滑膜组织样本来自RA患者( n = 4 ,一个男,三个女性,平均年龄 54.7 ± 2 0.1 )和OA ( n = 3 ,一个男,两个女性,平均年龄 51.3 ± 10.4 全膝关节置换的时候。所有RA患者完成了各自的美国风湿病协会标准( 12]。所有由经过认证的风湿病学家OA患者评估和诊断基于标准开发的ACR OA的诊断小组委员会( 13]。书面同意后被从所有患者获得完全的解释的过程符合要求的生物医学研究伦理委员会江苏大学的附属医院。

RA fls的滑膜组织中分离的根据以前描述的方法( 14]。短暂,滑膜组织收集碎瓶和培养的外植体块。14天内,纤维母细胞迁移从组织外植体和汇合的单层膜形成的。收集的细胞被胰蛋白酶化然后在烧瓶扩张在杜尔贝科37°C的修改鹰介质(美国BRL Gibco)补充10%热灭活胎牛血清(美国BRL Gibco)、青霉素100单位/毫升和100 μ克/毫升链霉素。成纤维细胞间通道3和5被用于每个实验之后被形态学鉴定和纯度分析。骨关节炎(OA) fls的同样的准备。

肿瘤坏死因子-的动力学分析 α全身的切口Hes-1目标基因和细胞因子的表达生产, 1 × 10 5 fls的每口井被播种到12-well文化板块,随后与TNF -刺激 α(10 ng / mL,研发系统,阿宾顿,英国)不同时期。刺激后,文化上层清液被收集并保存在−测量80°C的il - 6和ELISA引发,而细胞细胞溶解试剂盒中的试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) RNA隔离。观察TNF - Notch信号的影响 α全身的细胞因子生产、切口抑制剂、榫眼(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和配位体融合蛋白,Delta-like 1(研发系统,阿宾顿,英国),也被添加到系统与TNF -文化 α。

il - 6的浓度和引发文化上层清液测定通过使用商业ELISA试剂盒(美国圣地亚哥eBioscience)根据制造商的建议。

决心的切口的mRNA表达受体,配体和目标基因Hes1总RNA提取fls的有或没有刺激通过使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。互补脱氧核糖核酸是由反转录与低聚糖(dT)总RNA提取。实时PCR Notch信号分子和一个参考基因( β肌动蛋白)进行LightCycler仪器(罗氏分子诊断,曼海姆,德国)与SYBRgreen mastermix工具包(豆类、志贺、日本)。目标基因表达相对规范化 β肌动蛋白。引物是向前(5′-TCAGCGGGATCCACTGTGAG-3′)和反向(5′-ACACAGGCAGGTGAACGAGTTG-3′)的切口1;转发(5′-TGCCAAGCTCAGTGGTGTTGTA-3′)和反向(5′-TGCTAGGCTTTGTGGGATTCAG-3′)切口2;转发(5′-GGTTCCCAGTGAGCACCCTTAC-3′)和反向(5′-GTGGATTCGGACCAGTCTGAGAG-3′)切口3;转发(5′-ACCTGCTCAACGGCTTCCA-3′)和反向(5′-AGCTTCTGCACTCATCGATATCCTC-3′)切口4;转发(5′-ACCTGCTCAACGGCTTCCA-3′)和反向(5′-AGCTTCTGCACTCATCGATATCCTC-3′) Jagged-1;转发(5′-ACCAGGTGGACGGCTTTGAG-3′)和反向(5′-CCCGGGATGCAATCACAGTAATA-3′)锯齿状2;转发(5′-TGGGCTACTCCGGCTTCAAC-3′)和反向(5′-ACAGGTAGGCATCACCGAGGTC-3′)为Delta-like 1;转发(5′-TCAACAACCTAAGGACGCAGGAG-3′)和反向(5′-CTACATCTTCAGGGCGATTCCAA-3′) Delta-like 3;转发(5′-GTCCAACTGTGGCAAACAGCA-3′)和反向(5′-AGCATATCGCTGATATCCGACACTC-3′) Delta-like 4; forward (5′-GACTGTGAAGCACCTCCG-3′) and reverse (5′-GTCATGGCGTTGATCTGG-3′) for Hes1; forward (5′-GAAGTCCCTCACCCTCCCAA-3′) and reverse (5′-GGCATGGACGCGACCA-3′) for β肌动蛋白。

双尾学生的 t 以及用于确定显著差异( P ≤ 0.05 团体之间)。

我们首先确定肿瘤坏死因子的影响 α在RA fls的Notch信号分子的表达通过实时PCR。暴露的RA fls的TNF - α导致一个渐进的,时间增加Hes-1 mRNA水平,目标基因的Notch信号,达到最大(图16 - 24 h后刺激 1(一))。mrna的四个受体和五个Notch信号的配体也被发现与肿瘤坏死因子- RA fls的刺激 α(10 ng / mL) 24 h。如图 1 (b)肿瘤坏死因子- α刺激诱导显著upregulation等级2,相比之下,其他三个受体的水平持平。肿瘤坏死因子- α也显著增加的mRNA表达两个配体,Delta-like 1和Delta-like 3,而其他三个配体的表达(图未受到影响 1 (c))。这些数据表明,在TNF - Notch信号被激活 α在RA fls的刺激。

肿瘤坏死因子- α刺激诱导明显分泌il - 6和引发的RA fls的,达到一个最大值(图24 h的刺激 2(一个))。上面提到的测试是否激活了Notch信号介导这一过程,我们首先确定榫眼的影响,一个等级信号传导抑制剂,TNF - α刺激细胞因子分泌。Coincubation这样阻断剂抑制il - 6分泌TNF -的反应 α剂量依赖性的方式;然而,榫眼并未显著降低引发分泌(图 2 (b))。确认Notch信号作为调停人的角色TNF - α全身的il - 6分泌,我们对人类的影响切口的重组融合蛋白配体Delta-like TNF - 1 α全身的il - 6分泌。作为显示在图 2 (c),当Delta-like TNF - 1蛋白质添加在一起 α,增强il - 6生产观察时间的方式。Delta-like 1蛋白质的便利化il - 6分泌也存在剂量依赖的相关性和最大响应在10 μ克/毫升(图 2 (d))。

测试是否Notch信号也可以调解在OA fls的il - 6生产,我们确定肿瘤坏死因子——的能力 α诱导il - 6分泌和Hes-1 mRNA表达在人类OA fls的主。自发分泌il - 6的培养OA fls的明显低于RA fls的,虽然TNF - α刺激诱导标志着RA和OA fls的il - 6分泌fls的(图 3(一个))。在OA fls的基底Hes-1 mRNA表达也显著低于RA fls的;然而,与RA fls的TNF - α刺激不增加Hes-1 mRNA表达在OA fls的(图 3 (b))。这一结果表明,缺口信号参与TNF - α全身的il - 6 RA fls的生产应该是唯一的。