文摘

由于植物的经济价值,烟草(烟草)是所有世界各地种植。检测转基因(GM)的烟草,缺乏统一的标准材料最终限制了检测方法,因为不能保证结果的准确性和可比性。在这里,我们准备了一个参考质粒“pGMT27”检测转基因烟草,18296个基点的长度窝藏的两个烟草内生和七个外源基因。通过使用定性PCR检测九个基因,10份用于质粒的敏感性。在定量实时PCR (qPCR)化验pGMT27校准器,反应效率P-35S和NR分别为101.427%和98.036%,而检测极限(LOD)和量化的限制(定量限)5和10份副本/反应。标准偏差(SD)和相对标准偏差(RSD)的Ct值,可重复性的值从0.04到0.42,从0.18%提高到1.29%,分别;和重现性值从0.04到0.39,从0.18%提高到1.14%,分别。对于未知样品测试,平均转换因子(Cf)是0.39,和准确性的偏见来自−15.55%到1.93%;精密,SD值的范围从0.02到0.62,相对标准偏差值从1.34%降至10.6%。我们的结论是,使用pGMT27质粒作为校准器为烤烟提供了高效的转基因检测方法。

1。介绍

烟草是最广泛种植的非粮食作物之一,已成为一个广泛的调查模型植物分子生物学研究的加速发展。归因于它的农业的重要性,在125多个国家种植烟草叶,主要是消耗香烟、雪茄、鼻烟。根据联合国粮农组织(粮农组织)的数据,大约有400万公顷的土地用于种植烟草,其中三分之一是仅在中国1]。吸烟是健康相关(2- - - - - -4),消费者似乎更谨慎的态度比其他作物和转基因烟草,烟草以及其他转基因作物。尽管烟草制品应用程序从生物技术有限,无意释放转基因烟草种子和叶子nonpermissible类市场是可能的(5]。现在,转基因成分检测烟草国际贸易壁垒正成为一个监控存在的外源转基因烟草。所以,当进入市场,它是必不可少的烟草公司加强控制烟草产品的进出口。在许多国家,尊重公众的知情权和教育,食品和饲料产品的转基因阈值水平已经建立(6- - - - - -8),因此,确保准确、可比测量,选择的标准物质对GMO检测变得非常关键9]。标准的参考资料包括矩阵和质粒。质粒有许多优点,如易于可用性、简单的操作、可重复生产,低成本(10]。有些质粒校准器已经使用了转基因大豆,玉米,棉花,和其他农作物,包括ERM-AD413 ERM-AD415 ERM-AD427, ERM-AD425。他们也用于校准转基因玉米MON810 NK603, 98140年,转基因大豆35604311]。

然而,标准物质的缺乏限制了转基因烟草检测方法。到目前为止,没有标准物质作为检测转基因烟草的校准器被发现,也没有相应的产品已报告。在烟草贸易市场,烟草通常出售烟草产品的形式,包括烤烟,再干烟叶、烟。在这里,我们报告质粒对转基因烟草的测试,这是指定为pGMT27。这是构建基于植物表达载体pBI121。pGMT27包含两个烟草内生基因(肌动蛋白和NR),基因的元素P-35S启动子,T-NOS终止剂,选择性标记基因《不扩散核武器条约》第二,成,酒吧,aadA,格斯报告基因。这七个外源基因能使转基因烟草的筛查率达到100%理论上在我们之前筛选策略12]。因此,定性PCR检测方法检测了九个目标。此外,qPCR化验P-35S和NR也是开发利用质粒DNA校准器。因此,我们的结论是,使用pGMT27质粒作为校准器为烤烟提供了高效的转基因检测方法。

2。材料和方法

2.1。烤烟和基因组DNA隔离

转基因检测烤烟的FAPAS(食品分析性能评估方案)和CORESTA(合作科学研究中心相对于烟草)水平测试在2014年被定义为积极的通用汽车的100%P-35S和T-NOS。Nontransgenic烤烟收集在我们的实验室。所有材料都是叶子的面粉。植物基因组提取工具包(TIANGEN生物技术,中国)来提取DNA根据制造商的协议。总DNA进行量化使用NanoDrop nd - 2000分光光度计(美国NanoDrop技术),OD260 / OD280≈1.80 - -1.90,这是100 ng /稀释μL工作股票无菌蒸馏水,储存在−80°C。

2.2。建设pGMT27质粒

根据筛选策略之前报道(12),我们合成一个3818 bp的片段成+酒吧+aadA+肌动蛋白+NR结,subcloned pMD18-T简单向量通过限制性内切酶网站,EcoR我和囊。此外,五个目标的完整的片段与EcoR消化我/囊和克隆植物表达载体pBI121而不是“T-NOS“相同的酶网站,创建pGMT27重组质粒,其中包括9个目标DNA片段组成的七个外源基因和两个内生。然后,利用TIANGEN pGMT27质粒分离和纯化质粒Miniprep工具包(TIANGEN生物技术,中国)根据制造商的指导方针。之后,它被囊ⅱ和EcoR我限制消化和DNA测序(上海Generay,中国)。量子位总DNA进行量化^®2.0荧光计(英杰公司生活技术,美国利用量子位^®dsDNA BR分析工具包(英杰公司生活技术,美国制造商的方向。复制数据的基础上计算pGMT27质粒大小(18296个基点)通过使用阿伏伽德罗常数(6.023×10²³)。质粒DNA分子量(660克/摩尔/ dp)计算与公式(A)提出的李et al。13]。

2.3。定性PCR检测pGMT27质粒

的LOD测试定性PCR,质粒拷贝数由0.1×TE缓冲(10毫米三、0.1毫米EDTA和pH值8.0)。所有样品都是由连续稀释10⁶拷贝/μL 1复制/μL,所有的反应都表现在20μL卷包含1.0 U (rTaq DNA聚合酶(豆类、日本)和2μ随着125年10 L×PCR缓冲μ0.5 M核苷酸,μ引物的M, 1μL的质粒DNA。PCR扩增进行C1000联系PCR(美国Bio-Rad)程序如下:5分钟在95°C的一步;40周期30年代在94°C, 45 s在63 - 65°C (T-NOS退火温度为63°C, 65°C)和其他人,和45 s在72°C;5分钟在72°C。放大产品在2%琼脂糖凝胶电泳在100 V大约40分钟。引物由上海Generay合成和纯化生物技术有限公司有限公司(表S1)。

2.4。定量PCR试验pGMT27质粒

2.4.1。反应体系和条件

所有qPCR放大反应进行20μ包含10 L最后一卷μL的预混料交货Taq混合(豆类、日本),0.5μ每个引物的米,0.2μ0.4 M的探测器μL火箭染料二世(50×),和1μL的质粒DNA。PCR是依照以下循环条件:95°C 30年代,40周期的5 s在95°C,和34 s 60°C。反应是在ViiA中运行^™7实时PCR系统(英杰公司生活技术,美国),和数据分析软件v1.2 ViiA 7。PCR引物和探针P-35S和NR是由上海Generay合成生物技术有限公司。(表吗S2)。

2.5。稀释标准曲线、再现性、可重复性和敏感性

测试pGMT27的可用性,质粒制备校准器和连续稀释10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²拷贝/μL和0.1×TE缓冲构造的标准曲线。重复性和再现性测试,相同的五个稀释点也被使用。每个稀释点在三个复制放大。再现性测试,放大是在三个不同的天内完成。的敏感性,它包括LOD和定量限,pGMT27质粒被稀释到50,25日,10日和5份/μL和0.1×TE缓冲。

2.6。转换因子(Cf)计算和未知样品的测试

为了最小化之间的差别质粒DNA和植物基因组DNA聚合酶链反应效率,计算Cf值是一个先决条件(14]。对于未知样品的测试,100%转基因烤烟DNA梯度稀释成100%,50%,25%,12.5%,和6.25% (V / V)的内容0%转基因烤烟DNA,反应是在ViiA运行^TM7实时PCR系统,然后目标基因和内源性基因拷贝数计算根据pGMT27标准曲线。根据公式计算进行(B)由π等建议。15),最后一个Cf价值五计算Cfs的意思表示。未知样品通用内容(%)是通过使用公式计算(C)根据πet al。15]。每一个反应是重复三次。

3所示。结果

3.1。建设pGMT27质粒通过定性PCR和LOD测试

图1代表一个质粒pGMT27(18296个基点),构建本研究的定性检测转基因烟草。它拥有9个目标包括七个外生和两个内生目标表所示1。囊二世和EcoR我限制消化(图S1)和DNA测序(数据没有)收购预计将质粒进行验证。在定性PCR检测灵敏度,九个目标通过使用10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²50 10、5、1份pGMT27质粒为模板被LOD方法测量。九个目标检测到低至5册,这意味着最低的测试水平(图5份2)。然而,我们建议模板应该超过10册如果pGMT27积极控制质粒在实践测试工作因为一些组织没有放大信号的三个重复时只有5份模板在场(数据未显示);因此,显然是更大的不确定性,因为低模板量。

3.2。准备pGMT27质粒校准器

pGMT27质粒被稀释到10⁶,10⁵,10⁴,10³,10²拷贝/μL,建立标准曲线P-35S和NRqPCR目标。两个反应的标准曲线显示在图中3。相关系数(R²)的值的标准曲线分别为0.997和0.998P-35S和NR这表明良好的线性。PCR效率分别为101.427%和98.036%,分别和数据生成的方程E= 10^{−1 /坡}−1 (16),分析了ViiA v1.2 7软件,和标准曲线的两个目标显示良好的线性。

3.3。重复性、再现性、LOD和定量限qPCR化验

Ct的重复性和再现性P-35S和NR,目标pGMT27质粒被稀释,放大了一天,三个不同的天,分别在表和数据显示和分析2。重复性测试,SD Ct值的范围从0.04到0.42,相对标准偏差小于1.29%。再现性测试,SD和相对标准偏差值在0.04至0.39的范围和0.18%到1.14%,分别。qPCR化验,通常,RSD小于25%的可重复性和再现性低于35%的人接受根据欧洲GMO的网络实验室(英格兰)2015年指南[17),我们的结果显示良好的重复性和再现性,都是在可以接受的范围。测试的LOD和定量限质粒pGMT27 qPCR,四种浓度(50,25日,10日和5份/μL)准备。根据病(17),LOD的验收标准和定量限应小于25份,50份,分别。化验的结果确定,LOD和定量限5和10份副本/反应P-35S和NR分别为(表3)。

3.4。估计Cf值和未知样品的定量分析

为了分析未知样品的转基因烟草内容通过pGMT27质粒作为qPCR校准器,Cf复制比率计算的值P-35S来NR。内源性基因NR是一个单份基因在烟草基因组中(5]。在表4每次Cf值,包括三个平行反应,分别为0.34,0.39,0.40,0.40,和0.41,Cfs的平均值是0.39。Cf的SD和RSD值分别为0.03和6.77%,分别,这都是在可接受的范围内。目的是测试的通用内容未知样品,6个浓度被用于分析,这些样本分别为0.5%,2%,5%,6.25%,12.5%,和25% (v / v),由混合的几种转基因和非转基因烤烟样品DNA。通用汽车的未知样本的百分比(C)计算公式。qPCR分析如表所示5,偏见−15.55%到1.93%不等的准确性;然而,我们的偏差值低于验收标准(根据英格兰(−25%至25%)17]。SD精度和相对标准偏差范围在0.02至0.62之间,从1.34%降至10.6%。所有这些结果显示良好的重复性,这都是在可接受的范围内。

4所示。讨论

在全球范围内,转基因植物的数量近年来呈指数上升,增加的复杂性所采取的努力执行实验室检测不仅授权食品和饲料中转基因生物样品还未授权的。为了生成可靠的数据,研究实验室需要协调他们的技术来量化转基因生物或证明不同的方法用于转基因生物的量化是可交换的(6,7]。定量检查转基因生物通常是由确定的相关目标的参考基因(8]。在最近的研究中,七个外生的频繁,理论烟草遗传转化事件[覆盖率达到100%12]。方法的检测和量化相关商业化转基因生物的目标和参考基因是可用的。此外,有许多研究证明方法的发展和其内部验证(6,10]。其他的研究表明,LOD 5和20份,分别利用质粒作为参考分子检测转基因油菜和大豆(18,19];相应地,在我们的研究中,九个目标检测到低至5册,这意味着测试水平最低的是5份。尽管如此,重要的是批判性评估任何验证状态之前实现方法研究实验室的常规样品分析。可靠的量化的转基因生物,实验室需要适当的组织和质量管理体系,和几个关键点应考虑分析方法,如抽样、样品制备、DNA提取,最近描述(10]。微分qPCR未经授权的转基因生物的检测是基于几种常见元素在不同的转基因生物的发生(例如,启动子和基因感兴趣的)。一个统计模型是研究开发目标的数量之间的差异的公共子序列和相关的目标的数量可以确定批准转基因和常见的供体生物序列。当这种差异统计偏离零,未经授权的转基因生物的存在可以推导出20.]。然而,这种方法有低灵敏度,可靠的前提是存在一个未知转基因超过30%。此外,qPCR化验P-35S和NR也是开发利用质粒DNA校准器。的R²值的标准曲线分别为0.997和0.998P-35S和NR,这些R²值≥0.98被接受(9),和其他研究者的结果范围从0.995到0.999 (18,21- - - - - -23]。理论上,Cf分数应该1.0定量PCR试验时外源基因和内源基因都是一份(5,15),但在这项研究中,Cf值为0.39,远低于1.0,我们可以观察到三个潜在原因:(1)质粒DNA之间的巨大差异和植物基因组DNA定量PCR效率,和一些研究涉及作物验证这是Cf值从0.53到0.83(已报告14,21,23];(2)这些样本的通用FAPAS积极的内容被定义为100%,但事实是不到100%通用内容;(3)烤烟DNA部分降解后固化(24]。Cf的SD和RSD值分别为0.03和6.77%,分别,这都是在可接受的范围内。进步的新方法,适用于特定序列的定量测定是一种很有前途的解决方案,它可以克服目前使用的方式/方法的缺点。在过去,几种不同的转基因生物的检测方法开发探索放大的不同方面,检测和识别方法(25,26]。最近,额外的方法已经开发(27- - - - - -31日]。因此,在当前的研究中,定性PCR检测方法检测了九个目标。高线性的标准曲线和有效的反应表明,pGMT27质粒适合进一步定量试验(32]。同时,使用pGMT27质粒作为校准器提供了一个高效的烤烟的转基因检测方法。

5。结论

新开发筛选质粒pGMT27提供更好的报道通用元素可以出现在一个样本,并将促进进步的检测未经授权的/未知转基因烟草。它包括两个烟草内生基因(肌动蛋白和NR),的外源基因P-35S启动子和T-NOS终止剂,选择性标记基因《不扩散核武器条约》第二,成,酒吧,aadA,格斯报告基因。总的来说,定性和定量PCR试验推断构建的质粒是一个合适的和具有成本效益的策略检测和量化的转基因烟草。

数据可用性

期间产生的所有数据或分析本研究中包括的主要论文和补充信息文件。

伦理批准

不适用。

同意

不适用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

静于概念化和调查研究,提供了方法,表现形式分析,写了初稿。张孝廉可视化研究,写了初稿。穆罕默德Faheem Adil编辑和审阅这篇文章。博雷调查提供正式的研究和分析。Mengao贾提供了方法和可视化研究。Huina赵导致数据管理和编辑和审阅这篇文章。Shizhou Yu可视化正式执行的研究和分析。Jiemin刘编辑和审阅这篇文章。郭Yushuang概念化的研究,导致资金收购,提供资源,审查和编辑这篇文章。伊姆兰海德尔沙姆西概念化和监督这项研究,导致资金收购,提供资源,编辑和审阅这篇文章。

确认

这项研究工作在经济上支持的关键特殊项目的中国烟草总公司110202101005 (JY-05), 110202001021 (JY-04)和110202001030 (JY-13)), Qiankehezhicheng[2018] 2344年,科技部的贵州省,中国(qiankehepingtairencai[2020] 6016号),国家自然科学基金(31660510和31660510),中巴项目国家自然科学基金委(批准号31961143008),中国国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目,国际青年科学家研究基金(批准号31750110462),江苏现代作物生产的协同创新中心(JCIC-MCP),中国。

补充材料

图S1:囊二世和EcoR pGMT27限制消化。表S1:用于定性PCR引物。表S2:引物和探针的序列P-35S和NR在qPCR。(补充材料)