ）。同样地α2个转染物显示相同β培养物的1个水平，对胶原蛋白的重复通道促进了更高水平的表面β1个亚单位（平均FL1 136.7对79.3）（图2（b）)，可能是由于需要异质二聚体以促进易位α2亚单位到细胞表面。所有细胞表达相同的α3个层次和不足α1表达(数据2（b）和2（c）（i） ），与亲代细胞无法区分（图1(一)）.由于整合素经常被保留在细胞内，观察到的不同的表面表达可能并不反映不同的蛋白质总水平，而是优先输出α2β作为对在胶原基质上持续生长的需求的反应。然而，免疫印迹全细胞裂解液显示明显更多αMP2中的2-α2/CI细胞比MP2-α2/TC电池（图2（c）(2))。这种差异表达不是在初始淘选过程中选择高表达群体的结果，因为两个群体都来自相同的原始淘选过程(图)2（a）).此外，积极监管α2水平暴露于胶原蛋白进一步证明降低α2移除MP2时注意到的表达式-α2/CI，在标准条件下培养，以及通过将细胞重新传代到胶原蛋白涂层的底物上而产生的高表达(图2 (d)(二),(我)。

3．4．微分α2表达促进剂量依赖性胶原蛋白相互作用和抑制侵袭

MP2 -α2/TC和MP2-α2/CI细胞完全依赖整合素α2β1用于粘合胶原蛋白（图3（a）(我))。然而,高α2表达MP2-α2/CI细胞转化为更快速、更完整的胶原粘连(图3（a）(ii))，要求较少的胶原蛋白以达到最大的粘连(图3（a）（iii））。此外，MP2-α2/CI细胞转移到标准的组织培养条件下，显示这种增强的胶原黏附性逐渐丧失(图3（a）（四）。高架桥α2表达和胶原蛋白的粘附性MP2-α2/CI细胞也在胶原蛋白上转化为更高的比例和整体水平的haptotactic migration(图3（b））;然而,MP2,α与MP2相比，2/CI细胞的侵袭率实际上有所降低-α2 /模拟(数字3（c）和3（d）)和MP2 -α2/TC（图3（d））.重要的是，MP2-α2/TC和MP2-α2/CI细胞表现出时间依赖性效应，延长培养时间后可获得更多侵袭抑制，MP2最大减少40%-α2/TC电池，MP2电池>90%-α2/CI细胞与MP2细胞-α2/模拟单元（图3（d））.虽然这些数据和图中所示的数据一样2（c）和2 (d)可以解释为更高的α2仅仅转化为对基质的粘附增强，从而导致侵袭减少，实际上相反，如MP2-α2/TC和MP2-α2 / CI与Matrigel的粘附性实际延迟，而mp2-α2/模拟单元（图3（e））.从抗侵袭作用的时间依赖性可以预测，瞬时表达α2不能阻止亲代MIAPaCa2细胞的侵袭（图3（d），右面板），尽管这些细胞表达相似的表面水平α2, MP2,α2/TC和MP2-α2 / CI细胞（图3 (f))，并表现出显著的从头胶原粘附（图3 (g)）.

3.5。α2调节延迟侵袭的侵袭相关基因产品的表达在体外

数据如图所示3（d）证明长期表达的要求α2整合素达到最大的侵袭抑制作用，而瞬时表达α2对侵袭没有影响。因为这种影响不是由于基质凝胶粘附力增加所致（图3（e）)，这表明需要改变基因表达来影响入侵抑制表型α2.因此，我们进行了Affymetrix全局基因表达分析，以确定受调节的转录物α2表达式(α2 / TC)或α2表达式与本构啮合耦合(α2 / CI)。超过6000个转录本在错误发现率(FDR)≤0.01的情况下差异表达(图)4(一)(i)，补充表S3)。受影响最显著的是kallikrein相关肽酶(KLKs) 5、6和7，它们与细胞迁移和侵袭的调节关系相对不明确。我们验证了这些KLK转录本在MP2-中的上调α2/TC细胞，以及MP2中的加剧表达-α2 / CI细胞（图4(一)(2))。我们进一步通过未转化和良好的良好分化的PDAC细胞系验证了KLK-5,6和7转录物的表达，排除了差异不良的PDAC线（图4(一)(3))。唯一的例外是中度分化的(G2) BxPC3细胞，该细胞不表达可检测到的KLK-5、6或7转录本。在所有病例中，KLK-5、6、7均协调表达;也就是说，要么三个都表达出来，要么没有。Affymetrix证实这些细胞不表达其他KLKs。重要的是，用肽基抑制剂阻断KLK活性可以增强内源性KLK阳性细胞和MP2-的侵袭α2/CI细胞，以排除klk阴性细胞(图4 (b))和KLK阻断对KLK阳性细胞向胶原的触觉迁移有类似的影响（图4 (c)）.

KLK5和KLK6的酶特异性从KLK7显着不同。KLK-5,6和7的特异性的主要决定簇是S1袋，在P1位置展示了主要特异性定义，具有P2位置的额外特异性偏好;出于不同的原因，在定义KLK-5,6和7的特异性时，P3和P4位置相对不重要[13]．因此，KLK5和KLK6表现出胰蛋白酶样的特异性，对底物P1位置的精氨酸有强烈的偏好(KLK5, R fel K，而不是Y或F;KLK7对Tyr在P1位点(Y > A, M . > K)表现出独特的糜蛋白酶样特异性⋙在P2 (Y > L, T, M, F)13]因此，图中使用的肽基抑制剂不太可能4(PFR∣SVQ)会影响KLK7，但该多肽P1位置的精氨酸将是与KLK5和KLK6的底物结合S1口袋结合的相对最佳选择。

基于这些信息，我们进一步通过我们在转录水平验证的细胞谱评估KLK5和KLK6的产量。与它们的RNA谱一致，除BxPC3外，未转化的HPDE和所有良好至中分化的PDAC都表达了大量的KLK5和KLK6(图)5(一个)）.总细胞α2细胞株之间表达相似，类似于图中所示的表面表达1(一)．同样，分化较差的细胞证明KLK5和KLK6均为阴性。我们进一步验证了细胞中KLK5和KLK6的分泌，在整个细胞裂解液水平显示蛋白(图)5 (b)，左面板），以及在MP2中-α2/TC和MP2-α2/CI单元，不包括MP2模拟单元（图5 (b)右面板)。这些数据表明KLK5/6的表达与分级有很好的相关性，是由稳定性驱动的α2在MP2细胞中重新表达，进一步表明α2-适合工程异位KLK表达的阳性细胞（即BxPC3）。

评估KLK参与调节这些细胞的侵入性表型,我们稳定转染BxPC3细胞hKLK5 (Bx / KLK5)或hKLK6 (Bx / KLK6)的控制下通过IRES CMV启动子和链接到一个潮霉素磷酸转移酶基因,这链接hygro-resistance KLK表达式。选择稳定的异质群体，发现与内源性KLK5/6阳性细胞分泌的KLK5和KLK6数量相似(图)5 (c))。对潮霉素耐药的模拟转染（Bx/Mock）细胞不分泌可检测的KLK5或KLK6。我们进一步发现Bx/KLK5细胞表现出减少的细胞凋亡体外入侵（图5 (d)(左图)和向胶原蛋白的haptotactic migration(图5 (d)，右图）与BX /模拟细胞相比。与先前报告的调查结果一致[14]， Bx/KLK6细胞实际上比Bx/mock细胞侵袭更强。重要的是，KLK抑制剂逆转了这两种表型，显示了该抑制剂对KLK5和KLK6作用的特异性和有效性，进一步表明KLK5在该细胞系统中的净效应大于KLK6。我们已经确定KLK5为KLK至少负责部分观察到的抗侵袭表型，我们稳定地转染了α含hKLK5 (MP2/KLK5细胞)或空载体(MP2/mock细胞)的2阴性MP2亲本细胞。选择稳定的异质群体，发现MP2/KLK5细胞分泌的KLK5数量与内源阳性且稳定的Bx/KLK5细胞相似(图)5 (e)).MP2/mock细胞不分泌KLK5，群体也不分泌KLK6。令人惊讶的是，MP2/KLK5细胞并没有表现出减少体外它们的侵袭也不受KLK抑制剂的影响(图)5 (f)).根据这些数据，我们质疑α2表达是KLK5依赖性抗侵袭表型所必需的。值得注意的是，KLK5和KLK6的稳定表达对KLK5的表达没有显著影响αBxPC3中的2（图5 (g)留下的mP2细胞α2-阴性（未显示）。用于确定α2可以挽救KLK5的表型，我们用稳定的MP2/KLK5细胞转染α表达式构造或空向量。48小时后α2-转染的MP2/KLK5细胞表现出与模拟转染细胞相同的侵袭性（图5 (h)，左图）；然而，转染的细胞显示出显著的差异从头向胶原蛋白I迁移(图5 (h)，右面板）。这些数据表明，长期表达α2可能是完整表型所必需的，直接或间接。我们没有评估α2在MP2/KLK5细胞中，自稳定α2的表达会导致KLK-5、6、7的表达上调，如图所示(图)4(一)(2)和5 (b)）.

以往的免疫组化研究未能证明一致的模式α2在PDAC中的表达原位［3.- - - - - -5，7，8]．评估我们对人体状况的调查结果的相关性，我们评估了表达式α2和KLK5在患者样本中广泛存在，包括正常、良好、中等和低分化PDAC。与之前的报告一致，我们发现α2在正常胰腺导管上皮细胞中表达强烈且特异性，包括大小导管和服务腺泡簇的导管(图)6（A） 及6(a))。的表达α2在分化良好的PDAC病变中保持一致（图6(B)和6（b） ）但在分化较差的细胞中逐渐丢失，即使是那些与分化较好的PDAC细胞相邻的细胞（图6(C)和6（c） ）。重要的是，α2-还原/阴性细胞侵入组织包括十二指肠壁(图)6（D） 及6(d))和局部淋巴结(图6(E)和6（e） ），毗邻α2阳性井至中度差异化的PDAC，无法侵入这些结构。实际上，我们观察到没有异质性α2染色正常()及良好/中度分化样本(），我们观察到减少染色α62.5%的低分化样本中有2个(）.与先前的报告一致[15]，我们发现KLK5在正常胰腺的腺泡细胞中有强表达，但在大小导管以及服务于腺泡簇的导管中也有强表达（图6(F)和6(f))。和我们的观察结果相似α2、KLK5在PDAC高分化病变中表达一致(图)6（g）和6(g))，但在分化较差的细胞中逐渐丢失，甚至在分化较好的PDAC细胞附近(图)6（手6(h))。重要的是，连续切片染色显示klk5阳性(图6(I, J))集群的交互细胞也α2-正（数字）6(我),6(j))，而低分化/间变PDAC细胞侵入间质后，KLK5表达显著减少或缺失(图)6(我),6)和(J)α2(图6(我),6（j））。

从机械的观点来看，我们质疑α2负责观察到的基因调控和抗侵入作用。为了解决这个问题，我们生成了一个细胞质缺失突变体(α2δ）并在MIAPACA2细胞中稳定地表达它（MP2-α2Δ)。这些细胞在胶原蛋白上的药物选择下得以维持。类似于MP2,α2/CI细胞，延长MP2-α2Δ细胞在collagenI上产生了比MP2-更好的胶原黏附表型α2/TC电池（图7(一)(我))。补充的α2Δ结构，我们稳定地表达了α9α编码的嵌合体α9胞外和跨膜结构域与胞质结构域相连接α在MIAPaCa2细胞(MP2-α9α2)控制潜在的影响α9外结构域，我们也表达了一个胞质缺失α9（MP2）-α9 dmi)。这些细胞在腱素的重组FNIII结构域(TnFN)的药物选择下被筛选和维持_三,)，一种α9整合素(11].亲代MIAPaCa2细胞缺乏内源性α9整合素表达，不粘附TnFN_三,（未显示）。MP2-α2Δ细胞显示>75%的侵袭抑制，MP2/Mock细胞(图)7(一)（ii）），而MP2-α9α2细胞显示出类似的侵袭抑制，部分表型可能是由于细胞外结构域α9整合素，其自身可促进约43%的侵袭抑制(MP2-α9 dm1)。因此,α在这些细胞中，胞浆结构域可能只负责32%的侵袭抑制。Affymetrix分析MP2-α2Δ和MP2-α9α2个细胞证明了数字中鉴定的许多基因产物4(一)（i） 和补充表S3由以下两种方法进行差异调节：α2 ectodomain (α2Δ）或细胞质结构域(α9α2） ；然而，有些产品不受任何一种结构表达的影响，或者两者都受影响（图7 (b)（i），补充表S4）。重要的是，KLK-5,6和7在MP2中上调α2Δ细胞比较MP2-α9α2细胞(图7 (b)(2))。

这些数据表明KLK的表达受α2整合素，并通过两个参与者的协调输入显示侵袭表型降低。因此，侵袭性极低的COLO357细胞显示KLK阳性（图4(一)(3),5(一个),5 (b))和KLK对入侵的负面影响(图4 (b))也表现出完全依赖α2整联蛋白入侵体外(图7 (c)(我))。BxPC3细胞也表现出完全抑制α2-封锁（图7 (c)(我));然而，他们缺乏KLK-5、6和7的表达(图4(一)(3),5(一个),5 (b))并且不受KLK封锁的影响（图4 (b))，表现为适度体外入侵。相比之下，高度侵袭性Pt45p1和miapaca2细胞表现出依赖的丧失α2、或完全缺乏效果α2-分别封锁入侵（图7 (c)(我))。然而，重要的是MP2-的入侵减少α2/CI细胞完全被抑制α2-blockade。图中显示了KLK5在调控这些表型中的具体作用5．这些参数已经在图中所示的模型中进行了总结7 (c)(ii)。

4.讨论

在这项研究中，我们证明了KLK5的表达受α2整合素和通过双方参与者的协调输入减少入侵表型的表现。因此，我们认为PDAC细胞的入侵至少在一定程度上是一种依赖之间的平衡α2为胶原相互作用，及其KLK5的表达和利用，如图所示的模型总结7 (c)（ii）对病毒的入侵抑制作用α2得到了几条证据的支持α2在细胞内稳态和分化的调节。事实上,α2整合素与维持组织结构有关[16]和正常乳腺上皮细胞的有序增殖[9]，并且在乳腺肿瘤进展过程中发现了广泛的表达缺失原位［17，18]．更重要的是，重新表达α内生的α2-阴性低分化乳腺癌细胞系促进了上皮细胞形态的分化，同时增强了分支形态的形成，恢复了对生长的接触抑制体外减少肿瘤的生长体内［16]．相互抑制α2内源性表达α2阳性高分化乳腺癌细胞以表达依赖的方式延迟分支形态发生[16]．分枝形态发生已被证明是α使用不朽的、非恶性乳腺上皮细胞系的2-依赖型[16]．这些数据表明α2实际上可能是乳腺导管上皮中的一种抑癌因子。

重要的是,高α2表达与几种组织的正常上皮细胞有序增殖有关[9]，以及α2延缓MDCK上皮细胞的囊肿形成和分支形态发生[19]，一致于调节分化的上皮状态的作用。减少α2β1表达也与结肠癌Duke分期显著相关[20].事实上，根据文献回顾，减少了α2表达被认为是上皮性恶性肿瘤中整合素表达最常见的单一变化[16]．另一方面，α2表达与晚期黑色素瘤患者生存率低有关[21),而α2β1信号传导促进人前列腺癌细胞在骨内的生长[22，突出的复杂性α2β1在肿瘤生物学中的作用。事实上,高α2的表达促进了胶原蛋白的粘附和迁移，以及骨肉瘤细胞的侵袭;然而，异位表达α2不支持这些细胞在动物体内的生长[23]．在PDAC,α2β在正常和分化良好的肿瘤中观察到1的表达，尽管普遍缺失α2β1在进展更为严重的病变中未见表达的报道就地，亚细胞定位的表达减少和/或变化已被描述[3.- - - - - -5，7，8]在此，我们证明了表达减少和/或缺乏α2被分化较差的PDAC细胞所感染相对常见原位这通常发生在相邻的强α2阳性更分化的PDAC细胞。更重要的是,我们的体外这些发现为这样一个事实提供了一个潜在的解释，即这种普遍的表达缺失并没有得到更一致的报道α2整联蛋白可能不指示其利用率，如差异化的PT45P1细胞所指出的那样，它们保持强烈α2表达，但不依赖于它的胶原相互作用或侵袭。

虽然α2被认为是乳腺癌的潜在肿瘤抑制因子，但尚未明确显示其调节浸润本身．在我们的系统中，重新表达α2整合素促进与胶原的相互作用，然而这种再表达实际上减少了细胞侵袭体外．这种表型，以及伴随基因表达的变化而产生的稳定α2的表达，在培养的胶原蛋白上的细胞的维持会加剧，胶原蛋白是暴露于PDAC显著的粘结物特征的替代物原位．值得注意的是，尽管胶原蛋白的维持已被证明上调总胆固醇α内源性的2个层次α2阳性PDAC细胞先前[24，动态调节α2在稳定的mp2中观察到的表达α2转染子对胶原蛋白培养的反应不可能是内源性启动子转录的结果，因为Affymetrix分析未能确定α2在任何细胞中的表达(转基因结构缺乏3^＇-UTR序列用作分析中的探针）。因此，蛋白质周转或类似的机制可能是造成这种改变的原因α2观察到的水平。更重要的是，尽管净细胞表型似乎是一种剂量依赖效应(即与α2层单元），数据如图所示2 (d)(ii)清楚表明αMP2中的2个级别-α从胶原蛋白培养中去除的2/CI细胞已恢复到MP2-中观察到的细胞α2/TC细胞在丧失前的浸润差异如图所示3（a）(iv)这表明对表型的影响更为复杂，而不仅仅是由于α2表达水平。此外，我们没有发现任何变化α1，α3.α10、α11 .表情因二者任一而稳定α2表达，或细胞与胶原蛋白的长期相互作用，如图所示2（c）(i)及Affymetrix结果。因此，观察到的表型很可能是α2、下游事件依赖持续α2表达和/或参与。

从力学上看,失去α2通过低分化的PDAC细胞将释放其原发部位富含胶原的粘结力，并可能允许细胞侵入周围，而不是通过富含胶原的基质。这种潜在的无意识能力可能模拟在伤口区域的再上皮化过程中角质形成细胞的能力。静止和活化的角化细胞都缺乏αvβ3整合素表达，因此不与纤维蛋白或纤维蛋白原相互作用[25]．这提供了一种机制，促进它们通过富含胶原蛋白的真皮伤口边缘和富含纤维连接蛋白的肉芽组织迁移和侵袭纤维蛋白凝块周围，而不是进入。在这种情况下，纤维蛋白的抗粘附特性提供了基本机制，即侵入的表皮从愈合的伤口中剥离纤维蛋白凝块，从而形成结构恰当的表皮来代替伤口愈合。以一种类似的，虽然可能是无序的方式，高侵入性，低分化，α因此，2阴性PDAC细胞可能会忽略胶原基质，而与其他成分相互作用，如laminin-5 (laminin-332)，这已被证明调节胰腺肿瘤细胞的迁移[26]．类似的机制已经被证实，成纤维细胞沿着纤维连接蛋白导管从胶原基质转移到纤维蛋白凝块临时基质[27].事实上，我们观察到粘附改变（图3 (g)）迁移（未显示）非α这些细胞中有2种基质蛋白，与这种机制一致。

值得注意的是，KLK-5,6和7表达式是协调的α2在PDAC系统中。在所有情况下，没有其他klk受到影响，所有3个klk都以相同的方式受到监管。事实上，检测的PDAC细胞系显示了这些klk的全部或全部表达，表明KLK-5、6和7的表达可能至少部分参与了协调调控α2.KLK表达依赖于细胞和组织[28]尽管KLK6和KLK7被认为可以促进肿瘤细胞的侵袭[14，29，30]，在前列腺中观察到KLK5的丢失[31)、肺(32]，胸部[33]睾丸[34]，以及肾癌组织[35，与我们在此提供的PDAC数据类似。基于KLK5在侵袭性较差的PDAC细胞系中表达的事实，KLK阻断增强了KLK阳性细胞的侵袭性而排除了KLK阴性细胞，以及KLK5异位表达减少了内源性的侵袭性和胶原迁移α2-阳性PDAC细胞，KLK5似乎在PDAC系统中以抗侵袭的方式发挥作用。从机制上讲，KLK5对侵袭的负面影响可能反映了其对迁移的负面影响，因为KLK阻断促进了KLK5阳性细胞增强的胶原迁移（图4 (c)）.

重要的是，KLK5在MP2中上调-α2Δ细胞比较MP2-α9α2个细胞，表明至少部分的侵袭抑制功能α2-外结构域是通过调节KLK5的表达和α胞质结构域通过调节其他介质来延缓细胞入侵。而α2细胞质结构域对于乳腺癌细胞粘附胶原是不可缺少的[36]我们没有观察到这种影响，MP2也没有-α2Δ细胞显示胶原迁移延迟（未显示）α然而，EGF诱导的乳腺上皮细胞在胶原上的趋化性迁移需要2-细胞质结构域[37]．因此，在我们的系统中测量到的胶原蛋白的触觉定向反应很可能与驱动的生长因子输入无关α乳腺癌细胞中的2-胞浆结构域依赖性趋化迁移。

尽管我们证明了α2是PDAC细胞中特异性的侵袭调节剂，有证据表明α整合素可能在其他方面作为恶性肿瘤的负调节因子。的确,α2信号传导使缺乏基质相互作用的MCF-7和HepG2细胞对程序性细胞死亡敏感[38，表示损失α2可能对正在扩散到基质相互作用可能不一致的新组织环境中的肿瘤细胞有益。机制上，ErbB2和v-ras介导的下调α2-整合素的表达已被证明需要Sp1转录因子在人乳腺上皮细胞中[39]，这是一个与乳腺癌中观察到的组织结构破坏有关的事件。之前我们证明了syk酪氨酸激酶的缺失与进展为低分化级PDAC相关体外和原位［12]．Syk已被证明在乳腺癌细胞中调节Sp1转录因子的活性;因此，syk的缺失可能使乳腺上皮细胞易受erbb2介导的下调α2整合素，导致进一步的进展途径。ErbB2也与PDAC恶性肿瘤有关[40];因此，可能是syk依赖的sp1调控α2整合素表达可作为PDAC进展的开关。因为超过6000份转录本受到了严重影响α在我们的系统中，这种转变的后果可能是巨大的。

根据以前的出版物α2整合素明显参与介导良好分化至中度分化的PDAC细胞的胶原相互作用，事实上，已被建议介导这些细胞的恶性肿瘤[6].然而α2整合素似乎介导了胶原的粘附和某些细胞的迁移α2阳性PDAC细胞，我们提供的证据是依赖于α2整合素在PDAC“去分化”过程中逐渐丢失α2-阴性/独立细胞显示较高的体外在动物中传播的远比在动物中传播的远α2-依赖对应[10，41]，我们建议丧失α2表达或利用可促进PDAC的侵袭表型，至少部分通过调节KLK5的表达α2介导的与入侵和传播相关的基因产物的调控表明α2可能通过直接和间接机制影响肿瘤进展。在这些发现的基础上，将进一步研究这两种途径以及整合素在原位动物模型中调控PDAC传播的作用。

缩写

BSA:	牛血清白蛋白
荷航：	Kallikrein-related肽酶
MP2:	米亚帕卡2
PDAC：	胰腺导管腺癌
科幻小说:	无血清。

致谢

S.Silletti是美国癌症协会研究学者，由ACS RSG-05-116-01-CSM和NIH CA130104和CA109956号拨款资助。S.Goodison由NIH CA108597资助。

补充材料

参考文献

1. 国家癌症研究所应对胰腺癌进展审查小组建议的战略计划，2002年PANC-PRG实施计划。
2. N.Bardeesy和R.A.DePinho，“胰腺癌生物学和遗传学，”自然评论癌症，第2卷，第12期，第897-9092002页。视图:出版商网站|谷歌学者
3. S.Linder、E.Castaños Velez、A.Von Rosen和P.Biberfeld，“胰腺癌细胞外基质蛋白和粘附分子的免疫组织化学表达，”肝胃肠病学，第48卷，第48期41页，1321-1327,2001。视图:谷歌学者
4. A.Rosendahl、K.Neumann、B.Chaloupka、M.Rothmund和R.J.Weinel，“胰腺中VLA受体的表达和分布：免疫组织化学研究，”胰腺，第8卷，第2期6，第711-718页，1993。视图:谷歌学者
5. P. A. Hall, P. Coates, N. R. Lemoine，和M. A. Horton，“正常和肿瘤人类胰腺整合素链的特性”，病理学杂志，卷。165，没有。1，pp。33-41,1991。视图:出版商网站|谷歌学者
6. J. J. Grzesiak和M. Bouvet，《Theα2β整合素介导胰腺癌细胞系I型胶原的恶性表型英国癌症杂志，第94卷，第9期，第1311-1319页，2006年。视图:出版商网站|谷歌学者
7. M. Löhr, B. Trautmann, M. Göttler等，“人胰腺导管腺癌细胞外基质蛋白受体的表达和功能”，胰腺，第12卷，第3期，第248-259页，1996年。视图:谷歌学者
8. Shimoyama、F.Gansauge、S.Gansauge、T.Oohara和H.G.Beger，“与正常胰腺相比，慢性胰腺炎和胰腺癌中细胞外基质分子及其受体的表达改变，”国际胰脏学杂志第18卷第2期3，第227-234页，1995。视图:谷歌学者
9. M.M.Zutter和S.A.Santoro，“肿瘤的广泛组织学分布α2β1整合素细胞表面胶原受体美国病理学杂志第137卷第1期1，第113-120页，1990。视图:谷歌学者
10. M. Bouvet, M. Yang, S. Nardin等人，“人体胰腺肿瘤原位模型的时间特异性转移靶向”，临床和实验转移，第18卷，第3期，第213-218页，2000年。视图:出版商网站|谷歌学者
11. B. A. Young, Y. Taooka, S. Liu等，“整合素的细胞质结构域α9亚基需要配合蛋白帕罗西林来抑制细胞扩散，但以帕罗西林不依赖的方式促进细胞迁移。”细胞的分子生物学，卷。12，不。10，pp。3214-3225,2001。视图:谷歌学者
12. T. Layton, C. Stalens, F. Gunderson, S. Goodison, and S. Silletti，“Syk酪氨酸激酶通过调节细胞生长和侵袭作为胰腺腺癌肿瘤抑制因子”美国病理学杂志，第175卷，第6期，第2625-26362009页。视图:出版商网站|谷歌学者
13. M.Debela，N.Beaufort，V.Magdolen等人，“人激肽释放酶相关肽酶KLK 4、5、6和7的结构和特异性，”生物化学，第389卷，第2期。6，第623-632页，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
14. B.Klucky，R.Mueller，I.Vogt等人，“激肽释放酶6诱导E-钙粘蛋白脱落并促进细胞增殖、迁移和侵袭，”癌症研究，第67卷，第5期17，页8198-8206,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
15. Y. Dong, N. Matigian, T. J. Harvey, H. Samaratunga, J. D. Hooper, and J. A. Clements，“kallikrein相关肽酶基因KLK5和KLK7的组织特异性启动子利用和编码蛋白的细胞定位提示外分泌胰腺功能的作用”，生物化学，第389卷，第2期。2，第99-109页，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
16. M. M. Zutter, H. Sun, and S. A. Santoro，“整合素表达改变和恶性表型:多重整合素受体的贡献”，乳腺生物学与肿瘤杂志，第3卷，第2期，第191-200页，1998年。视图:谷歌学者
17. D.Alford，P.Pitha Rowe和J.Taylor Papadimitriou，“乳腺癌中的粘附分子：细胞凋亡的作用。”α2β我整合素。”生物化学学会研讨会，第63卷，第245-2591998页。视图:谷歌学者
18. M. M. Zutter, G. Mazoujian, and S. A. Santoro，“整合素黏附蛋白受体在乳腺腺癌中的表达减少”，美国病理学杂志第137卷第1期4，第863-870页，1990。视图:谷歌学者
19. E.U.M.Saelman，P.J.Keely和S.A.Santoro，“MDCK细胞的丢失”α2β整合素的表达导致囊肿形成减少，肝细胞生长因子/分散因子诱导的分支形态发生失败，凋亡增加。细胞科学杂志，第108卷，第11期，第3531-3540页，1995年。视图:谷歌学者
20. K.Koretz，P.Schlag，L.Boumsell和P.Moller，“VLA的表达-α2, VLA -α6和vla-β1正常结肠粘膜和腺瘤中的链，以及结肠癌及其肝转移瘤中的链，“美国病理学杂志，第138卷，第3期，第741-750页，1991年。视图:谷歌学者
21. M. Vuoristo, P. Vihinen, T. Vlaykova, C. Nylund, J. Heino，和S. Pyrhönen，“胶原受体整合素基因表达水平的增加与晚期黑色素瘤患者生存参数的降低相关。”黑色素瘤研究，第17卷，第4期，第215-223页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学者
22. C.L.Hall、J.Dai、K.L.Van Golen、E.T.Keller和M.W.Long，“I型胶原受体(α2β1）信号传导促进骨内人前列腺癌细胞的生长，“癌症研究，卷。66，没有。17，pp。8648-8654，2006。视图:出版商网站|谷歌学者
23. P.Vihinen、T.Riikonen、A.Laine和J.Heino，“整合素α2β1在致瘤性人骨肉瘤细胞系中通过与I型胶原的相互作用调节细胞的粘附、迁移和侵袭。细胞生长与分化，第7卷，第4期，第439-447页，1996年。视图:谷歌学者
24. A. Menke, C. Philippi, R. Vogelmann等，“胰腺癌细胞系中I型胶原和III型胶原下调E-cadherin基因表达”癌症研究第61卷第1期8, pp. 3508 - 3517,2001。视图:谷歌学者
25. M.Kubo，L.Van De Water，L.C.Plantefaber等人，“纤维蛋白原和纤维蛋白对角质形成细胞具有抗粘附作用：纤维蛋白焦痂在伤口修复过程中脱落的机制，”皮肤病学研究杂志，第117卷，第6期，第1369-13812001页。视图:出版商网站|谷歌学者
26. T.Tani，A.Lumme，A.Linnala等人，“胰腺癌沉积层粘连蛋白-5，最好粘附在层粘连蛋白-5上，并在新沉积的基底膜上迁移。”美国病理学杂志号，第151卷。5，第1289-1302页，1997。视图:谷歌学者
27. D. Greiling和R. a . F. Clark，“纤维连接蛋白为纤维母细胞从胶原间质转移到纤维蛋白凝块临时基质提供了通道，”细胞科学杂志，卷。110，没有。7，PP。861-870,1997。视图:谷歌学者
28. G.Pamplakis和G.Sotiropoulou，“正常生理学和癌症中的组织激肽释放酶蛋白水解级联途径，”生物化学与生物物理学，卷。1776年，没有。1，pp。22-31,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
29. W. C. Wolf, D. M. Evans, L. Chao，和J. Chao，“一种合成的组织激肽酶抑制剂抑制癌细胞侵袭，”美国病理学杂志第159卷第1期5，页1797-1805,2001。视图:谷歌学者
30. S. K. Johnson, V. C. Ramani, L. Hennings和R. S. Haun，“Kallikrein 7通过脱落E-cadherin来增强胰腺癌细胞的侵袭，”癌症，第109卷，第2期。9，页1811-1820,2007。视图:出版商网站|谷歌学者
31. G. M. Yousef, A. Scdorilas, A. Chang等，“前列腺癌组织中人类促生因子基因5 (KLK5)的下调”，前列腺癌第51卷第1期2，页126 - 132,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
32. C. Planque，M.蒙，S. Guyetant等人，“KLK5和KLK7，人类激肽释放酶组织家族的两个成员，被差异在肺癌中表达，”生物化学和生物物理学研究通讯第329卷第2期4, pp. 1260-1266, 2005。视图:出版商网站|谷歌学者
33. G.M.Yousef、G.M.Yacoub、M.E.Polymeris、C.Popalis、A.Soosaipillai和E.P.Diamandis，“乳腺癌中的激肽释放酶基因下调，”英国癌症杂志，第90卷，第1期，第167-172页，2004年。视图:出版商网站|谷歌学者
34. G.M.Yousef、C.V.Obiezu、K.Jung、C.Stephan、A.Scorilas和E.P.Diamandis，“激肽释放酶基因5在癌组织和正常睾丸组织中的差异表达，”泌尿科，第60卷，第4期，第714-718页，2002年。视图:出版商网站|谷歌学者
35. C.D.Petraki，A.K.Gregorakis，M.M.Vaslamatzis等人，“肾细胞癌中人激肽释放酶5、6、10和11免疫组化表达的预后影响，”肿瘤生物学第27卷第2期1，页1 - 7,2005。视图:出版商网站|谷歌学者
36. 王浩，盖魁，杨旭等，“社会责任的作用”α1,α2整合素胞浆结构域在细胞形态、运动性和对蛋白激酶C途径刺激的响应中的作用细胞粘附与通讯，第7卷，第4期，第281-297页，2000年。视图:谷歌学者
37. P. A. Klekotka, S. A. Santoro, H. Wang，和M. M. Zutter，“在α2整联蛋白亚细胞质细胞质域通过不同的MAPK途径调节迁移和细胞周期进展，“生物化学杂志第276卷第2期34，页32353-32361,2001。视图:出版商网站|谷歌学者
38. N. I. Kozlova, G. E. Morozevich, N. A. Ushakova, M. E. Preobrazhenskaya, A. A. Shtil, and A. E. Berman， " The role ofα2β1整合素在乳腺癌和肝癌细胞锚定依赖性凋亡中的作用，“独家杂志，第6卷，第145-151页，2007年。视图:谷歌学者
39. J.Ye，R.H.Xu，J.Taylor Papadimitriou和P.M.Pitha，“Sp1结合在Erb-B2和v-ras介导的细胞凋亡下调中起着关键作用α2-整合素在人乳腺上皮细胞中的表达分子与细胞生物学，第16卷，第11期，第6178-6189页，1996年。视图:谷歌学者
40. M. Komoto, B. Nakata, R. Amano等，“HER2过表达与胰腺癌根治性切除后的生存相关，”癌症科学号，第100卷。7, pp. 1243-1247, 2009。视图:出版商网站|谷歌学者
41. P. Loukopoulos, K. Kanetaka, M. Takamura, T. Shibata, M. Sakamoto, S. Hirohashi，“来自细胞系和原发肿瘤并显示不同转移活性的胰腺腺癌原位移植模型，”胰腺，第29卷，第3期，第193-203页，2004年。视图:出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2011 Chia-Yao Lee et al。这是一篇发布在知识共享署名许可协议如果正确引用了原始工作，则允许在任何媒体中的不受限制使用，分发和再现。