文摘

我们描述了caspase-dependent协会和caspase-independent巨噬细胞凋亡机制诱导LpqH, 19 kDa结核分枝杆菌脂蛋白。LpqH TLR2激活触发,upregulation死亡受体和配体,其次是死亡受体信号级联激活半胱天冬酶8和发起者刽子手半胱天冬酶3。在这caspase-mediated阶段,线粒体因素参与线粒体跨膜电位的损失(9)、细胞色素c的释放和半胱天冬酶激活。有趣的是,caspase-independent途径也是确定;通过免疫印迹,线粒体凋亡诱导因子(AIF)是LpqH-treated巨噬细胞的细胞核和细胞溶质中演示。共焦显微镜显示易位AIF的大多数凋亡细胞的细胞核。这些发现强调了巨噬细胞死亡的复杂和冗余性质对分枝杆菌的反应。

1。介绍

巨噬细胞(MO)中细胞凋亡结核分枝杆菌(Mtb)感染主要集中关注其可能在疾病发病机理中的作用。许多发现支持这一观点;已经表明,致命的分枝杆菌菌株apoptogenic低于减毒同行(1)和莫proapoptotic毒性菌株的基因表达下调而发生相反的无毒分枝杆菌(2]。相比之下潜伏性感染,活动性结核病患者的基因的表达,促进细胞凋亡减少(3]。这些数据和识别的基因抑制莫结核分枝杆菌细胞凋亡在一些突变体(4)进一步支持添加到视图中结核分枝杆菌的能力,以防止宿主细胞的凋亡的死亡是一种毒性特征旨在保护其细胞的利基。另一方面,莫凋亡代表一个宿主先天免疫反应是由密苏里州凋亡减少细菌的生存能力(5- - - - - -7]。也有证据表明,树突细胞的摄取凋亡莫结核分枝杆菌感染可以通过过程称为cross-priming激活T细胞导致CD8 + T细胞的活化7,8]。也感兴趣的结核分枝杆菌的鉴定proapoptotic突变体诱导更高的T细胞免疫,有利于感染的控制(9]。

知识的机制参与的死亡mycobacteria-infected MOs大大增加在过去的十年。最初,它是作为外在特征类型,caspase-dependent细胞凋亡与肿瘤坏死因子-α激活(10,11]。最近的研究已经表明,莫分枝杆菌感染的细胞凋亡是一个复杂和组合的过程。一些报告文档内在的参与或线粒体途径。结核分枝杆菌感染减毒株导致线粒体外膜通透性与细胞色素c的释放和激活半胱天冬酶9 (12,13]。最近,内质网应激和溶酶体通路与巨噬细胞凋亡引起了分枝杆菌(14]。也报道,宿主细胞死亡可能显示坏死的特点尤其是增加杆状的负载(15]。这些观察结果可以表明分枝杆菌代替细胞凋亡坏死的机制传播和生存。

少数分枝杆菌分子参与巨噬细胞凋亡已确定;其中包括LpqH [16,17),计6 (11],PE_PGRS33 [18],PstS-1 [19]。我们进行了这个研究,目的是了解更好LpqH所使用的生化途径诱导细胞凋亡,特别知道线粒体参与的因素。LpqH是有趣的有几个原因;这是为数不多的分枝杆菌蛋白质,除了酰基团体拥有甘露糖残基(20.]。最近,我们证明了LpqH行为作为adhesin与甘露糖受体相互作用促进吞噬分枝杆菌(21]。LpqH诱发T细胞介导免疫性,尽管它也可能像TLR2受体激动剂会使T抗原呈递细胞(22]。

从上面的数据,很明显,mycobacteria-infected金属氧化物半导体的死亡有关,从力学上看复杂的现象。这种复杂性造成的发现我们现在。我们表明,除了依赖TLR2,死亡受体介导细胞凋亡,LpqH触发一个内在或线粒体途径,细胞色素c的参与和线粒体凋亡诱导因子(AIF),一个以前从未发现过的莫结核分枝杆菌引起的细胞死亡机制。

2。材料和方法

2.1。材料

鼠单克隆抗体(mab)对人类肿瘤坏死因子-α(克隆28401)和人类TNFR1和TNFR2(克隆22221)购买从研发系统(明尼阿波利斯,美国);马伯人类Fas(克隆ZB4)和FasL(克隆B-R17),半胱天冬酶8,半胱天冬酶9日和半胱天冬酶3购买从北部的细胞信号(美国普莱西德湖,纽约);马伯人类TLR2(克隆TL2.1)来自eBioscience(美国圣地亚哥,CA)和TLR4 (hta - 125)克隆获得圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。human-apoptosis的鼠单克隆抗体诱导因子(AIF)是来自圣克鲁斯生物技术(克隆E20)。一只山羊多克隆抗体对人体细胞色素c是购自圣克鲁斯生物技术(克隆C-20)。辣根peroxidase-conjugated老鼠控制同形像山羊免疫球蛋白抗体和免疫球蛋白来自Dako (Carpinteria、钙、美国)。细胞死亡检测酶联免疫吸附试验(ELISA) +来自罗氏诊断(潘茨堡,德国)。得到一个特定cell-permeable pancaspase抑制剂Z-VAD-FMK BD Pharmingen(美国圣地亚哥,CA)。Ficoll-Hypaque是从Amersham生物科学(美国新泽西州皮斯卡塔韦);多粘菌素B,朱红色红色,二甲亚砜(DMSO)来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。 A subcellular protein fractionation kit fractionation was obtained from Thermo Scientific (Rockford, IL, USA). The fluorescent lipophilic dye 3,3′ dihexyloxacarbocyanine iodide (DiOC6) was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR, USA).

2.2。分枝杆菌和隔离LpqH

一个本地分枝杆菌smegmatis应变(mc2155)及其对应的转换通过电穿孔包含1.8 kb SmaI片段的质粒p16R1包括LpqH脂蛋白的结构基因编码请捐赠的y张(MRC结核病感染及相关单位,哈默史密斯医院,伦敦,英国)。m . smegmatis菌株在麦德布鲁克7 h9培养基生长4 - 5天(洗液,正欲Cockeysville医学博士,美国)补充2%葡萄糖和潮霉素B(50毫克/毫升)。细菌被离心收获,用冰冷的钠磷酸盐缓冲剂(10毫米/ L)。隔离LpqH,细菌的细胞壁声波降解法获得的分数是20 KHz冰水(每个周期5分钟)。解决了蛋白质12%或15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到硝基。19 kDa LpqH乐队被确认通过免疫印迹马伯19,捐赠的结核病疫苗测试和研究材料合同,科罗拉多州立大学。为了获得LpqH诱导细胞凋亡,细胞壁分数是通过声波降解法和30μg蛋白质混合样品同等体积的减少缓冲(0.05毫米EDTA, 0.1% SDS, 1%甘油、10% 2-mercaptoethanol,和0.5毫米/毫升Tris-HCl pH值6.8),加热5分钟在95°C,加载到1μL 1.5毫米槽20厘米长的凝胶。电泳后,被转移到蛋白质硝基床单和沾染了朱红色红色确定19 kDa乐队;这个乐队的身份被确认与19马伯在平行的墨迹。之后,乐队被切除,随着在DMSO溶液,并与同等体积的碳酸盐沉淀/碳酸氢钠缓冲(0.05米,pH值9.6)。颗粒是冲洗三次冰冷的PBS和整除储存在20°C。蛋白质浓度测定洛瑞方法使用BSA作为标准。本机m . smegmatis电子转换硝化纤维膜和细胞壁分数19-kDa地带是切除和处理如上所述用于细胞凋亡检测控制。西方墨迹与19马伯未能证明LpqH原生的细胞壁m . smegmatis杆菌(没有显示)。

2.3。细胞凋亡检测来确定LpqH杀死人类Monocyte-Derived巨噬细胞的能力

血液样本是来自健康的捐赠者和单核细胞是由Ficoll-Hypaque梯度离心法分离。细胞培养在培养皿(美国纽约康宁公司康宁),rpmi - 1640年补充20%胎牛血清,5毫米/ L谷酰胺,5μg / mL penicillin-streptomycin, 37°C湿润5%股份有限公司₂的气氛。隔夜孵化后37°C,贴壁细胞培养与10%胎牛血清。这一步是需要摆脱不依从细胞,细胞死亡,和nonmacrophagic细胞。在文化和治疗后7天rpmi - 1640包含EDTA(5毫米/ L),在4°C 10分钟,激活巨噬细胞和细胞刮刀轻轻分离。冲洗后,细胞()被放置在12-well的平底盘子(美国纽约康宁公司康宁);这时,台盼蓝排斥显示> 95%细胞生存能力。此后,细胞被孵化为0.5 5或50μ克LpqH 1或24小时37°C。与100年控制,细胞被孵化μg蛋白存在于19 kDa地区的本地m . smegmatis细胞壁。细胞凋亡与细胞死亡用ELISA检测设备根据制造商的指示。板块与ELISA分析读者(美国Bio-Tek乐器,Winooski VT)。

2.4。检测细胞凋亡蛋白酶活化的免疫印迹和Pancaspase抑制剂抑制化验

巨噬细胞(5)孵化了μg LpqH 1 h。之后,得到了完整的细胞提取细胞后细胞溶解和涡100μL radioimmunoprecipitation分析缓冲区(50毫米Tris-HCl, pH值7.0,50 mM氯化钠,NP40 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,和0.1% SDS)浸泡20分钟在4°C。细胞溶解产物离心机(34025.6 g为15分钟4°C)和上层清液得到;35μg蛋白被17.5% sds - page和转移到解决聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF);与5%的脱脂牛奶PBS阻塞后,膜被孵化马伯半胱天冬酶8,9,和3稀释(1/1000),一夜之间,在4°C。冲洗后,膜被孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体稀释(1/1000),1 h,在室温下。反应乐队是由化学发光与西方SuperSignal硬脑膜可视化工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。抑制半胱天冬酶活性测定如下。Monocyte-derived巨噬细胞()preincubated 20 30分钟在37°Cμpancaspase抑制剂Z-VAD-FMK M。冲洗后,细胞被孵化与5μg LpqH 1或24小时37°C。细胞凋亡是像之前描述的那样用ELISA。

2.5。定量的死亡受体TNFR1 TNFR2, Fas及其配体TNF -α和Fas

量化TNF -α生产,细胞培养1 h和5μg LpqH或100μg蛋白存在于本地m . smegmatis19 kDa条。上层清液收集在离心5分钟和TNF - 390.6 gα测量后0、5、15、30、45、60分钟的治疗,根据制造商的指示酶联免疫试剂盒(试验设计公司,安阿伯市,美国)。重复的样本进行了分析与ELISA读者并与标准曲线。死亡受体及其配体的表达是由一个细胞表面ELISA方法。孵化后诱导细胞凋亡的细胞(),5μg LpqH 1 h在37°C,细胞被冲洗与PBS含1%胎牛血清和0.1%的南₃。鼠标马伯使用是:人类TNFR1 (1μg / mL,稀释1/100),人类TNFR2 (2μg / mL,稀释1/100),人类Fas (1μg / mL,稀释1:100),和人类FasL (0.5μg / mL,稀释1/100)。细胞凋亡诱导后,细胞被广泛冲洗和孵化1 h和上述每个抗体。为控制,无关紧要的同形像抗体。此后,细胞被冲洗与PBS和孵化1 h peroxidase-labeled山羊或鼠标anti-IgG抗体稀释1/1000。最后,100年μLof abt的解决方案添加到细胞。光学密度在405 nm ELISA读者阅读的(容易专家+、HyTech、奥地利)。

2.6。抑制分析评估的角色TLR2和TLR4和死亡受体及其配体在LpqH-Induced巨噬细胞凋亡

细胞preincubated为30分钟37°C和阻塞马伯人类TNF -α(1μg / mL),人类TNFR1 (5μg / mL),或者人类TNFR2 (1.5μg / mL)。抑制化验也表现了阻塞马伯人类Fas (500 ng / mL)和人类FasL (32 ng / mL)。研究toll样受体的作用诱导的细胞凋亡,细胞与阻塞马伯preincubated (20μTLR2和TLR4 g / mL)。控制同形像抗体。与抗体预培养后,没有清洗,5μg LpqH被加入到细胞的诱导凋亡由ELISA分析。

2.7。线粒体膜电位的评价与DiOC6流式细胞术

为了分析线粒体的参与,我们通过流式细胞术分析线粒体膜电位使用阳离子亲脂性的荧光染料3,3′-dihexyloxacarbocyanine碘(DiOC6)。损失DiOC6染色表明破坏线粒体内跨膜电位()通常与细胞凋亡有关23]。细胞(5 /毫升)孵化了μg LpqH 1和24 h和PBS洗了三次,和40 nM DIOC6加入颗粒为30分钟37°C在黑暗中。DiOC6准备从40毫米原液在DMSO和PBS稀释,pH值7.4,400海里的工作解决方案。细胞与PBS稀释,最后一卷1毫升,流式细胞术分析。

2.8。亚细胞分离和免疫印迹确定线粒体细胞色素c的释放,如果

金属氧化物半导体处理5μg LpqH 1和24小时受到亚细胞分离过程。使用亚细胞的胞质及核蛋白质提取蛋白质分离设备,以下协议从制造商(热电电子)。蛋白质浓度测定与Bio-Rad直流试验(美国大力神,CA)。蛋白质(50μg)在7.5%聚丙烯酰胺凝胶和sds - page分离转移到硝化纤维膜。阻塞后在室温下5%脱脂奶粉1 h,一夜之间,膜被孵化用鼠标马伯人类如果稀释1/200 TBS BSA渐变20 5%和0.01%;使用二次anti-mouse免疫球蛋白peroxidase-labeled抗体。山羊不同条孵化与多克隆抗体对人类细胞色素c,稀释在PBS渐变20 1/200,0.01%,一夜之间。二次抗体山羊免疫球蛋白与过氧化物酶标记使用稀释的1/1000。西部SuperSignal毫微微最大灵敏度衬底化学发光设备被用来揭示反应乐队。

2.9。免疫荧光检测AIF巨噬细胞的细胞核LpqH对待

易位AIF的线粒体在细胞凋亡细胞核被未经处理的细胞或细胞的免疫荧光分析处理LpqH 1和24 h。细胞被冲洗PBS和固定在1%多聚甲醛在PBS溶液。细胞悬浮液被cytospin放置到玻璃幻灯片之前poly-L-lysine对待。幻灯片洗一次PBS和下降0.05%皂素在PBS溶液添加了5分钟,冲洗与PBS和孵化1 h anti-AIF马伯,稀释的1/200,在室温下湿室;幻灯片是冲洗PBS和孵化一个45分钟的1/500稀释anti-mouse CY5 IgG抗体标记。幻灯片是安装与DAPI延长黄金不变色(分子探针)。细胞被检查了一个奥林巴斯BX51显微镜和激光扫描共焦显微镜LSM 5帕斯卡尔蔡司与软件2.8。

3所示。统计分析

比较个人的实验中,光密度(OD)的细胞,没有暴露在apoptogenic蛋白质被设置为1。试验中的所有其他OD值除以OD的未经处理的控制细胞提供一个相对细胞凋亡任意单位的价值。从独立的实验中获得的数据提出了均值±SE,和使用学生的条件之间的差异进行了分析以及和学生的搭配以及。差异和被认为是重要的。

4所示。结果

4.1。人类巨噬细胞的凋亡的死亡参与Caspase-Dependent机制

在我们实验室研究整个杆菌或细胞壁显示转换m . smegmatis应变,过表达LpqH脂蛋白诱发高水平的细胞凋亡在人类单核细胞的THP-1细胞系(数据没有显示)。探讨转染LpqH是否负责,我们孕育人类莫获得来自健康人外周血与0.5,5,或50μg LpqH孤立。作为一个控制,金属氧化物半导体与100年孵化μg蛋白存在于19-kDa硝基的本地人m . smegmatis不包含LpqH如图所示的免疫印迹(没有显示)。核小体的ELISA方法显示LpqH凋亡率高,明显高于那些由本地m . smegmatis蛋白质(图1(一);)。化验使用多粘菌素B排除有限合伙人参与(数据未显示)。探讨半胱天冬酶依赖性的细胞凋亡、蛋白质提取物凋亡细胞被sds - page分离,转移到PVDF床单,和孵化马伯检测还存在形式的激活。结果显示procaspases以及乐队还存在对应的激活亚型8、9(图3,1 (b))。

4.2。结核分枝杆菌LpqH激活TLR2 Proapoptotic作用

已是不争的TLR2和TLR4可能表现为细胞死亡受体,激活TLR2的细菌脂蛋白可能诱导细胞凋亡24,25]。调查如果这发生在LpqH-treated莫,我们进行抑制和阻断这些受体抗体检测。在人类细胞与马伯preincubated TLR2然后暴露于5μg LpqH,显著减少细胞凋亡水平(图2;)。这一发现表明,细胞凋亡诱导的交互TLR2图案出现在分枝杆菌脂蛋白。细胞凋亡的细胞preincubated马伯人类TLR4没有修改,找到符合这个受体被激活由有限合伙人优先主题而不是脂蛋白(25]。这些发现表明,TLR2上游的信号级联激活行为导致LpqH-induced莫凋亡的死亡。

4.3。Fas和FasL参与LpqH引发的巨噬细胞凋亡

信息FasL的角色在巨噬细胞分枝杆菌诱导细胞凋亡是稀疏的5];因此,我们调查了在LpqH-induced FasL及其受体细胞凋亡的作用。一个细胞ELISA分析显示,在细胞表面和LpqH孵化,Fas表达类似于未经处理的细胞。相比之下,膜结合FasL显著增加(;图3(一个))。这一发现是值得注意的,因为通常FasL释放有效地从细胞表面金属蛋白酶(26]。知道如果Fas和FasL细胞凋亡的作用,抑制化验。当MOs preincubated与阻塞对Fas和FasL马伯,细胞凋亡水平明显下降(图3 (b);;)。

4.4。肿瘤坏死因子的参与,α在巨噬细胞凋亡及其受体

肿瘤坏死因子-α生产期间LpqH-induced莫凋亡的ELISA方法测定细胞培养介质的孵化与5μg LpqH 15、30、45、60分钟。增加时间TNF -α观察值,最大60分钟(图4(一))。这时,细胞治疗LpqH TNF -发布α细胞数量明显高于那些与100年孵化μg本地m . smegmatis蛋白质存在于19-kDa地区(图4 (b);)。鉴于TNFR1的重要性和TNFR2在细胞毒性TNF -的能力α(27),他们的表情是由一个细胞表面ELISA分析过程。受体都是过表达后治疗5μg LpqH(图4 (c);)。知道TNF -α和死亡受体upregulation与诱导细胞凋亡,抑制和阻碍抗体进行了检测。这是观察到马伯TNF -α(),TNFR1 ()和TNFR2 ()减少细胞凋亡显著(图4 (d))。后者观察是有趣的因为TNFR2受体缺乏细胞死亡域(27,28]。通过细胞表面被发现在TNF - ELISA没有差异α膜之间的表达式LpqH-treated和未经处理的细胞(没有显示)。没有与一个同形像控制效果观察。

4.5。LpqH-Induced细胞凋亡的线粒体参与的因素

免疫印迹分析细胞凋亡由LpqH暴露显示激活半胱天冬酶9(图1 (b))需要线粒体因素的参与29日]。激活半胱天冬酶9需要apoptosome形成由细胞色素c促进从线粒体释放之时29日]。因此,我们获得的亚细胞分数从莫对待LpqH 24 h进行免疫印迹分析。细胞溶质,mAb抗体特定人类细胞色素c显示预期的15 kDa乐队(图5(一个))。进一步评估线粒体的作用,我们测试是否LpqH引起线粒体跨膜电位的损失()使用阳离子亲脂性的荧光染料DiOC6 [30.,31日]。在这项研究中,标记的荧光显微法莫显示线粒体的点状的细胞质模式特征标签,没有明显的质膜标签(数据没有显示)。与控制细胞相比,在LpqH-treated细胞,降低27.51% DiOC6标签(图5 (b)),表明干扰线粒体内跨膜电位(),一个经常改变与细胞凋亡相关(31日]。

4.6。Caspase-Independent LpqH-Induced凋亡机制:凋亡诱导因素的作用(AIF)

针对线粒体的含义caspase-dependent细胞凋亡的诱导因素,我们认为可能caspase-independent因素也可能参与LpqH-induced莫死亡。因此,我们进行了化验pancaspase抑制剂Z-VAD-FMK(图6(一))。在细胞治疗LpqH 1 h,有细胞凋亡减少49.08% (),而在细胞治疗LpqH 24 h,减少细胞凋亡是仅为19.41% ()。这个建议caspase-independent机制的作用。完善,多种凋亡刺激后,如果正迅速从线粒体释放和迁移核诱导染色质凝结和细胞死亡反应迟钝的半胱天冬酶抑制剂(32,33]。因此,我们研究了免疫印迹AIF的亚细胞分布在细胞治疗LpqH 24小时。观察在细胞核和细胞溶质,紧身上衣乐队,其中一个57 kDa,分子量对应于激活或截断AIF(图6 (b));上带对应于uncleaved AIF [32,33]。来证实这些发现,我们进行免疫荧光CY5-labeled马伯AIF;许多共焦显微镜照片在中央细胞检查的一部分。在细胞治疗LpqH 1和24 h,易位的如果在许多细胞核被视为红色荧光斑点或大规模荧光(图6 (c));红色荧光结果的colocalization CY5(红色荧光)标签如果和DAPI核染色(蓝色荧光)。不受影响或不及时治疗控制细胞显示如果排放CY5红色荧光,局部细胞质中,线粒体标记(图的一个点状的模式特征6 (c))。这项工作被用来量化AIF核易位3独立实验;照片拍摄在几个随机选择字段,以及定量分析至少500细胞/条件是得分显示如果在核(图6 (d));类似的细胞阳性百分比AIF 1(67.7%)和24小时(59.5%)。

5。讨论

虽然apoptogenic LpqH前所报道的能力(16,17),这项研究提供了有关机制的新观点。结果表明,外在和内在机制,包括如果搬迁,共同行动引起凋亡的死亡的人类与LpqH莫挑战。外在或受体介导的通路,一种新的观察被包围的FasL的过度表达,蛋白质与高效裂解细胞表面的金属蛋白酶(26]。有趣的是,膜结合FasL比可溶性更强大的凋亡诱导物FasL [34]。这个属性可以在结核病相关自结核性肉芽肿含有大量的巨噬细胞表面表达FasL [35];这就提出了一个可能性,这些FasL武装细胞可以通过直接接触杀死Fas-expressing细胞肉芽肿内。的upregulation不仅是另一个新的观察TNF -α而且TNFR1和TNFR2受体;增加表达显著抑制分析如图所示的阻塞马伯显著减少细胞凋亡水平。这一发现提出的问题如何TNFR2参与LpqH诱导细胞死亡在TNFR1相比,考虑到TNFR2缺乏一个死域。据报道,TNFR2可能参与细胞凋亡诱导内源性TNF -α,消耗凋亡信号,或者增加TNFR1表达(27,28]。

在这项研究中我们发现,在莫LpqH引起的死亡,TLR2的上游激活细胞凋亡级联信号。这是证明与阻塞抗体抑制化验。像其他细菌脂蛋白LpqH TLR2受体激动剂,可以激活细胞产生促炎细胞因子(22]或触发宿主细胞的死亡16,17]。LpqH的主题活动TLR2未知;酰基组脂蛋白的可能,建议通过研究人工细菌脂蛋白主题(36]。当TLR2激活LpqH行为作为一种细胞死亡受体,在这项研究中所示,当它将调解促炎信号保持有趣的还没有解答的问题。

本研究的一个有趣的发现是明显的合作发现外在和内在途径引起帽细胞凋亡。事实上,激活半胱天冬酶9和从线粒体细胞色素c的释放到胞质了。当给定凋亡刺激诱导线粒体外膜(石)渗透率,从线粒体细胞色素c的释放的胞质介导apoptosome形成;这种大分子APAF-1的复杂相互作用的结果,ATP, procaspase 9,裂解成其活性形式。反过来,激活半胱天冬酶9劈开和激活procaspase 3,从而引发caspase-dependent凋亡的刽子手阶段(29日]。此外,如流式细胞仪所示使用亲脂性的荧光染料DiOC6发现线粒体跨膜电位的降低;内膜的这种变化表明透化作用,少一个细胞凋亡特征比石透化作用但经常与细胞色素c的释放有关37]。连接机制的外在途径诱导细胞凋亡的线粒体途径需要进一步研究。描述,半胱天冬酶8可能裂开(BH3-interacting域死亡受体激动剂),一个proapoptotic Bcl2 (b细胞淋巴瘤2)家庭成员;然后截断投标本地化石,它促进了伯灵顿(Bcl-2-associated X蛋白)激活,导致释放到胞质proapoptotic或从线粒体凋亡分子(38]。

上述发现了线粒体参与caspase-dependent机制触发莫LpqH曝光后死亡。因为它是认识到线粒体也可以释放因素参与caspase-independent细胞死亡(37),我们认为这可能。这也是娱乐pancaspase抑制剂的影响有限,以避免在LpqH-challenged细胞凋亡。proapoptotic分子中发布与石渗透率是如果,这已被证明是经常参与caspase-independent凋亡[39]。如果是线粒体黄素蛋白的双重功能,在线粒体参与氧化磷酸化,生活功能,当线粒体,它引起的细胞死亡(39]。凋亡刺激后,如果可以通过钙蛋白酶或组织蛋白酶裂解产生截断57-kDa形式,一旦释放细胞溶质,迁址至细胞核促进chromatinolysis和程序性细胞死亡(33]。在这项研究中,在细胞治疗LpqH,如果被免疫印迹在细胞核和细胞溶质在较小程度上。在这两个位置,两个乐队被发现,一个57 kDa,对应于截断AIF的可能。此外,通过这项工作,共焦显微镜,如果大多数细胞的细胞核的易位在1和24小时。如果释放的机制,它已经表明,过度PARP-1生成PAR聚合物与诱导的线粒体colocalize解放AIF的胞质与随后的易位细胞核(40]。可能连接caspase-dependent和caspase-independent途径的另一个因素是半胱天冬酶3,这可能分裂核PARP-1 [41]。

如果都集中关注不仅是细胞死亡的典范,也为其在病理条件下的作用。它参与肿瘤细胞的死亡与细胞毒性药物和治疗各种神经病理过程(42]。细胞死亡的参与,如果一直在报道感染过程包括艾滋病毒等病毒感染,(43],狂犬病[44),冠状病毒(45]。在某些细菌感染,如果触发感染细胞的死亡,包括幽门螺杆菌(46),肺炎球菌(47),而伯纳特氏立克次氏体感染(48]。关于致病性分枝杆菌,AIF-induced莫死亡据报道发生在THP-1单核细胞和牛莫感染体外牛分枝杆菌(49,50]。这些观察,它应该添加显示,如果提供的数据在此可以参与人类的死亡莫LpqH对待,结核分枝杆菌细胞壁,19 kDa脂蛋白。

6。结论

我们的研究文件的高容量和多功能性Mtb脂蛋白,确保人类monocyte-derived巨噬细胞的死亡。它还显示了高细胞死亡过程的复杂性以及外在和内在的细胞凋亡途径合作。最有趣的和以前未报告的观察线粒体凋亡因子的参与(AIF)巨噬细胞死亡引发的Mtb脂蛋白。此前研究的分子机制和合作的重要性death-receptor和线粒体介导的细胞凋亡。

确认

这项工作被授予41588米和学生支持格兰特(Registro 195122)从Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia在墨西哥。单克隆抗体来LpqH请捐赠的美国国立卫生研究院的结核病研究材料,科罗拉多州立大学合同第一- ai - 40091(柯林斯堡有限公司、美国)。作者感谢Tzipe Govezensky统计分析和米格尔Tapia共焦显微镜研究。他们感谢西班牙de Rehabilitacion巴菲捐血的外套。