文摘
液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)是最常用的方法为磺酰胺的决心。然而,它的准确性会受到许多因素的影响。在这项研究中,磺胺嘧啶(SDZ),磺胺二甲嘧啶(SMZ),和sulfadimethoxine (SDM)牛奶中被选来调查一个精确的测定方法和潜在影响因素的使用ultrahigh-performance液体chromatography-tandem质谱(UHPLC-MS / MS)。由25毫升牛奶样本提取高氯酸溶液(pH = 2)和清理用HLB固相萃取(SPE)墨盒。GHP四种过滤器,包括聚四氟乙烯,尼龙、玻璃纤维、比较,聚四氟乙烯被选中,因为它有最好的恢复目标磺胺类药(SAs)。三种定量方法,包括外部标准(ES),矩阵匹配(毫米)和同位素稀释质谱法(一)比较,其中IDMS表现出最好的准确性。基质效应在不同流动相组成和不同的样本矩阵进行评估和讨论。离子抑制效果观察在SAs的决心,用甲醇合成的增加更强的百分比在移动阶段。IDMS校正后的基体效应可以忽略。矩阵已经复苏三个飙升的水平(1μ克/公斤,10μ克/公斤,20μ克/公斤)由IDMS范围从96.8%到103.8%。扩大相对不确定性在2.02%至5.75%的范围。表现出多种应用的方法,精度高,稳定性好,灵敏度高。
1。介绍
磺胺类药(SAs)是一种通用、高效、低毒、低成本的抗菌药物(1]。使用SAs抗菌增效剂可以扩大范围,增强抗菌的活性。因此,SAs广泛用于牛奶产量细菌性疾病的预防和治疗。然而,由于潜在的毒性,过量摄入SAs可能导致人类疾病,如泌尿系统损害、消化障碍,呕吐腹泻,溶血性贫血,耐药菌株,人体免疫力下降,肿瘤倾向(2,3]。
因此,许多国家和地区都有发行规定最大残留限量(推广)SAs在食品和饲料。规定在国际食品法典委员会(CAC)食品和饲料中SAs的总量不得超过100人μ克/公斤(4]。联合国粮食及农业组织(粮农组织)规定的残留限度SAs 100 ng / mL(在动物食物5]。根据欧盟(EU)规定,单一sa浓度牛奶和肉类不应超过25μ克/公斤,总额不应超过100人μ克/公斤(6];中国农业和农村事务部规定,SAs在牛奶的总浓度应低于100 ng / mL,磺胺甲嘧啶的推广是25μg / L (7]。
目前,SAs残留物的检测方法主要有微生物检测(8),荧光分光光度法(9),免疫测定(10)和高效液相色谱与质谱(HPLC-MS)。然而,灵敏度和选择性是有限的。液相色谱法耦合串联质谱(质/ MS) (11,12)是一种高度敏感的、具体的和可靠的工具,污染物检测食品和multianalyte分析已经成为最普遍的方法。应用在食品分析领域扩张,尤其是在multiresidue检测(13,14]。然而,复杂食品基质(如碳水化合物、蛋白质或脂肪)可以诱导离子抑制或增强的目标分析物,这可能会阻碍质谱定量的准确性(15- - - - - -18]。基体效应不能忽略(我)质/ MS分析,使得提取和清理过程具有挑战性的(19- - - - - -22]。策略也已经被开发出来,以减少或消除市场经济地位,比如改善色谱选择性避免coelution,流动相修饰符,稀释,和有效的清理23- - - - - -25]。尽管这些方法是自称是有效的选择模式分析物,进一步扩展(有固有的缺点26,27]。具有相同化学和色谱性质与目标化合物相比,同位素标记内部标准可以补偿矩阵的影响。因此,同位素稀释质谱法(一)方法展品精度高和可重复性的有机化合物的定量分析在复杂的矩阵,从而克服困难复苏的校正和注入体积的影响,流动相,在样本检测仪器波动(28- - - - - -34]。
该方法的准确性和可靠性在兽药的分析是至关重要的。在这项研究中,三种不同极性的SAs, SDZ (pKow = 0.34), SMZ (pKow =−0.76),和SDM (pKow =−1.17) (pKow从KowWin获得软件),被选中。实验条件优化和深入讨论。提取和清理方法进行了优化。四种过滤器进行了比较。三种定量方法、外部标准(ES),矩阵匹配(毫米)和同位素稀释质谱法(IDMS)进行了比较。基体效应进行评估,以及潜在的影响因素进行了讨论。此外,法估计的不确定性。发达的方法验证通过矩阵飙升准确度和精密度实验,内部/ interday变化,检测的局限性(LOD),量化的极限(定量限),线性和不确定性。
2。材料和方法
2.1。材料和试剂
认证的参考资料(crm)磺胺嘧啶(SDZ;GBW 081146 (E))、磺胺二甲嘧啶(SMZ;GBW 081145 (E))和sulfadimethoxine(长效磺胺;GBW 061416 (E))是经国家计量研究院,中国(中国,北京)。同位素标准(13C6磺胺嘧啶,13C6磺胺二甲嘧啶,13C6-sulfadimethoxine)购买的委员会(加拿大多伦多)。甲酸、甲醇和水(HPLC-MS年级)购买从热费希尔科学(美国沃尔瑟姆,MA)。高氯酸(分析纯)购自XiYa化学试剂公司(山西、中国)。绿洲®HLB SPE墨盒(6 cc, 150毫克)购买的水域(米尔福德,妈,美国)。
股票的解决方案是对个人磺胺类药在1000的浓度μ克/公斤甲醇和避光储存在4°C。线性研究样本刚做好的使用适当的稀释股票的解决方案与初始LC流动相(甲醇-水;15:85;v: v,含有0.2%甲酸)。标准解决方案三磺酰胺类混合物准备在0.1到50μ10克/公斤与同位素内部标准μ克/公斤。牛奶样品准备在3种不同浓度的1、10和20μ克/公斤。标准的解决方案都是保存在琥珀色玻璃瓶在4°C。
2.2。牛奶样品
脱脂和全脂牛奶样品的伊利(中国)、阿尔拉(德国)、和LVLINB(奥地利)从超市购买。牛奶的营养内容如表所示S1。
2.3。样品制备
以前均质牛奶样品(1.00克)重50毫升离心管。10 ng内部标准(100 ng / g工作的解决方案)是补充道。然后,25毫升高氯酸溶液(pH = 2)被添加到每个管,每个管的混合物是vortex-mixed 1分钟,然后由超声波提取10分钟。
HLB固相萃取盒(6 cc, 150毫克)的先决条件是5毫升甲醇和5毫升高氯酸溶液(pH = 2)顺序1毫升/分钟的流量。提取解决方案逐渐加载HLB墨盒。然后,离心管是用5毫升高氯酸溶液洗净,清洗解决方案也装入墨盒。当时墨盒5毫升水清洗和干燥在真空下1分钟,和SAs筛选了3毫升甲醇的流量1毫升/分钟。洗脱液蒸发下温柔的氮流在40°C到剩余的数量大约是200μl .残余液体是重组1毫升甲醇-水(15:85;v: v,含有0.2%甲酸),1分钟vortex-mixed,透过一个0.22μm聚四氟乙烯过滤器为质玻璃LC瓶/ MS分析。
2.4。UHPLC-MS / MS条件
UHPLC - / MS / MS系统,由一个LC30AD液相色谱(日本岛津制作所Corp .)和5500年QTRAP质谱(SCIEX Corp .)、钙、美国),用于SAs分析。的SAs实现分离Acquity UPLC CSH™C18柱(100×3.0毫米,1.7μ米粒子大小;水域,美国)。一个梯度LC洗脱法0.2%甲酸水溶液为流动相,乙腈(含0.2%甲酸)作为流动相B .梯度洗脱是如下:15% B维持3分钟;增加到35% B线性2分钟,然后增加到100% B在4分钟为1分钟和维护;改为15% B和维持2分钟。注射量是5μl .流量被设定为0.25毫升/分钟,和列温度是38°C。
QTRAP 5500质谱仪配有电喷雾电离(ESI)源进行积极的电离multiple-reaction监测(MRM)模式。离子源温度设定在600°C (TEM),和离子喷涂电压(是)被设定为5.5 kV。离子源气体1 (GS1)和离子源气体2 (GS2)用作干燥和喷雾器气体在60 psi和65 psi的背压,分别。窗帘气体(坏蛋)25 psi。N2用于所有的气体。等参数declustering潜在(DP)和碰撞能量(CE)分析物如表所示S2。
2.5。基体效应的评估
我因素进行调查,比较信号强度和质量上升matrix-matched标准溶液与标准溶液的浓度。如果获得的峰面积和质量标准设置为简洁的解决方案一个和米和相应的峰值区域标准上升后提取成牛奶提取物一个′和米′我因素可以计算如下(35]:
我因子< 1表示我和离子抑制效应系数> 1表示离子增强效果。
2.6。方法的验证
LOD和定量限被定义为3×信噪比(S / N)和10×S / N,分别。确定方法的线性、标准解决方案三磺酰胺类混合物准备浓度的0.1,0.5,1、10、20、50μ克/公斤与同位素内部标准10的浓度μ克/公斤。
评估经济复苏和精度,空白牛奶样本飙升三磺酰胺类混合标准溶液在3种不同浓度的1、10和20μ克/公斤。精度是评价盘中和interday通过测量相应的相对标准偏差(rsd)两个浓度上升(1μ克/公斤,20μ克/千克)在六个连续运行通过分析六个复制。盘中精度(所谓的可重复性)测量在一天之内,而interday精度评估在6个顺向天。
3所示。结果与讨论
3.1。优化UHPLC-MS / MS条件
Acquity UPLC CSH™C18柱(100×3.0毫米,1.7μ米)和XTerra C18女士(100×2.1毫米,3.5μ米列相同的实验条件下进行了比较。结果表明,所有化合物都可以分开在两个列,和目标化合物对XTerra C18柱女士保留时间短。所有的化合物有更高的信噪比值Acquity UPLC C18 CSH™列。最后,Acquity UPLC CSH™C18柱被选为实验。
甲醇和乙腈与不同浓度的甲酸(0.1%和0.2%)比较,分别。对甲醇和乙腈甲酸浓度(0.1%甲酸)的反应SDZ SDM高出约20%和5%,通过使用甲醇,而SMZ的反应是相同的。SMZ的反应是高出大约20%使用甲醇和甲酸0.2%,使用甲醇和甲酸0.1%。甲醇含0.2%甲酸被选为以下实验,像这种情况提供了最高的响应。3 SAs如图的色谱法S1。
参数的优化可以直接影响质谱分析的灵敏度和准确性。获得最大灵敏度的识别和检测三种磺胺类药,compound-dependent锥电压和碰撞能量等参数优化通过直接注入不同的标准解决方案在100年μ克/公斤,7的流量μL / min使用内置的注射泵直接连接到接口。前体离子和产品离子测定,最佳选择敏感性量化的过渡,而额外的过渡收购确认(表S2)。
3.2。预处理方法的优化
基于国家标准方法(GB / T 22966 - 2008),预处理方法的改进和优化。在实验中,发现滤膜有一定的影响分析物的回收率,因此过滤膜的选择主要是优化。这在以往的研究很少讨论。
四种过滤膜,包括聚四氟乙烯(0.45μ米,25毫米),GHP (0.2μ米、13毫米)、尼龙(0.2μ米,15毫米),玻璃纤维(1.0μ米,15毫米)过滤器,被选出的吸附行为的研究比较标准溶液的绝对的复苏。在图所示的复苏1。
目标化合物的吸附通过聚四氟乙烯过滤器很低,和恢复从98.4%到100.5%不等。很明显观察到SMZ的恢复通过GHP过滤器过滤后只有65.7%;SDZ的复苏和长效磺胺分别为94.9%和97.2%,分别。尼龙过滤器表面吸附了三个SAs,复苏从72.1%到89.6%不等,玻璃纤维过滤器的复苏在98.0%和99.2%之间。因此,本文选取聚四氟乙烯过滤器在这项研究中,因为它吸附最低为目标化合物。
3.3。定量方法的比较
定量方法的选择对结果的准确性有显著影响。这三个化合物的定量方法比较使用的脱脂牛奶,伊利在梯度洗脱条件下,如图2。复苏的外部标准方法从17.8%到61.2%不等,这都是最低的模式,目标化合物的区别很大。外部标准方法极大地影响矩阵,有严重影响结果的准确性和可靠性。空白样品矩阵应用于补偿矩阵的影响通过使用矩阵匹配方法。尽管复苏矩阵匹配方法的范围从80.9%到95.2%,比外部标准方法,个人目标化合物的复苏仍不满意。此外,我因素不同的牛奶样品可能有所不同,它非常耗时,很难获得相同的空白样本矩阵。IDMS方法的回收率从99.7%到100.7%不等。由于类似的物理和化学性质之间的同位素标记内部标准和目标化合物,他们的行为在预处理的过程和仪器分析基本上是一致的,这大大减少了矩阵的干扰效果。此外,定量分析了IDMS方法偏差最低和最稳定的三种方法之一。
IDMS方法的复苏是最好的两个权力平等主义的条件和梯度洗脱条件下(如图S2)。此外,IDMS的结果类似的三种洗脱条件下而毫米和ES的复苏不同,尤其是ES。结果表明,IDMS方法有较高的准确性和稳定性优于毫米和ES,导致了一个广泛的应用范围。这是一种最常用的方法来检测跟踪组件在复杂的矩阵。
六个不同的脱脂牛奶样品的定量方法和食用全脂牛奶从当地市场购买也比较。六个矩阵的复苏样本分析,毫米,分别和一。结果如表所示S3。外部标准和矩阵匹配方法被用来计算经济复苏,这是非常不稳定的,可以极大地影响矩阵。IDMS方法的回收率范围从96.6%到102.2%,可有效降低基体效应,表现出高稳定性和广泛的适用性。结果表明,IDMS方法可以提供一个稳定可靠的方法检测和分析SAs的牛奶。
3.4。基体效应的估计
尽管一些在提取干扰组件可以被消除,清理、色谱分离过程,分析错误和不准确的结果仍然存在由于干扰物质在复杂的矩阵。基体效应的后果的高估或低估的实际浓度分析物在样品,影响真实和精确的分析方法。基体效应的方法用来评估质/ MS分析包括postcolumn注入和postextraction之外(16- - - - - -18,36]。postextraction除了可以量化矩阵的方法效果,广泛用于验证过程。
首先,矩阵分析物的影响在不同的牛奶矩阵样本相比(表1)。结果表明,所有化合物显示在不同的牛奶样品离子抑制效应。的我因素SDZ、SMZ和长效磺胺在以下范围:从0.63到0.87;从0.64到0.73;分别从0.18到0.30。有个小差异skim-fat基体效应的不同品牌的牛奶或食用全脂牛奶。然而,我skim-fat要素牛奶样本低于全脂牛奶、skim-fat牛奶这表明离子抑制的影响更大。的原因还不清楚,可能与牛奶样品的成分含量。
我因素(伊利牛奶skim-fat)四个目标分析物的液相色谱洗脱条件进行了计算,分别。如图3的我因素三个化合物低于1在不同阶段的作品,这说明离子抑制效应在所有目标化合物的流动相条件。SDZ和SMZ的离子抑制作用比权力平等主义的低梯度条件下,和我在权力平等主义的因素50%甲醇是最低的条件。随着甲醇成分百分比的增加流动相,抑制作用更强,推断coeluting组件的矩阵(干扰物)在高甲醇成分可能得到更好的雾化效果和更高的电离效率。竞争离子的增强导致更强的离子对目标化合物的抑制作用。此外,可能会有更多coeluting矩阵与较高的甲醇成分。
修正后的同位素标记的内部标准,SDZ MEs, SMZ和长效磺胺在以下范围:从0.937到1.001;从0.973到0.999;分别从1.006到1.021,表明IDMS可以补偿矩阵的影响很大的内容。
3.5。不确定性评价
ID-UHPLC-MS / MS分析的不确定性是由个体的组合评估的不确定性包括SAs crm(纯度 ),平衡重( ;标准与标准的解决方案,包括重同位素标记标准和标准的解决方案,和牛奶样品),方法精度( ; )。
平衡重的不确定性称为权重crm的纯SAs和同位素标记SAs,溶剂,标准的解决方案,牛奶样品,同位素标记SAs解决方案。资产评估是均匀分布的不确定性。平衡权重的标准不确定度( )是重复性和权重的组合宽容。两次获得的样品重量是重操作,每个重量是一个独立的观察。
当不同的候选人是重分析( ),相对的不确定性是由公式(2)。平衡重的不确定性通过结合所有不确定性计算重使用公式(3):
的不确定性方法精度在0.25% - -2.46%的范围。合并后的相对标准不确定度( )计算公式(4)。扩大相对不确定性(U)的覆盖率2 (k=由公式(2)计算5):
个人的不确定性、相对不确定性和扩大相对不确定性三个表列出上升水平2。的相对不确定性三个SAs在1.01%到2.87%的范围;扩大相对不确定性在2.02%至5.75%的范围。
3.6。方法验证
表S4总结了校准方程,线性相关系数,LOD,定量限与发达UHPLC-MS / MS方法。所有研究SAs呈现良好的线性范围广泛的浓度从0.1μ50克/公斤μ克/公斤。相关系数(R2)均高于0.999,这表明一个好的线性度的方法。LOD和定量限约3×S / N和10×S / N,分别。LOD范围从0.018μ0.075 g / kgμ0.029 g / kg,范围从定量限μ0.166 g / kgμ克/公斤。低通过这种方法允许量化定量限浓度低于当前立法规定的推广。复苏上升的三个层次上评估(1μ克/公斤,10μ克/公斤,20μ克/公斤),如表所示3。六个复制三个浓度水平飙升样品的准备。对所有化合物,满意的复苏(96.8% - -103.8%)。在1盘中、interday精度进行评估μ和10克/公斤μ克/公斤飙升的水平。对于所有分析物,盘中精密的重复性标准偏差0.25 - -2.69%的范围内和interday精度小于1.40%,表明该方法是准确和精确。灵敏度和精度的三个SAs在这个方法好于农业部公告no.781 - 12 - 2006标准(37]。
4所示。结论
ID-UHPLC-MS / MS方法已经开发并验证了精确测定牛奶中磺胺类药。固相萃取和过滤后,样品被UHPLC-MS / MS分析系统。矩阵的影响进行评估和讨论。结果表明,基体效应有明显的区别与不同移动阶段和不同的牛奶矩阵。一是用于定量,因为它可以有效降低矩阵和其他因素的影响。优化的方法完全验证通过复苏的估计,线性,LOD /定量限,和内部/ interday再现性,表现出良好的灵敏度、准确度和精确度。不确定性估计表明,开发的方法适当的计量质量参考方法不仅每天的SAs的决心也赋值相关的有证。
数据可用性
数据的补充信息文件。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这项研究的出版物。
确认
这项研究得到了国家重点研究和发展项目的中国(2016 yff0201106)和基础研究基金中央公益性科研院所(21-AKYZZ2117)。
补充材料
表S1:营养丰富的牛奶(每100毫升)。表S2: multiple-reaction监测SAs的最优参数。表S3:复苏不同的量化模式包括外部标准,矩阵匹配,同位素稀释在六个牛奶样品(n= 3)。表S4:线性、LOD方法的定量限。图S1:三个SAs的色谱法。图S2:复苏不同定量分析模式的三个目标化合物在不同的洗脱条件。(补充材料)