食用富含花青素的桑椹果冻与高脂肪餐一起减少血脂异常患者餐后血清心脏代谢危险因素

摘要

据报道，浆果中的花青素含量可以促进抗氧化特性，从而减少非传染性疾病的发生。然而，只有少数研究调查了从桑椹果中提取的富含花青素的食品对降低血脂异常患者的心脏代谢危险因素的益处。以桑椹果粉为原料，配制富花青素桑椹果果冻，研究其对血脂异常患者血清心脏代谢危险因素的影响。清迈桑椹作为MFP果冻的原料，每一份(170克)含有14克MFP(191毫克花青素)。为了研究MFP果冻对降低心脏代谢危险因素的作用，16名血脂异常患者连续7天每天服用一份MFP果冻。MFP凝胶干预后，受试者空腹胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)、炎症标志物白细胞介素-6水平均显著降低。在MFP果冻干预前后，分别在进食高脂肪餐后0-240分钟测量餐后血液参数。餐后30分钟血糖( )和胰岛素在60和90分钟( )MFP低于安慰剂果冻MFP胶组胰岛素曲线下面积比安慰剂组小31.2%。因此，MFP果冻干预增加了胰岛素敏感性。对于抗氧化活性指标，MFP果冻干预后的餐后氧自由基吸收能力在高脂肪膳食摄入后比安慰剂果冻干预后的下降幅度更小。此外，在氧化应激指标方面，MFP果冻的餐后丙二醛水平显著降低。在7天的干预中，一份含有191毫克花青素的MFP果冻通过降低血液总胆固醇、低密度脂蛋白和炎症，改善胰岛素敏感性和餐后血液抗氧化应激活性，降低了心脏代谢危险因素。这个试验注册在TCTR20200415003．

1.介绍

心脏代谢危险因素是指增加血管疾病和糖尿病风险的条件。这些情况可聚集为代谢综合征，包括腹部肥胖、高血压、高血糖、甘油三酯和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇升高，以及低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、胰岛素抵抗、吸烟和炎症标志物[1]．氧化应激的增加与多种心脏代谢风险因素有关[2]．过量的营养，如过量的葡萄糖，脂质和热量的摄入，诱导自由基在餐后期间增加。脂质过氧化由多不饱和脂肪酸和自由基氧化产生丙二醛(MDA)作为副产物。据报道，肥胖、代谢综合征(MetS)和2型糖尿病(T2DM)患者体内MDA含量增加[3.]．更激烈的提高氧化损伤表现为高脂血症和高血糖症，影响抗氧化状态[4]．富含多酚的水果干预和餐后研究也显示了对氧化应激和炎症的保护作用[5]．

桑椹（桑白皮）含有多种维生素，多酚（包括类黄酮，花青素和类胡萝卜素），碳水化合物，纤维，矿物质，核黄素，抗坏血酸，烟酸，和必需脂肪酸[6- - - - - -8]．这些化合物被认为具有抗高血糖等健康相关特性[9,降血脂药10.),抗氧化剂(11.]，以及抗炎活动[12.]．对富含花青素的浆果的研究已经报道了不同干预时期对心脏代谢危险因素的保护作用。据报道，599 mg剂量的花青素影响餐后血糖，而132和320 mg剂量的花青素没有任何变化[13.]．Intake of blackcurrant powder with 138.6 mg of anthocyanin by seventeen healthy participants was observed for seven days, and results showed reduced glucose and insulin response [14.]．不过，也有关于丰富的花青素的桑果产品在血脂异常的受试者心脏代谢风险因素带来的好处的报道。

因此，从桑树功能性食品，以减少心脏代谢病的风险应该进行调查。果冻是所有年龄组中最喜欢的甜点，以及制作果冻的过程保留成熟的果实，增加附加价值，最终产品。桑果粉（MFP）冻胶状物配制消费者可接受性以及可用于检测重复摄入过度对心血管代谢危险因素为期7天的效果。餐后血糖抗氧化剂，血糖和血脂水平，和炎性标志物与血脂异常的受试者禁食一起测量。

2。材料和方法

2.1。人学

这项研究涉及人类受试者，以及根据赫尔辛基宣言中规定的指导原则是进行。所有涉及人体对象的程序经机构审查委员会批准。这保护的权利，并在Mahidol大学中央研究所审查委员会的主持下进行调查研究人类受试者的福利（COA没有。MU-CIRB 2018 / 139.1007）。所有受试者参加之前的书面知情同意书。

２.２.利用泰国桑椹果粉研制富含花青素的桑椹果冻

2.2.1。原材料

桑椹(Morus alba var. Chiang Mai)取自泰国Kamnulchul Farming Co.， Ltd.。将成熟的果实冷冻干燥，获得桑椹果粉(MFP)，并在−20°C真空铝箔袋中保存至需要时。其他用于制作果冻的成分包括角叉胶、刺槐豆胶、魔芋、三氯蔗糖和柠檬酸(Chemipan Corporation Co.， Ltd.， Thailand)。

2.2.2。富花青素桑椹果冻的制备

果冻由软质和硬质两种不同的质地组成。富含花青素的桑椹果冻成分见表1．果冻的制备过程如图(图)所示1)．首先，将胶凝剂与水混合制成质地坚硬的果冻。将混合物在80°C下加热并搅拌20分钟，直到它变得清晰。将桑椹果粉(MFP)溶于水，与柠檬酸、三氯蔗糖一起加入澄清溶液中。分散体在80°C下重新加热约3分钟。为了获得理想的凝胶稠度，当粘性分散体的产率达到100 g时判断终点。然后将分散液倒入方形模具中，冷却至4°C 24 h。将质地坚硬的果冻切成15 × 15 × 10 mm的立方体形状。然后，用类似的方法制备质地柔软的果冻。最后将质地较硬的果冻50g加入与质地较软的果冻(120g)相同的模具分散液中，4℃静置24 h。

2.2.3。营养价值

水分含量、灰分、蛋白质、脂肪、碳水化合物、不溶性和可溶性膳食纤维、糖采用AOAC(2016)标准方法测定[15.]．基于蛋白质，脂肪和碳水化合物的含量计算热量含量。

2.2.4。总酚酸含量和抗氧化活性

果冻样品使用Heto Powerdry PL9000冷冻干燥机(丹麦Allerod的Heto Lab Equipment)在−80°C下冻干48小时。使用搅拌机(TEFAL 400 Watt from TEFAL Co.， Ltd, France)将干燥的果冻样品均质成粉末，并在−20°C下储存在真空铝箔袋中。提取方法是将大约50 mg样品与1 mL 70%甲醇混合。用旋涡混合器充分混合1分钟后，在50°C的水浴中加热2小时。用4°C离心机(型号Hettich ROTINA 38R, Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany)收集上清，转速4,600 rpm，持续15分钟。上清液用0.45滤液过滤μ.m PES过滤器，并保持在−20°C，直到需要分析。总酚含量(TPCs)用Folin-Ciocalteu试剂测定，表示为样品每克干重没食子酸当量(mg GAE/g DW) [16.，17.]．使用2,2’-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除能力、氧自由基吸收能力(ORAC)和铁离子还原抗氧化能力(FRAP)测定抗氧化活性[18.- - - - - -20.]．结果以每克干重的Trolox当量(TE/g DW)表示。

2.2.5。花青素

使用HPLC分析进行花青素和花青素的鉴定，如Suttisansanee等，2020，2020 [21.]．花青素标准品包括cyanidin-3- o -glucoside (kuromanin)， cyanidin-3- o -rutinoside (keracyanin)， cyanidin-3,5- o -二葡萄糖苷(cyanin)， cyanidin-3- o -半葡萄糖苷(idaein)，天竺葵苷(pelargonin)， malvidin-3- o -半葡萄糖苷(primulin)， petunidin-3-O-glucoside，花青素标准品包括cyanidin, delphinidin，天竺葵苷、芍药苷、芍药苷和malvidin购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)。通过保留时间和紫外-可见指纹图谱与标准品的比较，鉴定了花青素和花青素的存在和含量。

2.2.6款。感官评价

采用9点享乐量表(1 =极度厌恶到9 =极度喜欢)对果冻样品进行感官评价。此外，一个恰到好处的尺度(1 =太少，3 =差不多，5 =太多)被用来考虑果冻的特定属性的强度，如甜和酸。一个由30名评委组成的小组对产品的感官参数进行了评估，包括外观、颜色、气味、风味、质地和总体接受度。10克MFP果冻装在有盖的透明塑料杯里[22.]．

２.３.富花青素桑椹果粉(MFP)果冻干预7天对血脂异常患者餐后血液心脏代谢危险因素的影响:MFP果冻干预前后分析的开放标签试验

2.3.1。受试者和研究设计

一项开放标签试验进行了七天的干预和前后分析。15名血脂异常志愿者(总胆固醇>200 mg/dl;LDL胆固醇>130 mg/dL;高密度脂蛋白胆固醇<40 mg/dL(男性)和<50 mg/dL(女性);甘油三酯>150 mg/dL)参与(图1)．排除标准包括体重指数(BMI) > 35kg /m2，吸烟者，高体力活动的运动员(> 3000千卡/天)，糖尿病，多种过敏，肠道疾病，或任何其他疾病或情况，会恶化依从性的测量或治疗。

2.3.2。测试餐

一顿652千卡的高脂肪餐包含了每日能量脂肪分布的32%。测试餐包括肉丝、沙拉奶油羊角三明治、两片(75克)鸡肉香肠和250毫升加糖饮料。碳水化合物:蛋白质:脂肪的能量分布为29:11:60。使用inmucal -营养素计算机程序第3版(INMU，泰国)分析高脂肪膳食的营养成分。

2.3.3。血液收集

由注册护士静脉采血10ml。在第一次摄入高脂餐(随后是MFP果冻)后的0(基线)、30、60、90、120、180和240分钟服用血糖、胰岛素、血脂和抗氧化剂。血液样本以3500 rpm离心15分钟。血浆和血清收集到小瓶中，在−80°C下保存，直到需要进一步研究。

2.3.4。血液化学

血糖，胰岛素和血脂包括甘油三酯，总胆固醇，高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）在曼谷的医学实验室有限公司进行了分析

2.3.5。血浆抗氧化，氧化应激和炎症标志物

用EDTA作为抗凝剂测定血浆氧自由基吸收能力(ORAC)。用0.1 M磷酸盐缓冲盐水稀释血浆。协议的下一步遵循Ou等人先前描述的方法[19.]．结果用mol TE/L法测定。丙二醛(MDA)测定方法改编自[23.]．样品与20%三氯乙酸(TCA)按1:1的比例在涡流混合器中充分混合30秒，室温孵育15分钟。然后将混合物在12,000 g离心4分钟。上清液与硫代巴比妥酸(TBA) 0.8 (w/v)混合，100℃煮沸30 min。用酶标仪在530的激发波长下检测。计算MDA值并以nmol/L表达。炎症标志物如IL-6通过酶联免疫吸附法测定，使用配对抗体从eBioscience公司(San Diego, CA, USA)购买。

２.４.统计分析

数据以平均值±SD表示。对对照和MFP果冻的生物活性物质和抗氧化活性进行学生t检验。采用配对t检验分析MFP果冻干预前后的空腹血糖、胰岛素和血脂水平。使用重复测量方差分析计算胰岛素、甘油三酯和葡萄糖变化曲线下的面积。采用配对t检验分析干预前后曲线下面积的变化。使用SPSS第19版(美国芝加哥)进行计算和统计分析。统计学意义在值< 0.05。

结果

３．１．利用泰国桑椹果粉研制富花青素果冻

3.1.1。感官评价

富含花青素的MFP果冻(170克)，其中软果冻120克，硬果冻50克。表格2显示了由30名未经训练的专家评估的MFP果冻的感官评价分数。MFP果冻的感官评分在7.67-7.83之间(一般喜欢到非常喜欢)。5分恰到好处的量表也表明MFP果冻的甜度和酸味强度恰到好处。

3.1.2。MFP果冻的营养价值

营养值报告在能源，水分，蛋白质，总脂肪，总碳水化合物，膳食纤维（可溶和不可溶），总糖和灰分的MFP果冻的方面（表3.)．能量、蛋白质、碳水化合物、膳食纤维(可溶性和不可溶性)和糖的含量分别为66.16、1.84、14.71、4.20、2.74和4.56 g / 170 g。然而，该产品中没有发现脂肪含量。此外，根据2000卡路里的饮食、50克蛋白质、65克脂肪、300克碳水化合物、25克膳食纤维和25克糖，计算出MFP果冻日摄入量的百分比分别为3、4、0、5、17和7%。

3.1.3。MFP果冻花色苷、酚类化合物及其抗氧化活性

表格4示出了花色素苷和酚类化合物以及控制和MFP果冻的抗氧化活性。结果发现，MPF果冻包含显著较高的总酚含量（的TPC）和比果冻控制抗氧化活性。此外，在果冻的控制没有发现花青素。TPCs, antioxidant activities by DPPH radical scavenging, FRAP and ORAC assays, and total anthocyanin of MFP jelly were 21.34 mg GAE/g DW, 1.20 μ.mol TE/100 g DW, 127.68μ.mol TE/100 g DW, 67.77μ.mol TE/100 g DW, 12.76 mg/g DW4)．更多的over, results showed that MFP jelly consisted of cyanidin-3-glucoside (C3G), cyanidin-3-rutinoside (C3R), and cyanidin at 7.40 mg/g DW, 5.36 mg/g DW, and 1.31 μ.克/克DW，分别为（补充图1和2)．根据计算，每一份(170克)MFP果冻含有191毫克花青素。

３．２．桑椹果粉(MFP)制作的富含花青素果冻(MFP)干预7天对血脂异常患者餐后血液心脏代谢危险因素的影响:一项使用MFP果冻干预并进行事后分析的开放标签试验

3.2.1之上。受试者在基线时的特征

十五血脂异常患者（N= 15)。男性7人，平均年龄32.6岁。体重指数均值和标准差为23.46±3.26 kg/m2。经过7天的MFP果冻干预(191mg花青素/天)，受试者的BMI没有变化。此外，在MFP果冻干预的7天前后，能量摄入量和大量营养素摄入量没有变化。在MFP果冻干预期间，饱和脂肪酸摄入量显著增加(数据未显示)。

3.2.2。MFP果冻干预7天后对血液心脏代谢危险因素的影响

MFP凝胶干预7天后，胆固醇和低密度脂蛋白显著降低7%和10%，呈下降趋势分别在0.003和0.001，值。在炎症标记物而言，IL-6水平是MFP果冻消费的下部后7天（表5)．

3.2.3。高脂餐后MFP果冻干预对餐后血糖、胰岛素和血脂的影响

在之前一天和后高脂肪食物的消耗后观察MFP果冻干预，餐后血糖，胰岛素和甘油三酯的七天。All subjects ingested a 170 g placebo jelly (on the day before MFP jelly intervention) and a 170 g MFP jelly (on the day after seven days of MFP jelly intervention). The placebo jelly contained 10 g of available carbohydrate which was the same amount as the MFP jelly. Comparison between the placebo and MFP jelly groups showed that blood glucose level was significantly lower in the MFP jelly group at 30 min (= 0.027)(图1)．Mean insulin level in the MFP group was significantly lower when compared to the placebo group at 60 and 120 min (价值s = 0.001 and 0.002, respectively) (Figure2)．有趣的是，当胰岛素敏感性由AUC计算分析，产生更小的AUC比安慰剂组果冻在MFP果冻组由31.22％差异有统计学意义（值< 0.001)。观察MFP果冻对餐后甘油三酯的影响。两组甘油三酯均在120 min后升高，240 min后下降。然而，没有观察到统计学上的显著差异(图3.)．

3.2.4。高脂膳食后MFP果冻对餐后抗氧化活性和氧化应激的干预作用

MFP果冻干预的七天显示出对餐后血液中的氧自由基吸收能力（ORAC）水平的变化（具有强烈的影响图4)．从ORAC测定抗氧化活性水平在安慰剂和高脂肪膳食消耗之后MFP果冻组降低。在这两个组中观察到相对于基线甲餐后变化。后90 min, the MFP jelly intervention group showed a smaller decrease in antioxidant ORAC level than the placebo group (值< 0.05)。通过MDA浓度(MDA)测定分析氧化应激(图5)，两组食用高脂餐后MDA水平均升高。然而，与安慰剂组相比，MFP果冻组在所有时间点上MDA水平的增加都较小。

根据您的卡路里需求，您的日常值可能更高或更低。蛋白质，总脂肪，总碳水化合物，膳食纤维和糖分别不小于50g，65g，300g，25g和25g。

4。讨论

MFP果冻含有14克的MFP(191毫克花青素)每一份大小(170克)是消费者可以接受的。此外，根据甜度和酸味强度的测定结果，三氯蔗糖和柠檬酸的添加量为最佳。这个结果在预料之中，因为三氯蔗糖是一种无营养的甜味剂，对苦味的余味没有影响，而柠檬酸可以帮助抑制苦味[24.，25.]．因此，MFP果冻用来证明产品对血脂血症受试者中的后造成的心脏病危险因素的影响。根据公共卫生部的通知，No.182（B.E.2541）关于营养标签，可以将MFP果冻声明为低热量产品，因为能量含量低于每100g固体食物40千卡。该结果是由于产品中的替代素。Sucalalose味道如糖，余味没有令人不快或苦味，并且是无可扰动的，无可动脉的，并验证人类消费的安全[26.，27.]．此外，MFP果冻还可以被称为富含/高纤维，因为每100千卡的纤维量超过6克。这是因为添加的MFP也富含纤维[28.]．MFP果冻还含有蛋白质。以前的研究人员发现，桑叶含有较高的蛋白质比草莓和作用Sunberry [29.，30.]．每100克总糖低于5克;因此，MPF果冻是由包装标签的前面分类的低糖。MFP果冻的生物活性化合物和抗氧化活性的增加可能是由于添加MFP，这是抗氧化剂和花青素的源泉[11.]．此外，TPC的和抗氧化活性的量取决于处理条件。保留多酚和高抗氧化活性的更高含量的条件涉及相对低的水分（<14％）和温度（<140℃）[31- - - - - -33]．一些研究报告称，TPCs及其抗氧化活性(如抗高血糖)对健康有益[9,降血脂药10.，抗炎的[12.在体内和体外的研究中。因此，MFP果冻作为一种具有较高生物活性成分的功能性食品，对消费者的健康有益。

本研究观察了血脂异常患者七天摄入富含花青素的MFP果冻对空腹血糖、胰岛素、脂质谱和炎症标志物的影响，以及餐后血糖和胰岛素、抗氧化能力和高脂肪餐后氧化应激水平的影响。7天后食用MFP果冻，空腹总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和IL-6显著降低，餐后葡萄糖、胰岛素和ORAC检测的抗氧化能力和MDA降低。结果表明，MFP果冻可作为一种功能性食品，降低高胆固醇患者的血液心脏代谢危险因素。

MFP果冻的健康益处来自于产品中的生物活性化合物或营养物质，特别是桑椹果中的花青素。花青素是桑椹果实中主要的生物活性化合物，由C3G和C3R组成，已有报道可预防非传染性疾病[9，10.，12.]．然而，在剂量和受试者特征方面已经观察到差异。通过交叉研究设计的7天急性摄入表明，健康参与者低剂量从黑醋栗粉中摄入总花青素(138.6 mg)可降低餐后血糖和胰岛素反应，在本研究中可与之相比，但没有关于脂质概况、氧化应激和炎症标志物的报告[14.]．Twenty-seven overweight or obese men were given 600 g of frozen blackberries (361 mg anthocyanin) for seven days, compared with 191 mg in this study [34]．结果显示胰岛素反应有显著性差异，而血糖和甘油三酯变化没有显著性差异。此外，这项研究对短期内富含花青素的浆果和高脂肪膳食摄入后的餐后炎症标志物感兴趣。据报道，在老年人和超重或肥胖男性中，4天交叉食用45克/天的冻干黑树莓(BRB)，含或不含高脂肪、高热量膳食(HFHC)。hhf组BRB的IL-6 AUC明显低于单独BRB组;而CRP和TNF-的AUC无明显变化α.［35]．另一项长达24周的研究对2型糖尿病患者进行，与安慰剂相比，他们每天两次接受160毫克花青素(混合浆果胶囊)。补充花青素可显著降低血清LDL、TG、葡萄糖、HOMA-IR、apo B-48、apo C-III、IL-6和TNF-α.，同时提高血清HDL ( )［36]．C3G对葡萄糖和胰岛素反应的作用机制可能与脂蛋白脂肪酶活性有关。这改善了胰岛素信号，减少了肠道对葡萄糖的吸收[37]．此外，通过C3G既胰岛素和AMPK信号传导途径的活化[降低由比目鱼肌GLUT-4易位餐后高血糖38，39]．这一机制可能描述了花青素的降脂作用，包括通过抑制肝脏HMG-CoA还原酶的基因表达来降低血液胆固醇，从而抑制胆固醇的合成，通过增加LDL受体基因表达和粪便中胆固醇的排泄来提高LDL的清除率[40]．

然而，在剂量花青素的效果的变化可能取决于受试者，干预期间，和观测参数的特性。之前的学习 [14.，34研究表明，在不同的受试者中，连续7天以138-600 mg的花青素摄入量均有降低餐后血糖和胰岛素的趋势。经过超过12周的干预期，并将花青素的剂量从本研究的两倍增加，花青素浆果在改善甘油三酯和高密度脂蛋白方面的效果被报道[36，41，42]．

富含饱和脂肪酸的高脂肪饮食通过多种潜在机制触发氧化应激反应，因此，内皮细胞的炎症导致动脉粥样硬化的发生[43]．这项研究表明，MFP果冻完全保持了抗氧化能力是高脂肪摄食之后由ORAC试验解释。此外，MDA如由高脂肪膳食诱导的氧化应激标志物减少[3.，44，45]．因此，食用MFP果冻7天及高脂餐后，ORAC测定可维持抗氧化能力，MDA测定可降低脂质氧化。花青素具有多种抗氧化作用，包括通过抑制酶抑制活性物质的形成，消除与自由基产生相关的微量元素，抑制脂质过氧化，增加细胞因子的产生，从而调节免疫反应[46]．

因此，7天食用MFP果冻，每天摄入190毫克花青素，可以通过降低胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，以及炎症标志物，如IL-6，改善血脂异常患者的血液心脏代谢危险因素。此外，在高脂肪饮食干预7天后，餐后分析显示，MFP果冻增加了受试者的胰岛素敏感性，降低了氧化应激，并保持了抗氧化活性。MFP果冻含有生物活性化合物和其他营养成分，如纤维、维生素和矿物质。因此，MFP果冻作为血脂异常患者的功能性食品具有优势。

本研究的局限性在于，桑椹果实的果冻与对照有很大的不同，不能盲目进行研究。为了证实MFP对氧化应激的影响，还需要进一步研究其他常见的氧化应激标志物，包括异前列腺素或氧化LDL。

5。结论

Anthocyanin-rich mulberry fruit powder (MFP) jelly was successfully developed by adding 14 g MFP with consumer acceptability. This study investigated the effect of short-term consumption of MFP jelly in dyslipidemia subjects. MFP jelly intervention showed potential effects on hypocholesterolemia, insulin sensitivity, and antioxidant capacities. Therefore, acute consumption of MFP jelly could reduce the risk of atherosclerosis and mitigate the development of CVDs and other chronic illnesses.

数据可用性

用于支持本研究结果的色谱数据包括在补充信息文件中。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

该研究项目由Mahidol大学和泰国国家研究委员会(NRCT)资助。在此感谢各位志愿者的自愿合作。

补充材料

图1:(A) cyanidin 422 chloride standard， (B) mulberry fruit power (MFP)， (C) jelly, and (D) MFP jelly的高效液相色谱(HPLC)图谱。样品中氰化物的保留率为423倍(Rt)。图2:(A) 425 kurromanin和keracyanin标准品、(B)桑椹果粉(MFP)、(C)果冻和(D) MFP 426果冻的高效液相色谱(HPLC)图谱。同时对样品中库罗曼宁和角质青苷的保留时间(Rt)进行了测定。（补充材料)

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