JIR 免疫学研究期刊》的研究 2314 - 7156 2314 - 8861 Hindawi 10.1155 / 2021/8875450 8875450 研究文章 Downregulation RIPK4表达抑制Epithelial-Mesenchymal过渡通过il - 6在卵巢癌 易 黄ydF4y2Ba 1 2 3 4 苏 弘扬燕赵 3 林 荣 3 郑 马学虎 3 4 庞ydF4y2Ba 迪勒 3 林 Dan-mei 5 高 香 3 https://orcid.org/0000 - 0002 - 2136 - 7181 张 荣 1 2 关 Qingdong 1 第三临床医学院 南方医科大学 广州510500 中国 fimmu.com 2 妇产科学系 奉贤医院 南方医科大学 上海201499 中国 fimmu.com 3 妇产科肿瘤学部门 福建省孕妇和儿童医院 福建医科大学的附属医院 福州350001年 中国 fjmu.edu.cn 4 重点实验室的孕妇和儿童的福建省的主要疾病 福州350001年 中国 fjmu.edu.cn 5 福州妇幼保健医院 福州350001年 中国 fjmu.edu.cn 2021年 27 3 2021年 2021年 19 9 2020年 29日 11 2020年 28 2 2021年 27 3 2021年 2021年 版权©2021桓伊et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

RIPK4已经涉及多种癌症类型,但它在卵巢癌中的作用(OC)尚未清楚地阐明。我们从基因表达数据分析互动分析,rt - pcr和免疫组织化学分析表明,RIPK4表示对OC上级组织和细胞比正常卵巢组织和细胞。显著增加RIPK4表达OC与低总体存活率比RIPK4表达水平(故障率(人力资源)1.5 (1.45 - -1.87); P = 0.001 )。在功能性实验中,显著抑制转移性行为OC差别RIPK4对这些细胞。随后,基于数据从TCGA 593 OC病人数据库,基因集富集分析显示,RIPK4参与epithelial-mesenchymal过渡(EMT) OC。在分子水平上,沉默RIPK4显著下调波形蛋白,N-cadherin,扭表达但诱导钙粘蛋白的蛋白质含量的增加,抑制il - 6和STAT3的水平。此外,il - 6水平明显减少RIPK4-silenced OC细胞( P < 0.05 )。OC细胞的il - 6获救的抑制效应对EMT RIPK4击倒。因此,我们的数据说明RIPK4的差别,对这些基因的表达可以抑制EMT在抑制il - 6摄氏度。这一发现可能提供一种新颖的诊断和治疗目标为提高穷人OC患者的预后。

 福建省自然科学基金 2020年j01336 2019年j01512 中国国家自然科学基金 81802604 1。介绍

卵巢癌(OC)是最致命和第三个最常见的一种妇科恶性肿瘤在全球范围内( 1]。大约21750新的OC病例和13940 OC死亡人数预计将发生在2020年美国( 2]。OC的可怜的结果在很大程度上是由腹腔内传播和的高转移在新诊断病例 3]。Epithelial-mesenchymal过渡(EMT)是一种最初的恶性进展和主细胞一步,特点是表达下调上皮生物标志物表达和调节间充质生物标志物表达( 4- - - - - - 6]。然而,关键的转录监管机构,激活多种信号级联,促进上皮细胞转变为间质表型OC起始和进展仍然未知。因此,有一个关键和迫切需要阐明监管OC进展的分子机制,尤其是EMT。

越来越多的研究表明,NF -κB (NF - κB)和JAK / STAT信号通路是活跃在癌症相关EMT ( 7- - - - - - 10]。另一个关键路径与EMT是白细胞介素- 6 (il - 6) /磷酸化信号传感器和转录激活3 (STAT3)轴 11]。il - 6是一种炎症因子参与广泛报道一些癌症病理网络,也是公认的活化剂STAT3信号通路( 11, 12]。这个途径已被确认与入侵的能力,如血管生成、化疗耐药,细胞周期进展( 13]。

受体相互作用的蛋白质的丝氨酸/苏氨酸激酶4 (RIPK4)异常表达在多种癌症类型,是一个关键的成员组受体相互作用蛋白(撕裂)[ 14]。RIPK4蛋白已被观察到激活NF - κB和角化细胞分化[至关重要 15, 16]。此外,其相关的致癌信号通路包括NF - κB, Wnt / β连环蛋白和RAF1 / MEK / ERK途径[ 17, 18]。先前的研究显示,RIPK4在膀胱移行细胞过表达和促进恶性发展,鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌和胰腺癌( 18- - - - - - 23]。然而,OC RIPK4所扮演的角色还不清楚,是否能减轻EMT通过il - 6 / STAT轴是知之甚少。

在此,我们提出了数据显示,高水平的RIPK4 OC组织和细胞中,也被发现与患者的总生存期(OS)时间短OC。此外,进一步探索RIPK4-related通路参与OC,基因集富集(GSEA)进行了分析。RIPK4表达差别结果显示,对这些阻碍了EMT的能力通过il - 6摄氏度,这可能为OC的治疗提供更具体的证据。

 2。材料和方法 2.1。细胞培养

癌症细胞系(SKOV3 Coci、CAOV3 A2780, SW626,嘿,和OVCAR3)及正常卵巢细胞系IOSE80来自上海癌症研究所。所有细胞培养在不同的培养基(SKOV3在5(美国纽约Gibco);Coci、CAOV3 A2780 SW626,嘿在DMEM(美国UT HyClone实验室Inc .,洛根);和IOSE80 RPMI 1640介质(美国UT HyClone实验室Inc .,洛根))补充10%(体积/体积)胎牛血清(的边后卫)(美国纽约Gibco)。OVCAR3细胞在DMEM培养(美国UT HyClone实验室Inc .,洛根)补充20%(体积/体积)的边后卫。所有的文化媒体补充双抗生素(100年为1% μ青霉素g / ml链霉素和100 U /毫升)。细胞都培养37°C湿润孵化器补充有限公司5%2的气氛。重组人il - 6蛋白(Proteintech,武汉,中国)添加到OC培养后细胞培养基。

 2.2。抗体

中使用的抗体研究从ImmunoWay购买(美国纽瓦克,德):鼠标单克隆anti-N-cadherin,鼠标单克隆anti-E-cadherin,鼠标单克隆anti-vimentin,兔单克隆anti-STAT3,兔单克隆anti-phospho-STAT3,兔单克隆anti-GAPDH。鼠标单克隆anti-RIPK4抗体购自圣克鲁斯生物技术(美国加州),和一只兔子anti-mouse免疫球蛋白HRP-conjugated抗体购自Abcam, Inc .(麻萨诸塞州,美国)。所有抗体稀释浓度最高的列在制造商的指示。

 2.3。生物信息学分析

基因表达分析交互式分析(GEPIA)网站被用来显示RNA序列表达式和生存分析基于成千上万的样本,TCGA的OC和GTEx项目( 24]。kaplan meier绘图机是用来评估在OC RIPK4生存的影响。GEPIA还提供了日志等级 P 价值和风险比为95%置信区间在每个情节。

 2.4。可拆卸的OC RIPK4表达的细胞

RIPK4有两个亚型:RIPK4 - 201 (ENST00000332512.7)和RIPK4 - 202 (ENST00000352483.3)。ripk4 - 201的长度是832年,被选为这对碘氧基苯甲醚标准序列。不同的标准序列,278 - 325在ripk4 - 202人失踪。一个慢病毒表达下调的表达式ripk4 - 201和ripk4 - 202亚型是购自上海GeneChem公司,有限公司(上海,中国)。RNA干扰(RNAi)序列如下:也5 ′ -TTTCACGTCCAGAT CATGAGC-3 ′ ;ψ2、5 ′ -AAATCAGAAATCTTGACGTGG-3 ′ ;后溪5 ′ aac AGGTCAATGACATCGGCG-3 ′ ;和si-control 5 ′ -TTCTCCGAACGTGTCAC GT-3 ′ 。RNAi和控制序列插入一个质粒向量(hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin)。质粒转染到细胞与Lipofectamine 3000(美国加州表达载体,热费希尔科学)制造商的指示。

 2.5。定量实时聚合酶链反应

总RNA提取细胞系利用试剂盒(美国加州表达载体,热费希尔科学)。逆转录(美国威斯康辛麦迪逊Promega)执行后,制造商的协议。随后,7300实时PCR仪(美国加州热费希尔科学)SYBR绿色PCR大师(豆类,大阪,日本)是利用混合,根据制造商的指示。RIPK4的引物序列如下:向前,5 ′ -CATGA CCTCAGACGGCTAC-3 ′ 和反向,5 ′ -CCTTCTCCTCGACAAGCAG-3 ′ 。Beta-actin作为内部参考,和相对基因表达进行了分析使用 2 − Δ Δ Ct 方法。

 2.6。数据库和基因集富集分析(GSEA)

首先,一个基因表达矩阵文档,其中包含593例OC TCGA患者获得的数据集( https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)。其次,基因表达矩阵是根据平均分为两组的表达RIPK4 RIPK4(高表达组和低表达组)。最后,GSEA ( http://www.broad.mit.edu/gsea/)进行探索的潜在机制RIPK4的效果。基因集包括 P 值和错误发现率(罗斯福)小于0.05被认为是相当丰富,和排列1000倍进行进一步分析。

 2.7。患者信息和临床标本

临床资料和标本(表 1)从奉贤检索医院、南方医科大学、福建省孕妇和儿童医院,从2004年到2018年。由于卵巢浆液性癌是最常见的病理类型的OC,我们包括124例卵巢浆液性癌和30作为控制卵巢浆液性囊腺瘤。石蜡包埋标本病人手术经专业gynaecopathologist。

浆液性卵巢癌患者的基本临床资料和良性卵巢浆液性囊腺瘤。

卵巢浆液性癌( n = 124年 ) 卵巢浆液性囊腺瘤( n = 30. )
年龄
最小、最大 18 - 82 18 - 68
中位数 55 44
卵巢浆液性癌的组织学分级
高 74年
低 50
临床阶段
我 35
二世 12
三世 68年
四世 9
2.8。免疫组织化学(包含IHC)分析

组织切成4 μ米部分包含IHC染色。抗体稀释1:100 RIPK4老鼠多克隆抗体(罗福斯,密苏里州,美国)和1:1000只兔子anti-mouse免疫球蛋白合抗体(美国马萨诸塞州Abcam, Inc .)。部分孵化在二甲苯和一系列梯度浓度的乙醇脱水和透明后,制造商的建议。内源性过氧化物酶活性被0.3%过氧化氢10分钟37°C,紧随其后的是洗涤与磷酸盐(PBS) 3分钟。加热后10更易与柠檬酸/ l的解决方案(pH值6.0)2分钟来检索抗原决定,幻灯片是孵化主要抗体RIPK4一夜之间在4°C。然后,幻灯片与PBS清洗三次,和幻灯片孵化与二次抗体在室温下1 h。组织部分使用增强的HRP-DAB可视化工具包(Tiangen生物技术,北京)由蔡司显微镜。与苏木精复染色的部分免疫染色后,与梯度乙醇脱水,二甲苯清理,安装与中性香脂。两位病理学家对临床信息评估免疫反应性的分数也不清楚(0 ~ 5%积极“0”分6 ~ 25%积极取得“1”26 ~ 50%积极得分”2、“51 ~ 75%积极取得了“3”,超过75%积极打入“4”)和强度(弱了“1”中取得了“媒介”和强大的得分“3”)。最后,大量的3 ~ 7被定义为高表达,和大量的0 ~ 2被定义为低表达(大功率场面积0.16毫米×40倍2)。

 2.9。西方墨点法

细胞细胞溶解1 x IP裂解缓冲(Solarbio、上海、中国)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Solarbio、上海、中国)。总蛋白浓度测定采用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)。然后,细胞溶解产物结合5 x SDS加载缓冲(Solarbio、上海、中国)和煮10分钟,之后20 μg蛋白被加载在每个车道的凝胶。蛋白质电泳后,转移到硝化纤维膜,阻止5% BSA补充渐变为0.1%。的膜蛋白是孵化鼠单克隆抗体RIPK4(美国德克萨斯州ImmunoWay),钙N-cadherin,和波形蛋白(细胞信号技术,丹弗斯,美国)和兔单克隆抗体对anti-phospho-STAT3和GAPDH(美国ImmunoWay纽瓦克·德·)稀释1:1000一夜之间在4°C。与PBS三次洗涤后,一个anti-rabbit HRP-conjugated抗体(山羊anti-rabbit免疫球蛋白,ImmunoWay)然后添加和孵化1 h在室温下。美国加州FluorChem R系统(ProteinSimple)用于成像。最后,通过使用ImageJ信号量化。

 2.10。伤口愈合实验

对于这个实验, 1 × 10 6 细胞/镀在6-well板块和培养直到第二天大约95%汇合的。伤口是在细胞层使用无菌吸管1毫升技巧,然后用PBS细胞被洗两次。洗后,2毫升FBS-free中添加到板和划痕宽度为0,24日,36,48小时内使用一个倒置荧光显微镜(蔡司、从、德国)。ImageJ软件被用来量化的平均伤口宽度计算减少划痕宽度( μ在每个时间点)。

 2.11。Transwell入侵检测

室(8 μm,康宁公司(美国纽约)与基底膜基质预镀(美国新泽西州BD)。治疗后, 1 × 10 5 OC FBS-free细胞培养基是镀在参议院24-well板,和700年 μl中含有10%的边后卫是添加到基底外侧室。48小时孵化后,用棉签把noninvaded细胞,和入侵细胞被固定为4%多聚甲醛(Solarbio、上海、中国)30分钟,然后沾0.1%结晶紫(Solarbio、上海、中国)在甲醇30分钟。彩色室被干在室温下过夜,和入侵细胞室的下表面成像在五个随机领域在倒置荧光显微镜下观察(蔡司、从、德国)。

 2.12。皮下异种移植小鼠

皮下肿瘤异种移植被植入的生成 1 × 10 6 200年SKOV3细胞(暂停 μl PBS)免疫缺陷的右翼皮肤下Balb / c小鼠。小鼠5 ~ 6周大的实验。xenotransplantated肿瘤发展的评估, 明显的 肿瘤 体积 = π / 6 × 长度 × 宽度 × 高度 每周测量。治疗8周后小鼠牺牲,他们的肿瘤异种移植都被感动了,拍照,和固定的。

 2.13。酶联免疫吸附试验(ELISA)

il - 6水平细胞培养基测定通过ELISA的协议ELISA马克斯豪华集(美国BioLegend)。

 2.14。统计分析

学生的功能结果进行分析 t 以及或单向方差分析Bonferroni事后测试紧随其后。所有的实验都在至少一式三份。GraphPad Prism 7.0被用于所有的统计分析,和 P < 0.05 被认为是显著的。

 2.15。道德声明

本研究遵循道德规范执行包含在《赫尔辛基宣言》。病人同意和机构伦理委员会的批准。

 3所示。结果 3.1。高水平的RIPK4表达式中检测出OC

首先,异常的mRNA的表达RIPK4不同癌症类型和相应的对照组相比,在图中进行了描述 1(一)。我们先前的研究显示,OC是一个高度异构癌和有许多分子异常( 25]。因此,我们进一步调查的mRNA表达与预后作用RIPK4 OC。结果表明,RIPK4显著调节的mRNA表达OC组织(图 1 (b)),但没有相关的恶性阶段OC(图 1 (c))。此外,ripk4 - 201 (ENST00000332512.7)成绩单OC(图明显相关 1 (d))。此外,kaplan meier绘图仪表明,高水平的RIPK4表达式(HR 1.5 (1.45 - -1.87), P = 0.001 )与总体存活率比低水平的表达OC病人(图 1 (e))。

的表达和预后信息RIPK4 OC, GEPIA分析。(一)大规模表达分析RIPK4在不同类型的癌。(b) RIPK4 mRNA表达OC患者( N = 426年 )明显高于正常人( N = 426年 )( ∗ P < 0.05 )。红列包含OC组织,和黑色的列包含正常组织。(c)进一步确定RIPK4表达式与OC阶段,GEPIA,发现阶段II-IV之间无显著差异。(d)小提琴情节表明RIPK4 - 201的表达水平(ENST00000332512.7)同种型RIPK4远远高于RIPK4 OC - 202 (ENST00000352483.3)同种型。(e) kaplan meier绘图仪表明RIPK4高水平的OC与存活率明显不如低水平的RIPK4表达式( P = 0.0011 )。

进一步分析RIPK4表达蛋白质含量在临床样本,我们发现一个显著高表达RIPK4 HOGSC相比正常卵巢组织包含IHC分析。病人临床资料包括124例(80.5%)患者卵巢浆液性癌和30例(19.5%)患者卵巢浆液性囊腺瘤在表中做了总结 1。RIPK4表达与组织学类型和年龄之间的关系进入良性和恶性浆液性卵巢肿瘤,以及组织学分级、淋巴结转移、临床分期的浆液性卵巢癌是进一步研究(表 2)。结果验证,RIPK4的高表达与卵巢组织学类型有关,和浆液性癌组织中的表达明显高于卵巢浆液性囊腺瘤( P < 0.001 )。在浆液性卵巢癌,RIPK4中高档癌组织的表达明显高于低度癌症组织和淋巴结转移和临床分期末也显著相关高RIPK4免疫反应性( P = 0.003 分别)。高免疫反应性的卵巢浆液性癌样本为58.1%(76年124例:48个低表达,高表达),而卵巢浆液性囊腺瘤组织中为13.3%(病人:26低表达,4高表达)( P < 0.001 ,图 2)。

RIPK4登记患者临床病理特征和表达。

特征 情况下,总 n = 154年 (%) RIPK4表达式 χ 2 价值 P 价值
低表达情况(%) 高表达情况(%)
组织学类型
卵巢浆液性癌 124例(80.5%) 48 (38.7%) 76例(61.3%) 22.256 < 0.001
卵巢浆液性囊腺瘤 30 (19.5%) 26 (86.7%) 4 (13.3%)
年龄
≤50 59 (38.3%) 30 (50.8%) 29 (49.2%) 0.002 0.969
> 50 95例(61.7%) 48 (50.5%) 47 (49.5%)
卵巢浆液性癌的组织学分级
高 74例(59.7%) 21 (28.4%) 53 (71.6%) 8.256 0.004
低 50 (40.3%) 27 (54.0%) 23 (46.0%)
LN转移
是的 31 (25.0%) 5 (16.1%) 26 (83.9%) 8.882 0.003
没有 93例(75.0%) 43 (46.2%) 50 (53.8%)
临床阶段
我 35 (28.2%) 22 (62.9%) 13 (37.1%) 14.013 0.003
二世 12 (9.7%) 5 (41.7%) 7 (58.3%)
三世 68例(54.8%) 20 (29.4%) 48 (70.6%)
四世 9 (7.3%) 1 (11.1%) 8 (88.9%)
临床阶段
我 35 (28.2%) 22 (62.9%) 13 (37.1%) 12.891 0.002
二世 12 (9.7%) 5 (41.7%) 7 (58.3%)
iii iv 77例(62.1%) 21 (27.3%) 56 (72.7%)
临床阶段
i ii 47 (37.9%) 27 (57.4%) 20 (42.6%) 11.200 0.001
iii iv 77例(62.1%) 21 (27.3%) 56 (72.7%)

RIPK4蛋白质的表达水平对所有154例可用。(一)包含IHC分析表明RIPK4细胞在卵巢浆液性癌等离子体明显高于卵巢浆液性囊腺瘤组织中( P < 0.001 )。此外,我们现在同形像抗体染色在正常卵巢一样消极控制和卵巢浆液性癌积极控制。对个别病人的护理(b) RIPK4免疫反应性的分数。

 3.2。沉默RIPK4克制OC细胞的迁徙和入侵的能力

RIPK4 mRNA表达水平的OC细胞系(SKOV3, SW626 CAOV3, A2780, OVCAR3, Coci1,嘿)和正常卵巢上皮细胞系(IOSE80被rt - pcr检测(图) 3(一个))。结果表明,OC组织和OC细胞系,RIPK4表达明显调节。探索的功能RIPK4 OC, RNAi-RIPK4被用来抑制RIPK4表达式在OC细胞系(图 3 (b))。通过伤口愈合(数字 3 (c)和 3 (d)和Transwell化验数据 3 (e)和 3 (f)),mobility-related能力SKOV3和OVCAR3细胞被证明是明显减少了RIPK4沉默而si-control治疗。

沉默RIPK4抑制OC细胞迁移和入侵。(一)rt - pcr进行评估RIPK4 OC和正常的卵巢细胞的表达。(b) RIPK4沉默是由使用核SKOV3和OVCAR3细胞。沉默RIPK4 OC细胞显著减少迁移能力,作为实验观察伤口愈合(c和d),和他们的入侵能力,观察到在Transwell化验(e和f)。皮下异种移植的图片所示, n = 8 (g)和肿瘤体积SKOV3皮下异种移植的RIPK4-silenced组和对照组(h)所示,数据显示为 的意思是 ± SD 统计学意义是表示如下: ∗ ∗ 代表 P < 0.01 和 ∗ 代表 P < 0.05 (未配对 t 以及)。

 3.3。沉默RIPK4抑制皮下异种移植的生长

EMT OC入侵和远端殖民是一个重要的一步。EMT的最终结果是转移和扩散。皮下异种移植可以显示RIPK4-related EMT对OC的恶性增殖的影响。是否沉默RIPK4抑制SKOV3细胞异种移植免疫缺陷小鼠的生长,我们建立了一个共有四皮下异种移植SKOV3-sh-RIPK4-silenced集团组成,而另一个4异种移植在免疫缺陷小鼠细胞SKOV3建立的向量控制。所有的老鼠都牺牲在8周后注射。如数据所示 3 (g)和 3 (h)的OC异种移植SKOV3-sh-RIPK4-silenced组显著小于对照组( P < 0.01 ),证实RIPK4可以促进OC体内的生长。

 3.4。RIPK4-Related信号路径的识别

功能化验证明RIPK4-silenced OC细胞表现出抑制肿瘤生长、迁移和入侵。探索功能通路包括RIPK4 OC, GSEA用来评估信号通路参与OC组在低和高RIPK4表达式。GSEA发现显著差异(笔名 P 值< 0.05, 罗斯福 < 0.05 浓缩的特点。结果显示,NF - κB EMT p53通路,肌细胞生成,顶端连接,缺氧不同浓缩通路密切相关的高RIPK4表达表型的肿瘤形成和发展OC(图 4(一))。EMT已被确定为一个经典的和有影响力的细胞过程中OC进展,无论肿瘤的早期或晚期肿瘤的阶段。RIPK4 mRNA表达的分析还显示无显著差异,以应对OC阶段,所以我们专注于EMT生物和途径研究。GSEA EMT的结果,浓缩(ES)得分为0.55,和归一化富集得分(NES)为2.12(数字 4 (b)和 4 (c))。此外,热点图说明EMT的特点与高RIPK4表达表型在很大程度上调节,如图 4 (d)。

GSEA结果。(a) GSEA确定十大通路TCGA RIPK4高表达组基于数据集包括数据从593 OC的病人。(b和c) GSEA表明RIPK4高表达组与EMT相关联。(d)基因分析的特征生成的热图所示比较RIPK4 RIPK4高表达组和低表达组。(e)免疫印迹试验结果表明,蛋白质的水平促进EMT通路减少SKOV3-sh-RIPK4细胞系。

 3.5。RIPK4沉默抑制EMT在OC细胞

进一步证实RIPK4之间的相关性和EMT在OC细胞中,世行和rt - pcr检测进行SKOV3和OVCAR3细胞检测波形蛋白的表达,钙和N-cadherin视为主要的间叶细胞标记EMT期间或上皮标记。结果在图 4 (e)表明,在RIPK4-silenced OC细胞波形蛋白和N-cadherin表达明显下调,而钙粘蛋白表达相应的调节。这些数据表明,击倒OC RIPK4表达抑制EMT的细胞。

 3.6。RIPK4促进il - 6 / STAT3-Mediated EMT OC进展

我们进一步探讨RIPK4-related机制参与EMT OC。基于先前的研究表明RIPK4可以激活NF - κB通路,STAT3 NF -至关重要 κB激活,激活il - 6 / STAT3通路导致EMT ( 7- - - - - - 12),我们旨在确定RIPK4诱发EMT通过il - 6摄氏度细胞。我们废除了RIPK4表达沉默shRNA序列,然后执行世行和rt - pcr检测。RIPK4-silenced OC的细胞,STAT3和p-STAT3水平明显下调,由世行化验(图 4 (e))。此外,STAT3的水平,il - 6和il - 6的目标基因SOSC1和SOSC3被rt - pcr检测显著下降。此外,STAT5B和间叶细胞生物标志物的水平(蛞蝓和扭曲)也显著减少RIPK4-silenced OC细胞(图 5(一个))。量化的减少RIPK4-silenced OC的il - 6水平细胞,我们测试了il - 6的浓度的培养基ELISA。如图 5 (b),il - 6的浓度在中显著表达下调的媒介SKOV3-sh-RIPK4细胞( P = 0.036 )。

RIPK4影响il - 6 / STAT3在OC轴,和il - 6的分泌促进SKOV3迁移和救助的流动RIPK4-silenced细胞。(一)rt - pcr结果表明,il - 6的水平目标基因和EMT生物标志物表达下调RIPK4-silenced OC细胞系相比,控制细胞系。结果显示为 的意思是 ± SD ( n = 6 每组)。(b) ELISA的上层清液中il - 6含量分析表明,RIPK4-silenced OC细胞培养均明显低于控制文化上层清液( P = 0.036 )。(c和d)增加il - 6的影响(50 μg / ml) SKOV3-sh-RIPK4-silenced和控制OC细胞被发现与伤口愈合实验。il - 6显著促进迁移SKOV3-sh-RIPK4-control细胞( P = 0.018 )。(e和f)此外,il - 6获救的迁徙能力SKOV3-sh-RIPK4-silenced细胞( P = 0.051 )。的比例差距消失,显示了入侵细胞数量。 ∗ ∗ P < 0.01 与控制(未配对 t 以及)。 ∗ P < 0.05 与控制(未配对 t 以及)。

 3.7。il - 6政府救了RIPK4-Silenced OC细胞的迁移和入侵

确定il - 6的潜在作用RIPK4-induced EMT,我们添加了il - 6 RIPK4-silenced OC细胞。作为显示在图 5(一个),il - 6显著提升SKOV3-RIPK4-control OC细胞的迁移。此外,il - 6救了迁移(数据 5 (c)和 5 (d))和入侵(数字 5 (e)和 5 (f)SKOV3-RIPK4-silenced OC的细胞。这些数据证实RIPK4诱导EMT通过il - 6摄氏度细胞(图 6)。

功能模型的il - 6参与抑制EMT的差别在OC进展对这些RIPK4表达式。hypoactivated RIPK4-silenced OC细胞il - 6的信号。少STAT3磷酸化,SOCS1/3的表达减少。因此,RIPK4-based il - 6中EMT OC的网络是一个决定因素。

 4所示。讨论

大约70%的卵巢癌病例被发现包含在最初的诊断腹腔转移。大多数病人死于营养不良和肠阻塞继发于腹腔转移利基( 26]。EMT是早期和至关重要的细胞在卵巢上皮癌肿瘤形成和发展 27- - - - - - 29日]。迄今为止,监管的关键因素和潜在tumourigenic EMT的和转移函数仍然知之甚少。据报道,NF -的激活 κB和il - 6 / STAT3通路可以促进EMT在各种癌症和阻塞NF - κB降低乳腺癌的转移。此外,先前的研究已经表明,RIPK4可以激活NF - κB通路,促进上皮癌的恶性行为。然而,是否RIPK4诱发EMT通过il - 6 / STAT3通路仍然需要探索恶性上皮肿瘤,特别是在OC。我们的研究结果表明,RIPK4 OC细胞和组织表达显著调节,和高水平的表达密切相关不良临床生存。此外,我们揭示了GSEA RIPK4诱导EMT OC。第一次,我们证明了RIPK4提升EMT在针对il - 6摄氏度,从而为早期诊断提供一种新的分子机制和一个潜在的目标治疗腹部转移OC。

位于21号染色体q22.3 RIPK4是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶c端地区11个锚蛋白重复和氨基端RIP-like激酶域( 21]。目前,RIPK4的作用在癌症tumourigenesis RIPK4仍然模糊的发展作用,及其OC的作用远未明朗。在目前的研究中,表达的增加RIPK4 OC组织和展示了OC细胞系,在OC显著预测预后不良。值得注意的是,高水平的RIPK4表达式也发现在三个常见的妇科癌症和睾丸生殖细胞肿瘤。现有的文献表明微分表达式和预后RIPK4在恶性肿瘤组织中的作用。例如,类似的结果的表达式和预后价值RIPK4被报道在胰腺癌,宫颈癌和结肠直肠癌 18, 19, 22]。相比之下,减少RIPK4被发现在肝细胞癌的表达和舌鳞状细胞癌( 23, 30.]。然而,这些研究并没有提供一个广泛的观点RIPK4恶性肿瘤。TCGA总的来说,我们基于数据的研究表明最初的潜在致癌作用RIPK4在三种常见妇科癌症。此外,生物信息学分析显示无显著差异RIPK4 OC阶段间的表达,这可能表明早期RIPK4参与OC肿瘤形成和发展。

EMT已经被确认为一种早期和上皮癌的重要一步。激活NF - κB已经发现EMT在肝癌的关键启动子 31日],结肠癌[ 32),胃癌 33),和其他各种癌症 34]。在当前的研究中,功能分析说明沉默RIPK4 OC细胞系大大限制迁徙和侵入性属性。先前的研究已经表明,RIPK4可以激活NF - κB通路和RAF1 / MEK / ERK信号在癌症肿瘤形成和发展 21]。De Oliveira等人发现,接受EMT的能力下降,修复骨骼肌进行修复的差别有关对这些RIPK4表达式( 35]。然而,这些作者没有调查潜在的丰富RIPK4之间的通路和基于大规模数量的OC的恶性肿瘤患者。相比以前的工作,我们是第一个提供新的见解的关键作用RIPK4作为癌基因参与p53通路,肌细胞生成,顶端连接,缺氧,特别是EMT GSEA分析TCGA 593 OC病人数据集的数据。在最近的研究中,RIPK4沉默的上皮的表达差别是伴随着对这些生物标志物(波形蛋白、蛞蝓、N-cadherin和扭曲)和upregulation间充质生物标志物的表达(钙)。

il - 6 / STAT3通路的激活可以阻止癌症的抗肿瘤免疫。我们最初证明RIPK4沉默诱导il - 6和STAT3的差别,对这些基因的表达,以及il - 6的目标SOSC1 SOSC3 [ 36]。il - 6分泌各种癌症细胞和癌症相关的成纤维细胞,导致肿瘤慢性炎症,然后结合IL-6R形成了il - 6 / IL-6R复杂[ 36]。这个复杂的提升磷酸化STAT3 (p-STAT3)表达和激活核translocation-induced效应基因,导致炎症、免疫反应和癌症肿瘤形成和发展 37]。此外,il - 6 / STAT3信号对NF -至关重要 κB激活。然而,以往的研究没有解决RIPK4是否激活诱导NF - il - 6 κB激活在恶性肿瘤。值得注意的是,我们发现沉默RIPK4抑制il - 6和SOCS1/3。此外,添加il - 6能够拯救RIPK4-silenced OC的迁徙和入侵能力的细胞,证实RIPK4的监管作用的il - 6 / STAT3通路。

 5。结论

值得注意的是,我们的研究有一定的局限性。首先,TCGA RIPK4的识别是基于数据库,但是我们没有进行体内研究进一步证实RIPK4可以诱导EMT OC。第二,潜在RIPK4和激素之间的联系,如雌激素和雄激素,并不在我们的研究调查。

总的来说,这项研究揭示了RIPK4-based il - 6网络是一个行列式EMT的OC和提供了一个新颖的诊断,治疗和预后的生物标志物OC。

 数据可用性

数据可以通过作者自己。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 作者的贡献

桓伊和弘扬燕赵苏是相等的贡献者。

 确认

本研究支持的中国青年国家科学基金会(国家自然科学基金委,81802604)和福建省自然科学基金(2019 j01512和2020 j01336号)。

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