Notch信号介导肿瘤坏死因子-α全身的il - 6生产培养呈Synoviocytes风湿性关节炎

文摘

据报道,切口家庭在滑膜组织中蛋白质表达和参与的扩散synoviocyte类风湿性关节炎(RA)。本文的目的是调查是否Notch信号介导肿瘤坏死因子-α全身的细胞因子的生产培养呈synoviocytes从RA (fls的)。暴露的RA fls的TNF -α(10 ng / ml)导致增加Hes-1, Notch信号的目标基因和标记upregulation等级2,Delta-like 1, Delta-like 3 mRNA水平。堵塞的Notch信号γ分泌酶抑制剂(榫眼)抑制il - 6分泌TNF - RA fls的回应α虽然治疗缺口的重组融合蛋白配体Delta-like 1推广这样的反应。肿瘤坏死因子-α在OA fls的刺激也诱导il - 6分泌;然而,Hes-1水平仍不受影响。我们的数据确认功能Notch通路参与风湿性关节炎的病理生理学fls的可能为RA的治疗提供一个新的目标。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)的特点是慢性炎症和进步的多个关节,导致白细胞入侵,血管翳形成,进步软骨退化,和侵蚀的骨头1]。虽然RA发病的确切机制并不明确,有人建议,激活synoviocytes可能起着重要的作用,主要通过扩散在发炎滑液,和生产的促炎细胞因子、基质金属蛋白酶(MMPs),和趋化因子(2]。细胞因子分泌RA synoviocytes包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1α(il - 1α),interleukin-1β(il - 1β)、白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-8(引发)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)3]。在这些细胞因子中,TNF -α似乎是主要的促炎细胞因子,因为它是已知的强烈诱导il - 6,引发,gm - csf,甚至在synoviocytes本身;然而,细胞因子的精确分子机制生产针对TNF -α刺激是没有澄清4]。

Notch信号通路是高度保守的超越物种和多种细胞功能中起着至关重要的作用,包括细胞增殖、分化和细胞凋亡5]。到目前为止,四个级距受体(等级1 - 4)和五个配体(Delta-like 1、3、4;Jagged-1, 2)已确定在哺乳动物。配体结合时,受体的胞内域(ICD) proteolytically裂解和易位到细胞核,其与RBP-J associatesκ转录因子和调节的几个目标基因的表达,如基本helix-loop-helix (bHLH)蛋白质hairy-enhancer像1 - (Hes-1)和Hes-5 [6]。

一些早期的报告显示功能Notch通路参与RA滑膜炎的病理生理学。Yabe Ishii等人,等人表明,缺口同系物的表达式模式从OA滑膜和RA患者与正常人不同7,8]。另一份报告显示notch 1的表达在synoviocytes notch 1片段的存在核的RA synoviocytes并建议在TNF - notch 1信号的参与α全身扩散RA synoviocytes [9]。肿瘤坏死因子-α诱导表达的il - 6、MMP11 notch 1, Notch-4, Jagged-2 RA fls的(10,11]。可是,切口分子的表达模式在培养synoviocyte争议和il - 6的表达增加之间的关系或MMP11和TNF - Notch信号分子响应α刺激仍不清楚。在这项研究中,我们证明了Notch信号介导肿瘤坏死因子-α全身的分泌il - 6的表达模式在RA fls的受体和配体在TNF -α刺激不同于先前报道。

2。材料和方法

2.1。病人

滑膜组织样本来自RA患者(,一个男,三个女性,平均年龄)和OA (,一个男,两个女性,平均年龄全膝关节置换的时候。所有RA患者完成了各自的美国风湿病协会标准(12]。所有由经过认证的风湿病学家OA患者评估和诊断基于标准开发的ACR OA的诊断小组委员会(13]。书面同意后被从所有患者获得完全的解释的过程符合要求的生物医学研究伦理委员会江苏大学的附属医院。

2.2。制备呈Synoviocytes

RA fls的滑膜组织中分离的根据以前描述的方法(14]。短暂,滑膜组织收集碎瓶和培养的外植体块。14天内,纤维母细胞迁移从组织外植体和汇合的单层膜形成的。收集的细胞被胰蛋白酶化然后在烧瓶扩张在杜尔贝科37°C的修改鹰介质(美国BRL Gibco)补充10%热灭活胎牛血清(美国BRL Gibco)、青霉素100单位/毫升和100μ克/毫升链霉素。成纤维细胞间通道3和5被用于每个实验之后被形态学鉴定和纯度分析。骨关节炎(OA) fls的同样的准备。

2.3。治疗与肿瘤坏死因子- fls的α切口抑制剂和配位体融合蛋白

肿瘤坏死因子-的动力学分析α全身的切口Hes-1目标基因和细胞因子的表达生产,fls的每口井被播种到12-well文化板块,随后与TNF -刺激α(10 ng / mL,研发系统,阿宾顿,英国)不同时期。刺激后,文化上层清液被收集并保存在−测量80°C的il - 6和ELISA引发,而细胞细胞溶解试剂盒中的试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) RNA隔离。观察TNF - Notch信号的影响α全身的细胞因子生产、切口抑制剂、榫眼(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和配位体融合蛋白,Delta-like 1(研发系统,阿宾顿,英国),也被添加到系统与TNF -文化α。

2.4。通过ELISA测定il - 6和引发

il - 6的浓度和引发文化上层清液测定通过使用商业ELISA试剂盒(美国圣地亚哥eBioscience)根据制造商的建议。

2.5。RNA隔离和实时rt - pcr

决心的切口的mRNA表达受体,配体和目标基因Hes1总RNA提取fls的有或没有刺激通过使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。互补脱氧核糖核酸是由反转录与低聚糖(dT)总RNA提取。实时PCR Notch信号分子和一个参考基因(β肌动蛋白)进行LightCycler仪器(罗氏分子诊断,曼海姆,德国)与SYBRgreen mastermix工具包(豆类、志贺、日本)。目标基因表达相对规范化β肌动蛋白。引物是向前(5′-TCAGCGGGATCCACTGTGAG-3′)和反向(5′-ACACAGGCAGGTGAACGAGTTG-3′)的切口1;转发(5′-TGCCAAGCTCAGTGGTGTTGTA-3′)和反向(5′-TGCTAGGCTTTGTGGGATTCAG-3′)切口2;转发(5′-GGTTCCCAGTGAGCACCCTTAC-3′)和反向(5′-GTGGATTCGGACCAGTCTGAGAG-3′)切口3;转发(5′-ACCTGCTCAACGGCTTCCA-3′)和反向(5′-AGCTTCTGCACTCATCGATATCCTC-3′)切口4;转发(5′-ACCTGCTCAACGGCTTCCA-3′)和反向(5′-AGCTTCTGCACTCATCGATATCCTC-3′) Jagged-1;转发(5′-ACCAGGTGGACGGCTTTGAG-3′)和反向(5′-CCCGGGATGCAATCACAGTAATA-3′)锯齿状2;转发(5′-TGGGCTACTCCGGCTTCAAC-3′)和反向(5′-ACAGGTAGGCATCACCGAGGTC-3′)为Delta-like 1;转发(5′-TCAACAACCTAAGGACGCAGGAG-3′)和反向(5′-CTACATCTTCAGGGCGATTCCAA-3′) Delta-like 3;转发(5′-GTCCAACTGTGGCAAACAGCA-3′)和反向(5′-AGCATATCGCTGATATCCGACACTC-3′) Delta-like 4; forward (5′-GACTGTGAAGCACCTCCG-3′) and reverse (5′-GTCATGGCGTTGATCTGG-3′) for Hes1; forward (5′-GAAGTCCCTCACCCTCCCAA-3′) and reverse (5′-GGCATGGACGCGACCA-3′) forβ肌动蛋白。

2.6。统计分析

双尾学生的以及用于确定显著差异(团体之间)。

3所示。结果

3.1。肿瘤坏死因子-α刺激诱发的Notch信号激活呈Synoviocytes从RA (FLS的)

我们首先确定肿瘤坏死因子的影响α在RA fls的Notch信号分子的表达通过实时PCR。暴露的RA fls的TNF -α导致一个渐进的,时间增加Hes-1 mRNA水平,目标基因的Notch信号,达到最大(图16 - 24 h后刺激1(一))。mrna的四个受体和五个Notch信号的配体也被发现与肿瘤坏死因子- RA fls的刺激α(10 ng / mL) 24 h。如图1 (b)肿瘤坏死因子-α刺激诱导显著upregulation等级2,相比之下,其他三个受体的水平持平。肿瘤坏死因子-α也显著增加的mRNA表达两个配体,Delta-like 1和Delta-like 3,而其他三个配体的表达(图未受到影响1 (c))。这些数据表明,在TNF - Notch信号被激活α在RA fls的刺激。

3.2。Notch信号介导肿瘤坏死因子-α全身的il - 6生产fls的RA

肿瘤坏死因子-α刺激诱导明显分泌il - 6和引发的RA fls的,达到一个最大值(图24 h的刺激2(一个))。上面提到的测试是否激活了Notch信号介导这一过程,我们首先确定榫眼的影响,一个等级信号传导抑制剂,TNF -α刺激细胞因子分泌。Coincubation这样阻断剂抑制il - 6分泌TNF -的反应α剂量依赖性的方式;然而,榫眼并未显著降低引发分泌(图2 (b))。确认Notch信号作为调停人的角色TNF -α全身的il - 6分泌,我们对人类的影响切口的重组融合蛋白配体Delta-like TNF - 1α全身的il - 6分泌。作为显示在图2 (c),当Delta-like TNF - 1蛋白质添加在一起α,增强il - 6生产观察时间的方式。Delta-like 1蛋白质的便利化il - 6分泌也存在剂量依赖的相关性和最大响应在10μ克/毫升(图2 (d))。

3.3。肿瘤坏死因子的影响,α刺激在OA fls的il - 6和Hes-1生产

测试是否Notch信号也可以调解在OA fls的il - 6生产,我们确定肿瘤坏死因子——的能力α诱导il - 6分泌和Hes-1 mRNA表达在人类OA fls的主。自发分泌il - 6的培养OA fls的明显低于RA fls的,虽然TNF -α刺激诱导标志着RA和OA fls的il - 6分泌fls的(图3(一个))。在OA fls的基底Hes-1 mRNA表达也显著低于RA fls的;然而,与RA fls的TNF -α刺激不增加Hes-1 mRNA表达在OA fls的(图3 (b))。这一结果表明,缺口信号参与TNF -α全身的il - 6 RA fls的生产应该是唯一的。

4所示。讨论

呈synoviocytes (fls)也称为滑膜成纤维细胞(SF),滑膜关节的居民间充质细胞15]。激活fls的RA的设置导致的生产各种细胞因子、小分子炎症介质,蛋白水解酶负责的渐进破坏关节软骨和骨4,10]。激活fls的可能是由细胞因子,其中TNF -α是至关重要的。激活TNF - fls的α进而产生il - 6、il - 1β,甚至本身维持当地监管反馈回路,使关节炎症。这样的机制已被证实肿瘤坏死因子的临床疗效α阻断剂治疗RA滑膜炎。然而,尚不清楚有多少信号通路激活TNF - fls的内α刺激,因此,信号通路可能是替代临床干预的目标。

早期的一些研究,报道切口分子的表达在RA滑膜和切口的激活信号的参与培养fls的(9,11,16),让我们测试的角色等级信号的细胞因子分泌RA fls的TNF -的反应α刺激。本研究首次发现,肿瘤坏死因子-α刺激导致渐进,Hes-1 mRNA水平RA fls的时间增加,达到一个最大值在16 - 24 h的刺激。Hes-1是最的特征,γ切口-secretase-dependent转录目标基因,调节表达Hes-1代表了Notch信号激活。一项研究也表明TNF -α诱导切口的观察信号的引出核易位的切口胞内域研究所培养RA fls的(9]。然而,同样的研究报道,TNF -α治疗(200 pg / mL)调节等级1的表达,等级4,和锯齿状的2,这是完全不同于我们的结果,TNF -α刺激(10 ng / mL)诱导显著upregulation等级2和两个配体,Delta-like 1和Delta-like 3。这种多样性可能是由于不同的刺激TNF -的浓度α在实验系统或使用不同的文化。事实上,切口受体或配体的表达谱在当地RA滑膜组织也不同在先前的报道7,8,11]。然而,我们的结果证实,肿瘤坏死因子-α可以在培养RA诱导激活Notch信号fls的。

肿瘤坏死因子-α已经被证明可以诱导细胞因子在RA fls的生产,如il - 6和引发3,10,11]。我们还观察到生产的增加il - 6和TNF -引发α刺激,与先前的报道一致。fls的内层的衬里的显示il - 6的主要来源的原位杂交和免疫组织化学研究。培养RA fls的自发产生il - 6,产量明显增加了TNF -α的功能,因此,针对读者产生il - 6可能改善类风湿性关节炎的临床结果没有抑制系统性免疫(3,10]。

测试是否激活了Notch信号调节细胞因子的生产在回应TNF -α榫眼,刺激γ分泌酶抑制剂,添加到文化系统阻止Notch信号的激活。我们发现榫眼抑制il - 6分泌TNF -的反应α剂量依赖性的方式,然而,它并没有显著降低引发的分泌。确认Notch信号作为调停人的角色TNF -α全身的il - 6分泌,我们也证明了Delta-like 1融合蛋白与肿瘤坏死因子-加在一起α,增强il - 6生产时间和剂量依赖性的方式。在我们的研究中,TNF -α刺激也可能诱发显著il - 6分泌OA fls的RA fls的。然而,与RA fls的TNF -α刺激不增加Hes-1 OA fls的mRNA的表达。这样的目标不一致的结果表明,除了Hes-1 Notch-mediated转录激活应该探索。或者,可能有目标的CSL il - 6的启动子序列。类似的研究策略已报告在最新一期出版的报纸17]。通过芯片分析,Keerthivasan等人报告ROR -镍镉直接结合γt和IL-17推动者和调节Th17细胞分化(IL-17感应)。需要进一步实验来测试等级是否可以直接绑定到il - 6推动者。

读者产生il - 6的功能已被报道在NF -监管κB-dependent途径。事实上,一些有效的anti-RA目前已知药物抑制NF -κB及其级联激活。在这里我们也报道,Notch信号介导的肿瘤坏死因子-α全身的il - 6在培养RA fls的生产也可以作为潜在的治疗目标信号。我们还证明了Notch信号的激活在RA患者辅助T细胞(18]。基于这些考虑,使用的抑制剂γ分泌酶(已经在使用治疗阿尔茨海默病)阻止激活Notch信号RA治疗(可能是一个可行的方法19]。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本文支持由中国自然科学基金会(30872335,30872335),医学科学技术发展基金会江苏省卫生部门(H200950)和江苏政府海外研究奖学金。

引用

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