缺乏肠上皮Atg7影响Paneth细胞颗粒形成但不妥协在肠道免疫内稳态

文摘

autophagy-related基因的遗传多态性与风险增加有关炎症性肠病(IBD)发展。自噬是一个基本的过程参与几个细胞细胞间隙和nonapoptotic程序性细胞死亡等事件。此外,自噬可能参与肠道免疫内稳态由于其参与细胞内病原体的消化和抗原表达。在目前的研究中,自噬在肠道上皮细胞层的作用进行了研究。肠道上皮细胞是至关重要的维持肠道内稳态,和缺陷在这个障碍已经与炎症性肠病的发病机制有关。因此,小鼠肠上皮删除Atg7生成在不同的小鼠模型和调查。基因敲除小鼠显示减少颗粒大小和Paneth细胞的溶菌酶水平降低。然而,这是可有可无的肠道免疫内稳态和没有影响敏感性实验结肠炎诱导的小鼠模型。

1。介绍

炎症性肠病(IBD)和它的两个主要亚型克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性炎性疾病复发的胃肠道大约影响到400年的100000的成年人在西方国家(1]。病人患有不同的症状包括腹痛、腹泻、直肠出血、体重减轻、和昏睡。炎症性肠病的发病机制仍在调查之中,但有几个因素已被证明在炎症性肠病的病因学中发挥作用包括环境诱因、遗传因素、细菌菌群,和一个overreactive免疫反应。一个普遍接受的理论,疾病出现由于不正常的粘膜免疫系统之间的相互作用和遗传易感细菌微生物区系人类。在健康个体,内部粘膜组织分离肠道内腔包括食物抗原和细菌的肠上皮屏障对肠道内稳态起着至关重要的作用。上皮屏障功能障碍已被证实可能诱发肠道炎症(2,3]。

在确定遗传因素为炎症性肠病的发展提供风险增加,如ATG16L1 autophagy-related基因,体内基因LRRK2 IRGM1,表明自噬调节异常的含义在炎症性肠病的发病机制4- - - - - -6]。已经证明自噬是细胞内稳态的基本是参与细胞间隙。细胞内成分的自噬过程中,如年龄和受损的细胞器或蛋白质是由细胞膜包围和交付为降解溶酶体囊泡。此外,自噬是参与等细胞过程开发、细胞分化、衰老,nonapoptotic程序性细胞死亡(7- - - - - -9]。还参与细胞死亡的凋亡体的间隙,防止组织炎症进一步提供可能的影响自噬在肠道炎症性疾病的发病机理10]。炎症性肠病和自噬失调之间的关系得到了自噬在免疫中的作用,因为自噬参与细胞内病原体的消化和参与抗原表示(11]。自噬的重要性,强调了自噬基因敲除小鼠的一代。小鼠的一般删除自噬蛋白质Atg5 Atg7或Atg16L1死后几个小时内出生的新生儿饥饿时期(12- - - - - -14]。Atg7酶发挥着核心作用在自噬囊泡膜的伸长。最近的数据表明,肝脏特异性Atg7不足引起肝肿大由于异常积累细胞器和细胞肿胀(12]在Atg7删除浦肯野细胞导致轴突退化终端之后,鼠标行为赤字(15]。此外,在Atg16L1蛋白缺陷小鼠血液系统非常容易,葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎,再次表明自噬的至关重要的作用在炎症性肠病的发病机制14]。

由于自噬在许多细胞过程的重要作用,炎症性肠病之间的关系和自噬,肠道上皮细胞的关键参与(IEC)层在炎症性肠病的发病机制及其特殊的位置之间的接口内部和外部压力时,在肠道上皮细胞自噬的作用研究。这里,我们通过分析IEC-specific条件基因敲除小鼠,Atg7缺乏改变Paneth细胞的颗粒形态,但对肠道内稳态Atg7通常是可有可无的。

2。材料和方法

2.1。老鼠

老鼠携带loxP-flanked Atg7等位基因(Atg7^fl)请提供的小松,田中12]。C57BL / 6小鼠携带Cre重组酶的序列控制的villin启动子(Villin-Cre老鼠)前面描述(16]。Atg7^fl与Villin-Cre老鼠老鼠杂交,产生肠epithelial-specific Atg7基因敲除小鼠(Atg7^IEC-KO)。单独通风老鼠被关在笼子里。

2.2。实验模型的肠道炎症

老鼠实验结肠炎引起的挑战与葡聚糖硫酸钠(DSS,议员生物医学)。3% DSS是溶解在无菌饮用水和解决方案被不断应用于小鼠的饮用水。DSS的解决方案是每隔一天交换。结肠炎的发展被称量小鼠监控和常规结肠镜检查如前所述17]。炎症的程度被列为先前执行的(17,18]。

2.3。组织学检查

新孤立的组织都是瞬间冻结在液态氮或在4%福尔马林固定石蜡包埋。石蜡包埋组织的部分沾H & E或阿尔新蓝染色方法相结合,,弹力,van Gieson可视化组织结构。免疫组织化学分析cryosections执行使用Anti-CD11c抗体(BD Pharmingen) Anti-lysozyme抗体(Dianova),和Anti-myeloperoxidase抗体(Abcam)作为主要抗体,生物素化的二次抗体(Dianova)和TSA Cy3系统(PerkinElmer)推荐的制造商。凋亡细胞被发现使用原位细胞死亡检测装备荧光素(罗氏)TdT-mediated dUTP尼克结束标签(TUNEL)根据生产建议。细菌荧光原位杂交(FISH)检测到的细菌RNA(如前所述)(19]。核与赫斯特3342年复染色(表达载体)。使用荧光显微镜Immunofluorescent组织切片进行分析(奥林巴斯)。分析组织的电镜、组织固定使用戊二醛和进一步嵌入在环氧树脂环氧树脂。使用电子显微镜超薄部分进行分析(蔡司)。

2.4。IEC隔离和免疫印迹

肠上皮细胞被小心地把整个小肠从孤立的鼠标语料库,小肠的反演,洗涤的磷酸盐清洁肠道粪便,和孵化prewarmed组织隔离解决方案包含哈佛商学院(PAA), 1毫米EGTA(σ),2毫米EDTA(σ),和10% FCS (PAA) 15分钟37°C。随后,孤立的细胞颗粒状在1200 rpm和4°C 5分钟和1 x PBS和重复离心洗两次。蛋白质提取使用哺乳动物蛋白质提取试剂(热科学)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂平板电脑(完成迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑和PhosStop磷酸酶抑制剂平板电脑,罗氏公司)。根据其分子量蛋白质分离的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和随后转移到Protran硝基转移膜(Whatmann)。膜被封锁在Roti-Block(罗斯)和探测Anti-Atg7-CT抗体(AnaSpec)或Anti-LC3B-antibody(细胞信号)一夜之间在4°C温柔颤抖之后,孵化与二级HRP-linked Anti-Rabbit抗体(细胞信号)。孵化膜与HRP-linked Anti-Actin抗体(圣克鲁斯生物技术)1小时在室温下担任内部控制。检测蛋白质的乐队,西方闪电Plus-ECL (PerkinElmer)根据生产使用的建议。

2.5。转录分析

总RNA提取组织RNA隔离工具使用一个(自旋核RNA II, Macherey Nagel)和互补脱氧核糖核酸是由使用iScript cDNA逆转录合成装备(Bio-Rad)。互补脱氧核糖核酸样本混合SsoFast EvaGreen (Bio-Rad)和特定QuantiTect底漆化验和分析实时PCR(试剂盒)。产生Hprt作为内部控制。

2.6。统计分析

使用学生的统计分析t以及。双星号显示显著差异()。n。=无意义的差异()。

3所示。结果与讨论

探讨自噬的作用在肠道上皮细胞层,我们杂交Villin-Cre老鼠老鼠携带loxP-flanked Atg7生成条件基因敲除小鼠(Atg7等位基因^IEC-KO老鼠)。Atg7^IEC-KO老鼠的IEC-specific删除自噬蛋白Atg7(图1(一)),这是必不可少的自噬囊泡的伸长。在自噬过程中,胞质LC3-I转换成lipidated LC3-II ubiquitin-like接合系统涉及Atg7。LC3-II广泛接受作为激活自噬的标志(20.,21]。在控制肠道上皮细胞,LC3-I和LC3-II被免疫印迹检测。相比之下,只有观察LC3-I形式增加水平Atg7-deficient iec指示自噬在这些细胞(图受损1 (b))。IEC特定Atg7条件基因敲除小鼠出生健康和肥沃的和没有透露一个控制的同胞相比明显的表型。检查Atg7缺陷的影响在肠道内稳态iec,条件基因敲除小鼠的结肠和控制老鼠被结肠镜检查分析。尽管自噬的作用在人类炎症性肠病的发病机制,未发现宏观差异表明Atg7缺乏与自然无关肠道炎症(图1 (c))。此外,使用亚甲蓝chromocolonoscopy显示正常结肠内隐窝形态(图1 (c))。H & E染色的结肠横截面Atg7进一步证实缺乏结构性的改变^IEC-KO老鼠(图1 (d));强调了这一发现的形态学分析,证明可比结肠和回肠的一般结构的长度和宽度等绒毛和隐窝(图1 (e))。

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图1

^{IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO} 在控制地位和Atg7肠道特征老鼠。(一)免疫印迹蛋白质来源于控制地位和Atg7老鼠证明缺乏Atg7孤立的肠上皮细胞从Atg7结肠和回肠老鼠。其他组织的Atg7老鼠显示正常Atg7表达式(肺作为一个例子所示)。肌动蛋白作为内部控制。(b)免疫印迹蛋白质的提取分离iec不受挑战的控制和Atg7老鼠证明自噬不足Atg7-deficient iec(缺乏LC3-II形式)。肌动蛋白作为内部控制。(c)代表结肠镜检查的照片视频分析使用常规结肠镜检查(左)和chromocolonoscopy与亚甲蓝(右)可视化地下室结构。石蜡包埋的照片(d)代表回肠和结肠横截面沾H & e (e)的统计分析回肠末端绒毛和隐窝。数据显示的平均值+ SEM(长度和宽度控制绒毛,Atg7绒毛,控制隐窝,Atg7隐窝)。

最近的研究表明改变Paneth autophagy-deficient老鼠的细胞(22]。有趣的是,Paneth Atg7的细胞^IEC-KO老鼠研究在当前的研究中表现出不同的形态Paneth细胞控制的老鼠相比,结合染色与阿尔新蓝远端小肠石蜡切片,私人助理,弹力,van Gieson和电子显微镜(图2(一个))。因此,形态改变Atg7-deficient Paneth细胞被更多的外观显示但较小的囊泡相比Paneth细胞控制老鼠(图2(一个),黑色箭头),这表明Atg7不足导致不规则颗粒的形成。Paneth细胞储存囊泡含有颗粒,例如,CD95配体,TNF -α、抗菌物质,如溶菌酶分泌磷脂酶A2, RegIIIγ,IgA [23]。重要的是,Paneth颗粒细胞分泌到肠道内腔和参与先天免疫防御。有趣的是,免疫荧光染色显示减少的溶菌酶,Paneth细胞的标记,在小肠不受挑战的Atg7^IEC-KO老鼠相比,控制(图2 (b))。仔细统计分析细胞的数量在隐窝的底部包含颗粒或溶菌酶表明尽管溶菌酶阳性细胞数量减少,细胞含有颗粒的数量是Atg7之间的可比性^IEC-KO老鼠和控制老鼠,这表明Atg7不足影响存储和溶菌酶的分泌,而不是开发或Paneth细胞(图的生存2 (c))。这是进一步强调定量分析转录水平的抗菌肽(安培)由Paneth细胞分泌展示可比RegIII的转录水平γ,RegIIIβ在远端小肠,Pla2g2a Pla2g5不受挑战的控制和Atg7^IEC-KO老鼠(图2 (e))。此外,虽然减少了溶菌酶水平在回肠横截面可检测的免疫荧光分析、溶菌酶基因转录的远端小肠Atg7^IEC-KO小鼠没有明显不同于控制老鼠。我们的数据与数据协议Cadwell et al .,证明改变颗粒形态Atg16L1和Atg7-deficient Paneth细胞(24]。然而,尽管Cadwell等人说,大量的减少了颗粒和分散在Paneth溶菌酶染色细胞的老鼠,相比之下,我们观察到增加Paneth细胞颗粒的数量和更小的尺寸和减少溶菌酶染色。干扰由Paneth细胞溶菌酶分泌建议减少抗菌防御和改变Atg7的微生物菌群在肠道^IEC-KO老鼠。但是,没有改变的细菌或细菌的附着到肠上皮细胞层被发现(图2 (d))。进一步的研究调查是否应该减少AMP溶菌酶的分泌不足Atg7 Paneth细胞影响细菌微生物区系的组成。在最近的一项研究中,Cadwell等人发现没有Atg16L1-hypomorphic小鼠口腔感染的易感性增加单核细胞增多性李斯特氏菌。同意这一发现,我们发现间隙口头申请枸橼酸杆菌属rodentium——常用鼠标革兰氏阴性病菌模仿人类传染性colitis-was也不受IEC Atg7不足(数据没有显示)。总的来说,这意味着Atg7缺陷和减少Paneth细胞溶菌酶不影响细菌的附件iec和易感性与革兰氏阴性细菌感染。

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图2

^{IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO} 控制和Atg7 Paneth细胞功能在未受到挑战老鼠。(a)的组织学分析Paneth细胞通过与阿尔新蓝三色染色,不,弹力van Gieson(上)和电子显微镜(EM、底部2156 x放大)演示了规模较小的颗粒(黑色箭头)Atg7-deficient Paneth细胞相比,控制Paneth细胞。大自噬体(白色箭头)在电子显微镜检测iec的照片来自控制老鼠但不是iec来自Atg7老鼠。(b)的远端小肠Immunofluorescent染色溶菌酶(红色)揭示Atg7缺乏Paneth细胞的溶菌酶水平降低。细胞核蓝色所示。(c)统计分析含颗粒的细胞的数量(颗粒+)或溶菌酶(溶菌酶+)远端小肠隐窝的底部不受挑战的控制和Atg7老鼠(控制隐窝和Atg7隐窝分析颗粒+细胞,控制隐窝和Atg7隐窝分析溶菌酶+细胞)。(d)检测细菌(红色)的远端小肠不受挑战的控制和Atg7老鼠的荧光原位杂交(FISH)。细胞核蓝色所示。(e)定量分析抗菌肽基因的转录的远端小肠不受挑战的控制和Atg7老鼠。数据显示平均值+扫描电镜(控制老鼠,Atg7老鼠)。

由于以前的研究已经证明自噬调节异常之间的关系和炎症性肠病的发病机制4- - - - - -6)也发现Paneth细胞分泌降低安培在克罗恩病病人的肠道25,26),我们推断IEC-specific Atg7-deficient老鼠实验可以更容易诱导肠道炎症。为了调查是否缺乏Atg7 iec可能调节肠道疾病条件下体内平衡,结肠炎症诱导用葡聚糖硫酸钠,是常用的实验小鼠结肠炎模型。Atg7^IEC-KO和控制老鼠不断接受3% DSS的饮用水。演示了通过监测小鼠体重变化作为指标一般老鼠健康和生存分析,所有老鼠的反应与DSS治疗(数字3(一个)和3 (b))。结肠炎的发展之后使用结肠镜检查视频分析和炎症评分。Atg7缺陷并不影响的严重性DSS-induced结肠炎证明了类似炎症的迹象如粒度的粘膜,纤维蛋白的形成,血管结构,凳子上放松,肠壁增厚(数字3 (c)和3 (d))。结肠炎症的程度DSS-treated Atg7^IEC-KO老鼠被TUNEL进一步分析,H & E染色证明相似的免疫细胞组织破坏和渗透在老鼠(图3 (e))。我们也发现类似的渗透等免疫细胞的树突细胞和粒细胞的结肠固有层DSS-treated Atg7^IEC-KO老鼠和控制同窝出生的免疫荧光染色(图3 (f))。这些数据表明,在肠道上皮细胞Atg7不是必要的管理DSS-induced结肠炎。

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图3

^{IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO IEC-KO} 实验诱导控制和Atg7结肠炎老鼠。控制和Atg7老鼠不断挑战3% DSS的饮用水。说明数据代表(独立实验)。(a)平均体重动力学计算相对于第0天从老鼠身上的重量。数据显示平均值±SEM (控制老鼠,Atg7老鼠)。(b)生存分析。(c)结肠镜检查控制和Atg7的照片老鼠开始DSS治疗后14天。(d)程度的评分结肠炎。数据显示平均值+扫描电镜(在每组小鼠)。(e)的组织学分析从控制和Atg7远端结肠的一部分老鼠,对待DSS 14天,H & E染色(上层行)和TUNEL(底下一行)。(f)的渗透CD11c +细胞(红、上层行)和MPO +细胞(红色,底下一行)的结肠DSS-treated控制和Atg7老鼠被免疫组织化学检测分析。细胞核蓝色所示。

4所示。结论

总之,我们已经分析了肠道epithelial-specific Atg7-deficient老鼠和挑战的小鼠模型实验诱导结肠炎。我们的数据表明,自噬蛋白不足Atg7选择性影响Paneth细胞颗粒形成而没有其他肠道上皮细胞谱系似乎受到影响。这发现是奇怪的,因为许多其他autophagy-related条件基因敲除小鼠显示了严重的表型和体内平衡的器官受损。例如,亏损Atg7肝脏导致细胞肿胀由于异常积累在肝细胞中细胞器和突变小鼠发达肝肿大(12]。Neural-cell-specific Atg7基因敲除小鼠也开发了一种严重的表型有浦肯野细胞数量减少导致行为赤字(15,27]。尽管Atg7删除了iec导致自噬缺陷,我们观察细胞肿胀和增加细胞死亡表明自噬是可有可无的体内平衡的健康个体的肠道上皮细胞。我们建议不影响其他细胞比Paneth细胞Atg7不足,因为这些细胞谱系(肠上皮细胞、杯状细胞和enteroendocrine细胞)的寿命较短(4 - 5天)28]。在这些细胞中,自噬作为细胞内可能不是必要的间隙机制受损的细胞器和蛋白质可能不会积累有毒浓度,这些细胞的短生命周期。缺Paneth细胞Atg7的易感性可能根据他们的长寿命和丰富的内质网(ER)。自噬缺陷可能导致ER周转率受损导致内质网压力增加。例如,老鼠缺乏Xbp1, ER扩张所需的转录因子,减少了数量的lysozyme-positive Paneth细胞和剩余Paneth细胞包含压缩ER展示ER内稳态的关键作用Paneth细胞生物学(29日]。此外,膜的来源是来自于内质网许多细胞内的膜机构建议增加ER应激引起的自噬缺陷导致受损Atg7 Paneth细胞颗粒的形成^IEC-KO老鼠。

有趣的是,我们不能检测Atg7炎性改变未受到挑战^IEC-KO老鼠表明Atg7缺乏肠道上皮细胞并不足以诱导克罗恩病表型。这是非常奇怪的,因为在自噬基因多态性与风险增加有关开发炎症性肠病。此外,其他研究已经表明,快速清除凋亡的身体是至关重要的,以防止组织炎症(30.),Atg5一般基因敲除小鼠显示出减少细胞凋亡和增加组织炎症10]。然而,缺乏组织炎症Atg7在未受到挑战^IEC-KO老鼠可能是合理的次要角色的自噬在短时间内组织生活等肠道上皮细胞层和脱落的死iec进入肠道流明无法引起炎症。Atg7-mediated自噬的功能作用在炎症性肠病的发病机制是进一步分析实验结肠炎模型。尽管Atg7^IEC-KO老鼠显示Paneth细胞颗粒异常所观察到的类似在克罗恩病的病人22),Atg7^IEC-KO老鼠并没有显示出对DSS-induced或易感性增加枸橼酸杆菌属rodentium诱导结肠炎。然而,其他环境诱因等肠道感染鼠伤寒沙门氏菌——细胞内病原体要求为其clearance-might自噬是一个更有前途的实验模型和Atg7应分析其相关性^IEC-KO老鼠。与我们的数据相比,Cadwell等人显示的易感性增加hypomorphic Atg16L1老鼠DSS-induced结肠炎。然而,这种影响是依赖于感染某些病毒株(31日]。此外,hypomorphic Atg16L1老鼠有一个有缺陷的自噬在所有的细胞类型,因此,这些结果并不与我们的研究。因此,我们的数据表明,缺Atg7仅在肠道上皮细胞不会导致改变反应DSS治疗表明自噬在肠道免疫细胞失调可能扮演更重要的角色为炎症性肠病的发病机制。

总之,这些数据表明Atg7 iec不足影响Paneth细胞生物学和表明Atg7肠道内稳态的肠上皮细胞是可有可无的。进一步的研究调查为什么干细胞,虽然他们早已生活,似乎不受Atg7不足,如果其他环境触发Atg7呈现^IEC-KO实验小鼠更容易引起结肠炎。

确认

这项工作一直支持的德意志Forschungsgemeinschaft (BE3686/2-1),跨学科的临床研究中心(IZKF)和欧盟资助项目BTCure埃尔兰根大学(115142)。阿列克谢•尼克拉艾的优秀的技术援助和莫妮卡Klewer。

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