RIPK4表达下调通过IL-6抑制卵巢癌上皮-间充质转化

摘要

RIPK4涉及多种癌症类型，但其在卵巢癌（OC）中的作用尚未明确阐明。我们来自基因表达分析互动分析，RT-PCR和免疫组化分析的数据表明，在oc组织和细胞中的较高水平表达ripk4比正常卵巢组织和细胞在较高水平。在oc中增加RIPK4表达明显相关，与较低的ripk4表达水平更差（危险率（HR）1.5（1.45-1.87）; ）.在功能实验中，RIPK4下调显著抑制OC细胞的转移行为。随后，基于TCGA数据库中593例OC患者的数据，基因集富集分析显示RIPK4参与OC的上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。在分子水平上，沉默RIPK4显著下调vimentin、N-cadherin和Twist的表达，但诱导E-cadherin的蛋白水平升高，抑制IL-6和STAT3的表达。此外，ripk4沉默OC细胞中IL-6水平显著降低( ）.在OC细胞中加入IL-6挽救了RIPK4敲低对EMT的抑制作用。因此，我们的数据表明，下调RIPK4的表达可以通过抑制IL-6来抑制OC中的EMT。这一发现可能为改善OC患者不良预后提供新的诊断和治疗靶点。

1.介绍

卵巢癌(OC)是全球最致命和第三常见的妇科恶性肿瘤[1］．2020年，美国预计将出现约21750例新OC病例和13940例OC死亡[2］．oc的差异较差主要是由于新诊断患者腹膜内传播和腹膜内转移的高速率驱动[3.］．上皮-间充质转化(EMT)是恶性进展的初始和初级细胞步骤，其特征是上皮生物标志物表达下调和间充质生物标志物表达上调[4- - - - - -6］．然而，在OC的起始和进展中，激活各种信号级联以促进上皮细胞转化为间充质表型的关键转录调控因子仍不清楚。因此，迫切需要阐明OC进展特别是EMT的调控分子机制。

越来越多的研究表明，NF-Kappa B（NF-κB)和JAK/STAT信号通路在癌症相关EMT中是活跃的[7- - - - - -10］．与EMT相关的另一个关键通路是白介素-6 (IL-6)/磷酸化信号传感器和转录激活因子3 (STAT3)轴[11］．IL-6是一种炎症因子，被广泛报道参与了多种癌症的病理网络，也被认为是STAT3信号通路的激活因子[11，12］．已经鉴定了该途径与血管生成，化学疗法抵抗和细胞周期进展相关的侵入能力相关[13］．

受体相互作用蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶4 (Receptor interaction protein serine/苏氨酸激酶4,RIPK4)是受体相互作用蛋白(Receptor interaction protein, rip)的关键成员，在多种癌症类型中异常表达[14］．已经观察到ripk4蛋白激活NF-κB，对角化细胞分化至关重要[15，16］．此外，其相关的致癌信号通路包括NF-κB, Wnt /β-catenin和RAF1/MEK/ERK通路[17，18］．既往研究表明，RIPK4在膀胱尿路上皮癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠直肠癌和胰腺癌中过表达并促进恶性进展[18- - - - - -23］．但RIPK4在OC中的作用尚不清楚，是否能通过IL-6/STAT轴缓解EMT尚不清楚。

在此，我们介绍了显示OC组织和细胞中的高水平RIPK4的数据，该数据被发现与OC患者的短总存活（OS）时间相关。此外，为了进一步探索拟裂的相关途径，进行基因设定富集分析（GSEA）。结果表明，RIPK4表达的下调能够阻碍OC通过IL-6的EMT能力，这可能为OC的治疗提供更具体的证据。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

肿瘤细胞系(SKOV3、Coci、CAOV3、A2780、SW626、HEY、OVCAR3)和正常卵巢细胞系IOSE80取自上海癌症研究所。所有细胞在不同的培养基中培养(5A中的SKOV3 (Gibco，美国纽约);Coci, CAOV3, A2780, SW626和HEY在DMEM (HyClone Laboratories Inc.， Logan, UT, USA);IOSE80在RPMI 1640培养基(HyClone Laboratories Inc.， Logan, UT, USA)中添加10%(体积/体积)胎牛血清(FBS) (Gibco，纽约，美国)。OVCAR3细胞在添加20%(体积/体积)胎牛血清的DMEM (HyClone Laboratories Inc.， Logan, UT, USA)中培养。所有培养基中添加1%的双抗(100μg / ml链霉素和100u / ml青霉素）。将细胞培养在37℃的湿化培养箱中，补充有5％的CO₂的气氛。培养后将重组人IL-6蛋白(Proteintech，中国武汉)加入OC细胞培养基中。

2．2．抗体

本研究使用的抗体购自ImmunoWay (Newark, DE, USA):小鼠抗n -cadherin单克隆抗体、小鼠抗e -cadherin单克隆抗体、小鼠抗vimentin单克隆抗体、兔抗stat3单克隆抗体、兔抗磷酸化stat3单克隆抗体、兔抗gapdh单克隆抗体。小鼠抗ripk4单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology (California, USA)，兔抗小鼠IgG酶标抗体购自Abcam, Inc. (Massachusetts, USA)。所有抗体都被稀释到制造商说明书中列出的最高浓度。

2.3。生物信息分析

基因表达谱交互分析(GEPIA)网站用于显示基于来自TCGA和GTEx项目的数千份样本的OC的RNA测序表达和生存分析[24］．使用Kaplan-Meier绘图仪评估RIPK4对OC生存的影响。GEPIA还提供了日志级别值和危险比，95%置信区间。

2.4。OC细胞中ripk4表达的敲低

RIPK4有两种亚型:RIPK4-201 (ENST00000332512.7)和RIPK4-202 (ENST00000352483.3)。RIPK4-201的长度为832，该亚型被选为规范序列。与规范序列不同的是，RIPK4-202缺失278-325。一种下调RIPK4-201和RIPK4-202亚型表达的慢病毒购自上海基因化学有限公司(中国上海)。干扰RNA (RNAi)序列如下:si- 1,5 -TTTCACGTCCAGAT CATGAGC-3 ；ψ2、5 -AAATCAGAAATCTTGACGTGG-3 ；后溪5 -AAC AGGTCAATGACATCGGCG-3 ；和si-control 5 -TTCTCCGAACGTGTCAC GT-3 ．将RNAi和对照序列插入质粒载体(hu6 - mcs - cbh - gcgfp - ires -嘌呤霉素)。按照制造商的说明，用Lipofectamine 3000 (Invitrogen公司，Thermo Fisher Scientific公司，加利福尼亚，美国)转染质粒到细胞中。

2．5．定量实时聚合酶链反应

用TRIzol (Invitrogen公司，Thermo Fisher Scientific公司，California, USA)提取细胞系总RNA。逆转录(Promega, Madison Wisconsin, USA)按照制造商的协议进行。随后，根据制造商说明，使用7300 Real-Time PCR机(Thermo Fisher Scientific, California, USA)和SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Osaka, Japan)。RIPK4的引物序列如下:forward, 5 -Catga CCTCAGAGGCGCTAC-3和反向,5 -CCTTCTCCTCGACAAGCAG-3 ．以β -肌动蛋白为内参，利用基因表达谱分析相关基因表达方法。

2．6．数据库和基因集富集分析(GSEA)

首先，从TCGA数据集获得含有593例OC患者的基因表达矩阵文件（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）.其次，根据RIPK4中位表达量将基因表达矩阵分为两组(RIPK4高表达组和RIPK4低表达组)。最后,GSEA (http://www.broad.mit.edu/gsea/)，以探索RIPK4作用的潜在机制。基因组包括值，且错误发现率(FDR)小于0.05视为显著富集，并设置1000次排列以进一步分析。

2.7。患者信息和临床标本

临床信息和标本（表1)于2004年至2018年在奉贤医院、南方医科大学和福建省妇幼医院被回收。由于卵巢浆液性癌是OC最常见的病理类型，我们纳入124例卵巢浆液性癌和30例卵巢浆液性囊腺瘤作为对照。接受手术的病人的石蜡包埋标本由专业的妇科病理学家证实。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)分析

组织被切成4块μM片免疫组化染色。RIPK4小鼠多克隆抗体(Novus, Missouri, USA)的抗体稀释倍数为1:100，兔抗小鼠HRP IgG抗体(Abcam, Inc.， Massachusetts, USA)的抗体稀释倍数为1:1000。按照制造商的建议，切片在二甲苯和一系列梯度浓度的乙醇中进行脱水和透明处理。用0.3%的过氧化氢在37℃下阻断内源性过氧化物酶活性10分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3分钟。在10 mmol/l柠檬酸溶液(pH 6.0)中加热2分钟以检索抗原表位后，载玻片与针对RIPK4的一抗在4°C孵育过夜。PBS冲洗3次，二抗室温孵育1 h。使用Enhanced HRP-DAB Kit(天根生物技术，北京，中国)在蔡司显微镜下观察组织切片。免疫染色后苏木精复染，分级乙醇脱水，二甲苯清除，中性香脂裱片。两位病理学家对临床信息评估免疫反应性的分数也不清楚(0 ~ 5%积极“0”分6 ~ 25%积极取得“1”26 ~ 50%积极得分”2、“51 ~ 75%积极取得了“3”,超过75%积极打入“4”)和强度(弱了“1”中取得了“媒介”和强大的得分“3”)。3~7分为高表达，0~2分为低表达(高倍场×40次，面积0.16 mm)²）.

2.9。西方墨点法

用1x IP裂解缓冲液（Solarbio，Shanghai，China）裂解细胞，补充有蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Solarbio，中国）。通过使用BCA蛋白质测定套件（Beyotime，Shanghai，China）测定总蛋白质浓度。然后，细胞裂解物与5倍SDS加载缓冲液（Solarbio，Solarbio，Sharmai，China）合并10分钟，之后煮20分钟 μG蛋白被装入凝胶的每个通道中。电泳后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5% BSA加0.1% Tween封闭。含有蛋白的膜与小鼠抗RIPK4单克隆抗体(ImmunoWay, Texas, USA)、E-cadherin、N-cadherin和vimentin单克隆抗体(Cell signaling Technology, Danvers, USA)和兔抗phospho- stat3和GAPDH单克隆抗体(ImmunoWay, Newark, DE, USA)在4°C下1:10 00稀释过夜。PBS洗涤三次后，加入抗兔酶标抗体(山羊抗兔IgG, ImmunoWay)，室温孵育1 h。使用FluorChem R系统(ProteinSimple, California, USA)进行成像。最后，利用ImageJ对信号进行量化。

2.10。伤口愈合实验

对于这个实验, 将细胞/孔置于6孔板中，培养至第二天约95%融合。用无菌1ml移液管尖在细胞层创面，用PBS冲洗细胞两次。洗涤后，在平板中加入2ml不含fbs的培养基，在0、24、36、48 h用倒置荧光显微镜(Zeiss, Oberkochen, Germany)测量划痕宽度。使用ImageJ软件定量平均创面宽度，计算划痕宽度减少量(μM)在每个时间点。

2.11。Transwell入侵测定

室(8μm, Corning, New York, USA)预涂Matrigel (BD, NJ, USA)。治疗后, OC细胞在无fbs培养基中被镀于24孔板的上腔室，700孔板μ将含10%胎牛血清的l培养基加入基底外侧腔。孵育48小时后，用棉签拭除未被侵入的细胞，用4%多聚甲醛(Solarbio, Shanghai, China)固定细胞30分钟，然后用0.1%结晶紫(Solarbio, Shanghai, China)在甲醇中染色30分钟。染色后的小室在室温下过夜干燥，并在倒置荧光显微镜(Zeiss, Oberkochen, Germany)下五个随机场中成像。

2.12。小鼠皮下异种移植

皮下肿瘤异种移植物共植入 SKOV3细胞(200μl PBS)免疫缺陷Balb/c小鼠右侧皮肤下。实验开始时小鼠为5~6周龄。对异种移植肿瘤的发展进行了评估 每周测量一次。治疗8周后处死小鼠，移动异种肿瘤移植物，拍照并固定。

2.13。酶联免疫吸附试验（ELISA）

通过以ELISA Max Deluxe Set（Biolegendend，USA）的方案，通过ELISA测量细胞培养基中的IL-6水平。

2.14。统计分析

功能结果由学生的分析 -检验或单因素方差分析，然后进行Bonferroni事后检验。所有实验至少有三个重复。所有统计分析均使用GraphPad Prism 7.0 被认为是显著的。

2.15。道德声明

这项研究是按照《赫尔辛基宣言》中的道德规范进行的。获得了机构伦理委员会的患者同意和批准。

3.结果

3．1.OC中检测到RIPK4高水平表达

首先，如图所示的是RIPK4在不同癌症类型中与相应对照组相比的异常mRNA表达1(一)．我们之前的研究表明OC是一种高度异质性的癌，有许多分子异常[25］．因此，我们进一步研究了RIPK4在OC中的mRNA表达和预后作用。结果显示，在OC组织中RIPK4的mRNA表达明显上调(图)1 (b))，但与OC的恶性分期无关(图1 (c)）.此外，RIPK4-201 (ENST00000332512.7)转录本与OC显著相关(图1（d））.此外，Kaplan-Meier绘图仪显示RIPK4高水平表达(HR 1.5 (1.45-1.87)， ）与OC患者低表达水平相比，与较差的总生存率相关(图1（e））.

为了进一步分析RIPK4在蛋白水平上的表达，我们通过IHC分析发现，与正常卵巢组织相比，RIPK4在HOGSC中的表达显著升高。表中汇总了124例(80.5%)卵巢浆液性癌患者和30例(19.5%)卵巢浆液性囊腺瘤患者的临床资料1．进一步研究RIPK4表达与纳入的良、恶性卵巢浆液性肿瘤的组织学类型、年龄以及浆液性卵巢癌的组织学分级、淋巴结转移和临床分期的关系(表)2）.结果证实RIPK4的高表达与卵巢组织学类型有关，且在浆液性癌组织中的表达明显高于卵巢浆液性囊腺瘤( ）.在浆液性卵巢癌中，高级别癌组织中RIPK4的表达明显高于低级别癌组织，淋巴结转移和临床晚期也与RIPK4的高免疫反应性显著相关( ，分别）。卵巢浆液癌样品的高免疫反应性为58.1％（124名患者：48例低表达，76个高表达），而卵巢浆液性膀胱瘤组织为13.3％（患者：26例低表达，4个高表达）（ ，数字2）.

3．2．沉默RIPK4抑制OC细胞的迁移和侵袭能力

RT-PCR检测OC细胞系(SKOV3、SW626、CAOV3、A2780、OVCAR3、Coci1、HEY)和正常卵巢上皮细胞系(IOSE80)中RIPK4 mRNA的表达水平(图)3(一个)）.结果表明，在OC组织和OC细胞系中，RIPK4表达均明显上调。为了探究RIPK4在OC中的作用，我们使用RNAi-RIPK4抑制OC细胞株中RIPK4的表达(图)3 (b)）.通过伤口愈合(图3 (c)和3 (d))和Transwell测定(图3 (e)和3 (f))，与si对照相比，RIPK4沉默显著降低了SKOV3和OVCAR3细胞的移动相关能力。

3.3。沉默的ripk4抑制皮下异种移植物的生长

EMT是OC侵袭和远端定植的重要步骤。EMT的最终结果是转移和增殖。皮下移植可显示ripk4相关EMT对OC恶性增殖的影响。为了确定沉默RIPK4是否会抑制免疫缺陷小鼠的SKOV3细胞异种移植物的生长，我们共建立了4个皮下异种移植物，组成SKOV3-sh-RIPK4沉默组，同时以免疫缺陷小鼠的SKOV3载体细胞建立4个异种移植物作为对照。所有小鼠于注射后第8周处死。如图所示3 (g)和3 (h)， skov3 -sh- ripk4沉默组的OC异种移植物明显小于对照组( )，验证了RIPK4在体内能促进OC的生长。

3．4．ripk4相关信号通路的识别

功能测定证明，RIPK4-沉默的OC细胞表现出抑制肿瘤生长，迁移和侵袭。为了探讨涉及OC的ripk4的功能途径，使用GSEA评估低于HINGK4表达组中的OC中涉及的信号通路。GSEA确定了显着的差异（NOM值< 0.05, ）在丰富的标志中。结果表明，NF-κB、EMT、p53通路、肌发生、顶端连接和缺氧是RIPK4高表达表型中最富差异的通路，与OC的肿瘤发生和进展密切相关(图)4(一)）.EMT被认为是OC进展中一个经典且有影响的细胞过程，无论肿瘤是处于早期还是晚期。对RIPK4 mRNA表达的分析也显示其对OC期的响应无显著差异，因此我们将重点放在EMT上进行生物学和通路研究。对于GSEA结果中的EMT，富集评分(ES)为0.55，归一化富集评分(NES)为2.12(图)4 (b)和4 (c)）.此外，热图显示，与RIPK4高表达表型相关的EMT特征显著上调，如图所示4 (d)．

3．5．RIPK4沉默抑制OC细胞的EMT

为了进一步证实抛物K4和EMT在OC细胞中的相关性，用SKOV3和OVCAR3细胞进行WB和RT-PCR测定以检测Vimentin，E-Cadherin和N-Cadherin的表达，其被认为是主要的间充质标记物在EMT期间的上皮标记。结果在图中4 (e)结果表明，在ripk4沉默的OC细胞中，vimentin和N-cadherin表达显著下调，而E-cadherin表达相应上调。这些数据表明，抑制RIPK4表达可抑制OC细胞中的EMT。

3.6。RIPK4促进IL-6/ stat3介导的EMT在OC进展中的作用

我们进一步探索了ob在oM的RIPK4相关机制。基于以前的研究，揭示了RIPK4可以激活NF-κB通路，说明STAT3是NF-必需的κB激活，激活IL-6/STAT3通路导致EMT [7- - - - - -12，我们的目的是确定RIPK4是否通过IL-6在OC细胞中诱导EMT。我们通过shRNA序列沉默来抑制RIPK4的表达，然后进行WB和RT-PCR检测。通过WB检测，在ripk4沉默的OC细胞中，STAT3和p-STAT3水平显著下调(图)4 (e)）.此外，通过RT-PCR检测，STAT3、IL-6和IL-6靶基因SOSC1、SOSC3水平显著降低。此外，在ripk4沉默的OC细胞中，STAT5B和间充质生物标志物(Slug和Twist)的水平也显著降低(图)5(一个)）.为了量化ripk4沉默OC细胞中IL-6水平的下降，我们用ELISA检测培养基中IL-6的浓度。如图所示5 (b)，在SKOV3-sh-RIPK4细胞培养液中IL-6浓度显著下调( ）.

3.7。IL-6的注射挽救了ripk4沉默的OC细胞的迁移和侵袭

为了确定IL-6在RIPK4诱导的EMT中的潜在作用，我们将IL-6添加到RIPK4-沉默的OC细胞中。如图所示5(一个)， IL-6显著促进skov3 - ripk4对照OC细胞的迁移。此外，IL-6挽救了迁移(图5 (c)和5 (d))和入侵(图5 (e)和5 (f))。这些数据证实了RIPK4通过IL-6诱导OC细胞EMT(图)6）.

4.讨论

发现大约70％的卵巢癌病例涉及在初步诊断下涉及到腹腔的转移。大多数患者死于营养不良和肠梗阻的腹部转移性Niche [26］．EMT是卵巢上皮癌发生和进展中的一个早期和重要的细胞步骤[27- - - - - -29］．到目前为止，EMT的关键调控因素和潜在的致瘤和转移功能仍然知之甚少。据报道，NF-的活化κB和IL-6/STAT3通路可促进多种癌症和阻断NF-的EMTκB降低乳腺癌的转移。此外，已有研究表明RIPK4可以激活NF-κB途径和促进上皮癌中的恶性行为。然而，ripk4是否通过IL-6 / Stat3诱导EMT仍需要在恶性上皮癌中探索，特别是在OC中。我们的结果表明，在OC细胞和组织中，RIPK4表达明显上调，高水平的表达与临床存活率不良。此外，我们通过GSEA揭示了RIPK4在OC中诱导EMT。我们首次证明RIPK4通过靶向IL-6促进OC的EMT，从而为早期诊断和治疗OC治疗腹部转移的潜在目标提供了一种新的分子机制。

位于染色体21Q22.3上的RIPK4是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有C末端区域11Ankyrin重复和N-末端RiP样激酶结构域[21］．目前RIPK4在癌症肿瘤发生中的作用和RIPK4的发育作用尚不清楚，其在OC中的作用也远不清楚。在本研究中，在OC组织和OC细胞株中RIPK4的表达均增加，这明显预示OC的预后不良。值得注意的是，在三种常见妇科肿瘤和睾丸生殖细胞肿瘤中也检测到高水平的RIPK4表达。已有文献证实RIPK4在恶性组织中的差异表达及预后作用。例如，在胰腺癌、宫颈癌和结直肠癌中，RIPK4的表达和预后价值也有类似的结果[18，19，22］．而RIPK4在肝细胞癌和舌鳞癌中表达减少[23，30.］．然而，这些研究没有提供恶性肿瘤的RIPK4的广泛观点。总体而言，我们的TCGA基于数据的研究最初展示了RIPK4在三种常见的妇科癌症中的潜在致癌作用。此外，生物信息分析表明，OC阶段的RIPK4表达没有显着差异，这可能表明RIPK4在OC癌症和发育中的早期参与。

EMT已被确定为上皮性癌的早期和重要步骤。激活NF -κB已被发现是肝癌EMT的关键启动子[31，结肠癌[32]、胃癌[33和其他各种癌症[34］．在目前的研究中，功能分析表明，在OC细胞系中沉默RIPK4显著限制了迁移和侵袭特性。已有研究表明RIPK4可以激活NF-κB途径和RAF1 / MEK / ERK信号在癌症中癌症和发育[21］．De Oliveira等发现骨骼肌修复EMT能力下降与RIPK4表达下调有关[35］．然而，这些作者没有根据大规模的OC患者探讨RIPK4和恶性肿瘤之间的潜在富集的途径。与以前的所有工作相比，我们是第一个向RIPK4作为P53途径，肌生成，顶端结，缺氧，缺氧，缺氧，缺氧的关键作用的新见解，由GSEA分析来自593的数据OC患者在TCGA数据集中。在目前的研究中，RIPK4沉默伴随着上皮生物标志物（Vimentin，Slug，N-Cadherin和扭曲）表达的下调，并上调了间充质生物标志物（E-Cadherin）的表达。

IL-6/STAT3通路的激活可以阻断癌症中的抗肿瘤免疫。我们初步证明，RIPK4沉默诱导IL-6和STAT3表达下调，以及IL-6靶蛋白SOSC1和SOSC3表达下调[36］．IL-6由各种类型的癌细胞和癌症相关的成纤维细胞分泌，在肿瘤中引起慢性炎症，然后与IL-6R结合形成IL-6/IL-6R复合物[36］．这种复合物提高磷酸化的STAT3 (p-STAT3)表达并激活核易位诱导的效应基因，促进炎症、免疫反应和癌症的发生和发展[37］．此外，IL-6/STAT3信号通路对NF-是必不可少的κB激活。然而，以往的研究并没有解决RIPK4是否激活IL-6来诱导NF-κB在恶性肿瘤中激活。值得注意的是，我们透露，沉默的ripk4抑制了IL-6和SOCS1 / 3。此外，添加IL-6能够拯救RIPK4-沉默的OC细胞的迁移和侵袭能力，这证实了RIPK4在IL-6 / Stat3途径中的调节作用。

5.结论

值得注意的是，我们的研究有一定的局限性。首先，RIPK4的鉴定是基于TCGA数据库，但我们没有进行体内研究进一步证实RIPK4在OC中诱导EMT。其次，RIPK4与雌激素和雄激素等激素之间的潜在联系在我们的研究中没有被调查。

总之，本研究揭示了基于ripk4的IL-6网络是OC EMT的决定因素，并为OC提供了一种新的诊断、治疗和预后生物标志物。

数据可用性

这些数据可以通过作者自己获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

Huan Yi和yan zhao Su是对等的贡献者。

致谢

基金资助:国家青年科学基金项目(No . 81802604)和福建省自然科学基金项目(No . 2019J01512和No. 2020J01336)资助。

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