文摘

的新测定方法1-deoxynojirimycin (1-DNJ)桑叶基于ultraperformance液体chromatography-tandem质谱(UPLC-MS / MS)。和碎干桑叶的样本被MeCN-water溶剂提取,纯化的石墨化炭黑(GCB)和主要二级胺(PSA)去除有机酸和颜料,然后分析了衰减和过滤之后。校准曲线显示线性浓度范围的10 - 500 ng / mL,相关系数为0.998。复苏的飙升1-DNJ强化三个层次的范围从94.6%到96.4%,相对标准差低于1.2%。此外,基体效应评估是微不足道的。与气相色谱(GC)方法相比,液相色谱(LC)通过实际样品检测,该方法获得更好的稳定性和检测效率。这些结果证明,该方法具有操作简单的优点,完全净化,预处理损失小,精密度和准确度好,测定特异性高,适用于大规模监测和精确定量1-DNJ桑叶。

1。介绍

桑树分支(小枝森)是一种传统的中草药,它的叶子是蚕的主要食物。它已经表明,桑叶的摄入或其提取物可以治疗糖尿病,主要活性成分是1-deoxynojirimycin (1-DNJ) [1,2),这是一种生物碱化合物和氮原子。它被发现是一个潜力α葡糖苷酶抑制剂通过有效抑制碳水化合物在人体内的变换,减少血液中的糖含量,抑制血糖和胰岛素分泌的迅速崛起后吃(3]。

目前,1-DNJ的检测方法主要是基于气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC) (4- - - - - -6]。据报道,1-DNJ成熟叶不同的浓度从0.1341到1.472毫克/克的干树叶在132个桑树品种(7]。然而,由于高水溶性和低吸光度的特点,基于GC和高效液相色谱的方法需要合适的衍生化过程4- - - - - -9),以及该方法采用气体chromatography-tandem质谱(gc - ms) [10]。因此,复杂的预处理操作将导致预处理时间长,稳定性差。

近年来,ultraperformance液体chromatography-tandem质谱(UPLC-MS / MS)已广泛应用于微量的测定,如农药、兽药和真菌毒素11,12]。它也被用于测定1-DNJ桑叶,可以克服衍生的问题基于GC或高效液相色谱的方法,可以获得较低的检测极限(13- - - - - -15]。然而,考虑到方法的准确性和重复性,如何有效地去除色素如叶绿素、有机酸等干扰物质导致基体效应和仪器污染是一个重要的问题在蔬菜农药残留检测的深绿色(16),也适用于桑叶的预处理过程。一些净化材料合成和发现可有效去除这些干扰矩阵。有机酸可取消的二氧化硅微球与氨基结合,由初级升级和更换二级胺(PSA),而石墨化炭黑(GCB)具有更好的吸附能力叶绿素(16]。一些固相萃取(SPE)方法基于这些材料已广泛应用于农药残留的分析和污染物在蔬菜和草本植物(17- - - - - -19),尤其是快速,方便,廉价,高效,崎岖的和安全的(QuEChERS)方法,近年来在这一领域是最受欢迎的(20.- - - - - -22]。

在这项研究中,一个巨大的监测和精确定量的方法1-DNJ桑叶中建立了基于质/女士,包括(1)确定一个合适的列和流动相比例和获取最佳仪器参数质系统;(2)确定最佳的提取、净化、和其他预处理流程;(3)进行方法学验证和比较与现有的GC和高效液相色谱方法。它是第一个开发的决心在桑叶1-DNJ质/ MS系统和矩阵干扰净化。

2。材料和方法

2.1。化学品和溶剂

桑叶收集从泰安(山东,中国)。树叶是收获,清洗,晾干12小时的80°C,磨成粉,然后通过一个100 -孔筛和存储在一个干燥盘之前使用。

1-deoxynojirimycin的参考材料(1-DNJ)从DASF购买生物有限公司有限公司(中国南京)的纯度为98%。乙腈(MeCN)和甲醇(高效液相色谱级)是来自默克(达姆施塔特,德国),而石墨化炭黑(GCB)和主要二级胺(PSA)净化粉购自Agela技术(天津)。

2.2。标准和样品预处理

股票(100标准的解决方案μg / mL): 10毫克的1-deoxynojirimycin标准准确加权(精确到0.1毫克)从棕色的100毫升容量瓶和甲醇稀释至体积。在最初的移动解决方案准备工作阶段(MeCN:水= 1:1)和稀释准备500年的六个浓度点校正曲线,200年,100年,50、20、10 ng / mL。股票的解决方案是使用之前保持在4°C。

200毫克的桑叶粉干重,放到一个50毫升离心管。50毫升的30% MeCN /水溶液后补充说,样品是用在一个超声波浴5分钟,在7000 r / min后离心5分钟在4°C。随后,5毫升的上层清液收集到一个离心管添加了45毫克PSA和30毫克GCB然后在10000 r / min离心5分钟后涡为1分钟。最后,1.0毫升的纯化上层清液被转移到一家50毫升容量瓶,然后稀释与初始流动相溶剂体积。解决方案是使用尼龙注射器过滤器(0.2过滤μ米)在注入前质系统。

应该提到,因为负样本没有用时,1-DNJ预处理测试的讨论,发表的方法检测到的样品(6)被雇佣为质量控制(QC)样品;因此,本文选取参数“准确性”表现出的相对检测精度比较组。这个测试,我们认为这是一个合理的解决方案。

2.3。质/ MS仪器

样本分析一组液体chromatography-tandem质谱,配备了电喷雾电离源(ESI)和三重四极质谱分析器(美国ExionLC-Triple四3500)。的色谱分离了SunShell C18(4.6×100毫米,2.6μ米)(ChromaNik、日本)列使用0.35毫升/分钟的流量在40°C。移动阶段A和B的高效液相色谱法是去离子水和MeCN,分别和一个5分钟梯度程序采用:B的比例保持在50%为2分钟,然后增加到90%在0.8分钟,1.1分钟,0.01分钟内突然下降到50%,并保持到最后。注射体积是2μl。在正离子模式下执行ESI 550°C接口的温度。窗帘的气体离子源1和2被设定为10,50岁,分别和50 psi。毛细管电压是5500 V的declustering潜在父离子(m / z = 164) 40 eV。四个离子m / z为146.0,109.9,128.0,和69.0采用产品离子,第一个采用的定量离子及其碰撞电压19日,22日,19日和26 eV,分别在每个离子的停留时间设置为200 ms。

3所示。结果与讨论

3.1。优化了仪器分析

3.1.1。分离柱的比较

理论上,1-DNJ最好由一列与氨基结合,因为这是用于分离单糖(如葡萄糖和果糖具有类似结构的高效液相色谱系统23,24),这是用于1-DNJ在前面的研究分析和显示一个好的结果(13]。在这项研究中,某些类型的列被使用和测试,包括SunShell C18(4.6×100毫米,2.6μ米),ZORBAX Eclipse + C18(2.1×50毫米,1.8μ米),ACQUITY UPLC®本·HILIC(2.1×50毫米,1.7μm),顶峰二氨基(4.6×150毫米,3μ米),如图1,这是发现SunShell C18柱会导致附近的保留时间2分钟,早于顶峰II氨基柱比其他列,但后来虽然可以获得令人满意的峰形状和分离。因此,SunShell C18选择高效液相色谱系统。

3.1.2。流动相和溶剂

良好的分离性能和完美的分布状态对目标化合物进行静止和流动相之间会通过合适的流动相溶剂,以及影响峰宽(25,26]。由于强烈的1-DNJ水溶性、水有助于洗脱,而有机溶剂会导致1-DNJ保留固定相,这不同于其他物质的分布特点。因此,流动相比例和梯度洗脱程序必须考虑。有机溶剂,甲醇和MeCN选择的测试中,我们发现使用MeCN会获得一个更好的形状、峰值较小的柱压力,更好的稳定注入。因此,MeCN被选中。

此外,初始流动相的比例和梯度洗脱过程进行了优化。发现在初始将导致更高比例的水保留时间早于1分钟,往往会让他的基体效应,这是令人不满意的。然而,更高比例的有机溶剂会使基体干扰筛选了更早。因此,我们建立了它们的几个组合测试相同的样本,采用保留时间,峰面积和半宽度(应用)作为参数。这是显示在表S1,有机相的比例的增加,保留时间的减少,和目标的峰面积值增加,而列密切相关的应用效率呈逐渐下降趋势。考虑到这些因素,水的流动相,MeCN以同样的比例被选为这个方法。此外,亚氨基的群体1-DNJ结构会导致阳离子特性,因此有必要提供氢离子通过添加甲酸电离过程。我们也验证了性能而添加0.1%甲酸,发现响应(峰面积)增长了22.6%,和稳定的区别也是显而易见的。最后,最优初始流动相,梯度洗脱,测定溶剂被证实。

3.1.3。仪器参数的优化

1-DNJ的标准溶液直接注入质谱使用注射泵和ESI检测到的源,获取更高的反应积极模式比消极的模式。强烈反应的前体离子出现m / z为164.0,而产品离子m / z 146.0, 109.9, 128.0和69.0显示相对更高的响应。因此,在多个反应模式(MRM),基于响应的差别,146.0 m / z是合理应用定量离子,而另3离子被雇佣为资格离子。用离子色谱图如图2,我们可以看到,监测参数可以达到一个理想的绝对响应值和相对响应率。

3.2。在预处理过程和参数优化

3.2.1之上。不同溶剂的萃取效率

混合MeCN-water采用的萃取剂。我们比较不同比例的萃取效果的MeCN萃取剂(0%,10%,30%,50%,80%,和100%),如图3。萃取效率达到最高,而MeCN含量为30%。因为强烈的1-DNJ水溶性,更高比例的水需要萃取剂,但它仍然需要一些有机溶剂辅助提取。

3.2.2。净化研究

有许多coextracts植物性食物,包括有机酸和叶绿素16]。这些物质进入质系统不仅会导致污染的高效液相色谱系统,离子源,和四极质谱分析器还导致基体效应和矩阵的干扰,这将影响测定的准确性(27,28]。因此,对提取溶剂净化作为本研究的重点。有些流程应用于农药残留测定被称为(29日,30.),包括分散固相萃取(d-SPE)基于GCB和PSA,以及基于阳离子交换固相萃取(SPE),和比较也采取不同清理程序的性能和效率。从图4,我们可以看到,平均精度由d-SPE SPE,没有清理过程分别为89.6%,62.4%,和106.3%,分别。虽然似乎没有清理组的准确性高,有一个干涉峰,没有与目标峰完全分离,这严重影响了定量。群SPE,水溶性强1-DNJ淋洗过程中会导致相当大的损失,和可重复性不是令人满意的。

此外,剂量的GCB和PSA进行了讨论。我们设置的添加量为10毫克,20毫克,40毫克,和80毫克正交试验比较的参数准确性、稳定性、和视觉净化效果。发现1-DNJ精度改善随着添加量的PSA,然而它显示小减少当PSA的添加量超过40毫克。这可能是因为PSA能有效地吸附干扰1-DNJ等有机酸,而非碱性化合物,从而减少矩阵干涉质谱分析。GCB,发现规律相似,但精度明显下降而增加超过40毫克。由于1-DNJ分子中的环平面结构,目标将由GCB虽然或多或少的吸附没有共轭双键。可见的颜色,如图5添加超过20毫克GCB影响很小,表明20 - 30毫克GCB添加可以吸附矩阵最叶绿素提取溶剂。结合正交试验的准确性的参考数据表S2和图6,45毫克PSA和30毫克GCB决心。

净化的萃取剂将导致的结果,最明显的一个是收购了离子色谱图的变化。提取离子色谱图如图所示7,包括纯化样品萃取溶剂和unpurified两个样品。可以看出,峰值后的信号干扰1-DNJ明显改善,这将有助于为定量的准确性。这是使用净化过程的重要原因。

3.2.3。稀释比例

1-DNJ的内容在桑叶的第一千(w / w) [13,31日]。质分析、最优线性范围是10 - 500 ng / mL。因此,提取过程的稀释比例是100倍,也就是说0.5 g和50毫升提取桑叶提取溶剂和稀释在净化和稀释50倍。

3.3。方法验证

虽然在桑叶1-DNJ的内容是相对较高的,限制的验证检测和定量(LOD和定量限)是完全在这个研究。基于信噪比的3倍和10倍,他们收购了4 ng / mL和10 ng / mL,分别和相应的方法检出限(MDL)和方法定量限制(MQL) 20毫克/公斤和50毫克/公斤,分别。标准溶剂浓度高于500 ng / mL,相当大的响应衰减被发现,这可能是由于竞争软电离的1-DNJ ESI源,线性范围的10 - 500 ng / mL决心。六个浓度点的10、20、50、100、200和500 ng / mL校准曲线的选择,和线性方程计算Y= 1.3342e5X,以相关系数为0.998。精密度和准确度也激增了积极的QC样品,由这种方法检测到的1-DNJ浓度为0.78毫克/克。飙升的1-DNJ浓度分别为0.1、0.5和2毫克/克,分别有六个平行样品每个浓度。复苏的三个层次分别为96.4%,95.7%和94.6%,分别虽然相对标准派生(rsd)分别为0.9%,1.2%,和0.9%,分别。上面的验证数据是令人满意的,说明好方法的适用性。

考虑到负样本的桑叶是很难获得,更准备矩阵标准溶液,我们调查了基体效应。100和500 ng / mL 1-DNJ水平上升到测试解决方案已经获得响应的阳性样品峰面积矩阵标准溶液作准备。峰面积飙升之前和之后的差异价值飙升采用矩阵标准溶液的峰面积越来越多。基体效应(我)值的计算方程我=一个_矩阵/一个_年代,在那里一个_矩阵是飙升矩阵标准溶液的峰面积和一个_年代是纯溶剂标准溶液的峰面积19]。

我是0.91和0.93,分别在100年和500年的浓度水平ng / g,毫无区别。基体效应值被认为是在0.9 - -1.1的范围的影响可以忽略不计。之前的研究(32]。所以,准备标准溶液的初始流动相溶剂适合这种方法。

3.4。调查方法的适用性

在这项研究中,十三桑叶样本收集来自中国八个地区的,和信息如表所示S3。所有的样品都被这种方法和其他基于GC和高效液相色谱两种方法,分别是(4,5]。每个样本集三个平行测试。结果也列在表中S3。有三种检测方法之间的一些不同的分析结果。GC组的数据似乎一般较低,和数据的高效液相色谱法集团似乎部分高和重复性不好。该方法的分析结果显示最好的可重复性和他们中的大多数其他两组之间的分布式下降。这主要是因为这两种方法都基于GC和高效液相色谱法需要1-DNJ衍生化;因此,衍生化导致的不确定的效率和稳定性测试性能比目前的研究方法。对于这个方法,rsd为13个样本的范围从0.5%到1.5%,表明该方法相对成熟和稳定。

4所示。结论

在这项研究中,一个新的分析方法测定桑叶的1-DNJ基于质。最优参数测试仪器分析条件下,测定基质干扰有效减少和满意的清洁性能时收购通过研究过程过程中,特别是基于GCB和PSA分散净化。MDL和MQL验证在20到50毫克/公斤,分别与该方法表现出良好的准确度和精密度根据不同级别的上升恢复测试,而基体效应被发现可以忽略不计。与发布的方法检测到GC或高效液相色谱法,这种开发方法解决了问题,如重复性差、定量不准确带来的衍生化明显,提高了检测效率。此外,开发方法可以用于大规模监测和精确定量1-DNJ桑叶,它具有重要的应用价值和创新意义。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括补充信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究的主要研究和开发项目是由山东鲁豫科技合作(批准号2019 lyxz023),泰安科技发展项目(批准号2019 ns087),中医2019年公共卫生服务专项补贴,全国中药资源调查项目。

补充材料

表S1:不同流动相组成对色谱峰的影响(c= 100 ng / mL)。表S2:数据的正交试验添加数量的GCB和PSA (n= 6)。表S3:检测结果1-DNJ从不同种类的桑叶样品通过三种分析方法。(补充材料)