文摘

乳铁蛋白(LF)是一种具有生物活性的多功能蛋白质,发现母乳中含量最高的。几种方法可以用来量化低频。然而,量化的本地低频迄今为止已经拥有了相对较少的利益。本研究旨在开发一种新型高效的两步方法量化本地母乳中低频。在分析过程中,如果是第一次提取磷酸盐缓冲剂(pH值5.0),使用肝素亲和柱纯化。随后,如果检测到使用ultraperformance液相色谱(UPLC)波长201纳米。一个线性校准曲线得到的5 - 200 mg / L。定量的检测极限,并限制1 mg / L和5 mg / L,分别指示验证方法可以用来量化母乳中低频。与之前的高效液相色谱方法相比,这种方法演示了一些显著的优势,包括操作简单、低成本的检测,精度高。因此,结果证明有效的方法,可以使用商业净化和分析低频母乳样本。

1。介绍

乳铁蛋白(LF)是一个多功能的球状糖蛋白特征,可以作为转铁蛋白家族的一员(1,2]。这是一个铁扎蛋白质组成的单链多肽和两个球状叶(3]。多肽链由大约600 - 700氨基酸残基,分子量80 kDa [4]。低频展览各种功能性质由于其独特的结构特点。的抗菌活性是低频(最重要的功能之一5]。低频也介导其他生物的活动,比如铁运输、调节免疫系统、转录、蛋白水解作用,和酶活性以及抗肿瘤和抗炎作用6]。最富有的低频是乳腺癌和牛牛奶的来源。然而,许多差异已观察到如果出现在人类和牛牛奶。低频的浓度在牛奶泌乳期和物种的不同而存在明显的变化(7,8]。如果浓度牛牛奶(约0.8 - -1.0 g / L在初乳和0.03 - -0.49 g / L在成熟的牛奶)(9)低于母乳和初乳(约5.0 - -7.0 g / L在初乳和1.0 - -3.0 g / L在成熟的牛奶)(10]。从结构上看,如果人类和牛来源展品大约70%的序列同源性。此外,如果在人类和牛牛奶691和696个氨基酸组成,分别为(11]。由于牛低频之间的差异和人类的低频,准确、快速测定母乳中低频的营养研究具有重要意义和商业婴儿配方的设计。

常见的量化方法可分为免疫和nonimmunological方法(12]。免疫学方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和表面等离子体resonance-based免疫传感器(13]。尽管免疫方法表现出高选择性和敏感性,他们重现性差14]。Nonimmunological技术,如ultraperformance液体chromatography-tandem质谱(UPLC-MS),反相高效液相色谱法(rp)和毛细管电泳(CE)也被报道6]。UPLC-MS使高度敏感和选择性检测低频使用多反应监测模式基于签名肽(12]。产物可用于本地低频的决心。然而,一个敏感的检测只能观察到当评估乳制品与低频含量高(15,16]。CE广泛用于蛋白质分析;然而,它受限于毛细管,电压,和其他条件。因此,它可能不够敏感的分离蛋白与小分子量的差异(17]。完整的低频仍然区别其变性形式使用色谱技术分析时,这可能会导致低频的高估。

肝素、硫酸多糖属于粘多糖的家庭,是用来丰富本地低频(18]。肝素具有已知的生物大分子中负电荷密度最高(19]。因此,肝素展品高亲和力不同的蛋白质,包括低频但不包括ß乳球蛋白,α乳白蛋白、血清白蛋白(16]。肝素亲和柱的净化已广泛应用低频由于其特殊的性质。在这项研究中由Lutaty et al。20.),母乳样本加载到肝素亲和柱和清洗和筛选了不同盐浓度。随后,蛋白质被收集,从而提高LF-enriched分数的纯洁性。同样,如果从转基因牛奶和纯化牛牛奶滞留物使用亲和色谱法作为描述帕洛阿尔托研究中心等。21]。

,研究的目的是开发一个有效的方法使用肝素亲和柱纯化加上UPLC检测本地低频母乳的决心。建立了肝素亲和柱纯化的低频通过优化提取条件和洗脱条件。

2。材料和方法

2.1。试剂和仪器

肝素亲和柱从Meizheng购买生物科技有限公司有限公司(中国,北京)。二水磷酸氢二钠氯化亚锡、磷酸二氢钠、氯化钠、三氟乙酸买来大茂化学试剂厂(天津)。乙腈和甲醇从默克公司购买(达姆施塔特,德国)。人类低频(≥85%)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。去离子水是纯化使用Milli-Q净水系统(微孔、马、美国)。高效液相色谱级试剂被用于这项研究。

2.2。样品收集

健康的母亲年龄从20到35年参加了这项研究。女性身体或精神疾病和营养或药物干预下被排除在本研究之外。每个参与者提交的书面知情同意包含之前的研究。共有三个初乳,两个过渡牛奶,和12个成熟的牛奶样品之间使用手动抽吸泵从第一天上午9点至11点后330天交货。集合后,样本冷冻和储存在−80°C,直到进一步的分析。

2.3。使用肝素亲和柱动态吸附分析

肝素亲和柱的工作原理如图1(一)。连续流吸附进行了研究使用一个吸附柱的内径1.5厘米,高12厘米。在进样前,列与缓冲区刷新。在注射过程中,样本添加到顶级,流经列由于重力的影响。废水样品收集在指定的时间使用UPLC和分析。

列的动态行为是使用物流预测模型。单组分系统的线性化模型表示使用以下方程:y=一个₂+ (一个₁−一个₂)/ (1x/x₀)^p)。

2.4。样本提取

总共1毫升母乳在10000 rpm离心机在4°C(8分钟6]。离心后,上清液被转移到一个新的离心管。缓冲溶液(99.38更易与L Na₂HPO₄h·12₂O和0.61更易/ L不₂阿宝₄h·2₂O, pH值5.0)补充说,其次是混合的示例使用一个旋涡混合器为2分钟。样本提取被加载到列作为加载解决方案。

2.5。样本清理

总共5毫升的缓冲溶液添加到肝素亲和柱。样本提取增加了治疗后的缓冲区。示例解决方案筛选了完全后,列是冲洗10毫升的缓冲溶液B(99.38更易与L Na₂HPO₄h·12₂0.61 O,更易与L不₂阿宝₄h·2₂啊,和100更易与L氯化钠)。所有的废水都丢弃。最后,列筛选了4毫升的洗脱液(99.38更易与L Na₂HPO₄h·12₂0.61 O,更易与L不₂阿宝₄h·2₂啊,和1 mol / L氯化钠)22]。收集洗脱液,离心5分钟UPLC分析之前的9000 rpm。

2.6。信用证条件

的ACQUITY UPLC h级+核心系统(美国水域,MA)包括一个四元溶剂经理(泵),样品manager-flow通过针(SM-FTN),列加热器,检测器(PDA探测器),ACQUITY UPLC BEH300 C4列(2.1毫米×100毫米,1.7μ米)。UPLC系统控制的水域^®授权^TM色谱法的软件。列温度维持在60°C。紫外检测波长和注入量维持在201 nm和10μ分别L。三氟化线在移动阶段涉及0.1%乙酸在水混合,而直线B涉及0.09%三氟乙酸在乙腈溶液混合。梯度设置如表所示1。

2.7。统计分析

所有的实验进行了一式三份,结果表示为平均值±标准偏差。起源9.0(美国OriginLab公司)是用于获得科学图表,和SPSS统计22.0被用于确定样本之间的显著差异< 0.05。

3所示。结果

3.1。突破曲线的肝素亲和柱

图1 (b)显示了在连续突破曲线确定使用肝素亲和柱吸附实验进行。突破曲线显示异常良好,这表明,如果最后达到吸附平衡,有效吸附在吸附柱。

3.2。色谱条件的优化

波长的选择可以提高人类低频(HLF)的检测灵敏度最大化和最小化干扰。如数据所示2(一个)和2 (b),发现HLF波长范围从200.5到201.7纳米。根据峰值响应率,201海里被选为检测波长。

一些研究表明高紫外线反应HLF在280纳米23,24]。因此,决心通过比较紫外吸光度测量波长201 nm和280 nm)。紫外吸光度测量在201和280海里监控测定的蛋白质洗脱图。如图2 (c)和补充表1,之间的关系相对蛋白质含量在母乳和信号观察到280海里是线性的。然而,许多山峰对应杂质样品洗脱液中观察。检测期间HLF在201 nm,响应灵敏度显著提高是由于更好的解决HLF峰基线。因此,本文选取201海里的检测波长。

色谱柱的选择可以影响的分离HLF从样本组件(25]。在这里,一个C4 HLF检测列被选中。

3.3。样品预处理过程的优化

3.3.1。样品缓冲溶液的比例的影响

一个合适的萃取率有利于提取HLF [26]。考虑提取效率,四个稀释1:20日1:50岁,1:100年,和1:200年被用于分析,而其他变量设置如下:缓冲溶液的pH值维持在7.5。磷酸盐缓冲溶液的浓度是100更易与L。氯化钠浓度在缓冲溶液B是100更易/ L。洗脱液中氯化钠浓度为1.0 mol / L。样品稀释HLF的测量的影响进行了分析。稀释可以观察到在图的影响3 (c)。在稀释的萃取率观察1:100年,价值大约是88%。

3.3.2。磷酸盐缓冲溶液的浓度的影响

示例中的靶蛋白提取使用缓冲溶液a保持蛋白质的活动在整个过程中是至关重要的。研究缓冲溶液对HLF活动的影响和提取效率,不同浓度的磷酸(50,100年和200年更易/ L)在测量中进行了测试。结果表明,最优磷酸盐浓度是100更易/ L。明显降低在低频反应观察磷酸浓度高于最优浓度(图3 (b))。这可能归因于这样一个事实:如果绑定的肝素参与一个静电相互作用,这可能是中断与离子强度的增加16]。

3.3.3。在缓冲溶液pH值的影响

缓冲溶液的pH值有重要影响的结构和稳定的低频(27]。在这项研究中,水相pH值3.0和9.0之间变化研究pH值对HLF提取的影响。提取效率很低,基本的pH值,但它被发现在酸性pH值增加(数据3 (c)和3 (f))。因此,pH值5.0选择进一步优化纯化条件。低频的热稳定性是严重影响,稠化加热后在中性和碱性pH值在80 - 100°C 5分钟(28]。在酸性条件下,低频时相对稳定的加热大约在pH值3.0 - -4.0 (28]。这意味着如果展品在酸性条件下更好的热稳定性。

3.3.4。B在缓冲溶液氯化钠浓度的影响

缓冲溶液B的目的是洗出的杂质没有特别绑定到肝素亲和柱。在这项研究中,不同浓度的氯化钠(0、50、100、200和300更易/ L)被选为测试。结果表明,低频的反应是增强在氯化钠浓度增加的范围0 - 100更易/ L(图3 (d))。这可能归因于这样一个事实:缓冲B冲走是非绑定不同的杂质,从而净化和浓缩目标蛋白质。然而,高盐浓度要求洗提低频也会导致绑定目标蛋白的释放。

3.3.5。氯化钠浓度洗脱的影响的解决方案

氯化钠浓度洗脱溶液是一个重要的参数,可以从肝素影响低频的解吸。因此,四个生理盐水浓度为0.5 mol / L, 1.0 mol / L, 1.5 mol / L和2.0 mol / L被用来洗提样例。没有观察到低生理盐洗脱峰浓度,表明潜在的吸附蛋白质的列矩阵(数据未显示)。高低频的洗脱效率观察高盐浓度以恒定洗脱体积(图3 (e)),100毫米氯化钠被选为随后的痛苦。

3.4。方法验证

线性。人类低频线性检查使用标准样品在6个不同浓度(5 - 200 mg / L)。线性回归方程确定如下:y= 16881x+ 161391相关系数(R²(补充图0.9977)1)。检测极限(LOD)和定量限度(定量限)。LOD和定量限1 mg / L和5 mg / L,它计算的最低浓度,表明信噪比率3和10个,分别。精度。中间精密确定,它被定义为测试结果之间的协议使用相同的方法执行相同的测试材料在同一实验室由同一运营商使用相同的设备在数天(17]。它是用百分比相对标准偏差表示。的盘中和interday精度评估方法,母乳的稀释了上述最优试验条件下预处理每天连续四天。结果总结在表2。精度。方法的准确性评估使用标准的验证方法除了复苏。平均回收率为103.54%(表3),这表明,测量值与真实值达成一致。

3.5。牛奶样品分析

所有收集的母乳样本分为两组基于哺乳间隔和分析UPLC使用当前的优化方法。的浓度HLF观察整个泌乳期如图4。结果表明,哺乳时间显著影响HLF浓度,和哺乳期间观察到浓度≤15天显著高于观察哺乳时间> 15天(< 0.05)。

4所示。讨论

heparin-binding亲和力的效率与净化演示通过测量标准的恢复低频加载在列。经济复苏的决心是近100%,证实了该方法的有效性。这些结果表明,列是适合HLF的隔离和净化。

在目前的研究中,我们展示了一个优化的方法对低频净化使用肝素亲和柱在特定条件下,保留低频稳定性。净化过程的细节如下:如果有效地从样本中提取了100 L更易与磷酸盐缓冲剂pH值5.0,保留肝素亲和柱,筛选了使用磷酸缓冲1.0 mol / L氯化钠。色谱柱的选择也至关重要的分离HLF其他组件的示例。C4和C18硅胶列可以用于单独的低频在色谱柱的选择。20多注射,C18柱通常展品过度基线噪声和峰值和重现性差的保留时间17]。C4列展示了良好的峰形、高恢复,和低水平的蛋白质吸附,这适用于蛋白质分析(25]。因此,广泛使用的C4列选择更高的稳定性和分离效率。

值得注意的是,热变性的低频影响低频的亲和力和肝素(17]。我们的方法估计本地低频母乳的浓度。热变性低频可能已经筛选了样本矩阵。

亲和色谱法是主要的单元操作期间执行大规模生物工艺和净化治疗蛋白质。亲和色谱法已广泛用于本机低频由于其高的净化与靶蛋白结合特异性。ELISA可以用来检测蛋白质的原生形式在沙克和subpicogram浓度与灵敏度。的浓度HLF本研究中观察到的类似于Paulaviciene发现et al。29日),报告2.5±1.07毫克/毫升在14 - 16天。尽管ELISA具有较高的敏感性和多功能性,其重现性相对较差。因此,很少有研究调查了低频用这种方法的检测。这种方法不仅检测活性低频归因于肝素的底物特异性,但还演示了比ELISA更好的再现性。

5。结论

在这里,我们描述了一个简单的和快速的策略使用肝素亲和柱纯化的复杂样品含有低频低频分析之前。最佳净化,几个因素可能影响绑定效率了。验证该方法的准确性、精密,LOD、定量限、线性。结果显示该方法的潜在的商业应用进行低频分析。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

第一和第二作者的贡献同样这个手稿。

确认

作者感谢张静,沈,和其他人从君乐宝乳业有限公司为他们的帮助色谱仪的操作。液体谱分析是由质量管理中心,君乐宝乳业有限公司。这项工作是国家重点支持的研究和发展项目中国没有。河北2018 yfd0501606)和科技项目,中国(号。21327110 d、19222812 d和20327101 d)。

补充材料

补充表1:HLF标准曲线的线性关系在不同检测波长。人乳铁蛋白(补充图1:标准曲线R²= 0.9977;y= 16881x+ 161391)。(补充材料)