文摘
在这项研究中,使用热水提取纤孔菌属obliquus低聚糖。deae纤维素、琼脂糖g - 200被用来净化纤孔菌属obliquus低聚糖。纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A。其分子量Mw大约1000哒。单糖组成及摩尔比葡萄糖:木糖:半乳糖:甘露糖= 54.1:13.6:13.2:6.7。此外,它还含有少量的半乳糖、葡糖酸、鼠李糖、岩藻糖。IOP-2A主要包含β糖苷键。其中,1,4-glycosidic债券占9.2%,1,6-glycosidic债券占85.1%。低聚糖大分子形成一个分层结构。老鼠实验表明,IOP-2A预防高脂血症的作用。同时,IOP-2A有某种对肝脏和肾脏的保护作用。IOP-2A预防高脂血症的机制是获得从小鼠肠道菌群的角度。
1。介绍
高脂血症是一种疾病,其血脂水平超过了标准(1- - - - - -3),可引起动脉粥样硬化、心血管疾病、脑血管疾病和其他疾病(4- - - - - -6]。它严重威胁着人们的健康。高脂血症的病因与饮食、情绪、锻炼不足,等。目前,治疗方法是使用他汀类药物,一类,烟酸和其他药物。这些药物的价格高,从而增加人们的经济负担。同时,降血脂药的药物有一定的副作用(7- - - - - -9)和有一定损害肝脏、胃肠道和肌肉组织。天然食品中的功能组件的降血脂药效果吸引了人们的注意力。这些物质的主要特征是,他们对人体没有副作用,有很好的降血脂药的效果。
低聚糖的活动被许多学者研究。例如,Govindan等人研究了抗氧化和保护作用Sapium sebiferum对酒精性肝损伤大鼠寡糖(10),还有一些真菌寡糖的研究报告。殷等人研究了食用菌低聚糖的免疫调节作用[11张,和其他广泛的医疗保健功能研究寡糖和其他组件的食用菌和食用菌的高附加值利用12]。刘等人研究了结构特征和免疫增强活性猴头菌属erinaceus低聚糖酶改性(13- - - - - -15]。杜等人研究了真菌的化学分析和抗氧化活性低聚糖(16,17]。纤孔菌属obliquus白桦茸角的学名,是一种真菌生长在桦树,广泛分布在中国东北。近年来,功能性研究真菌低聚糖等天然物质一直持续增加,如抗氧化作用[18- - - - - -20.,抗肿瘤21- - - - - -23),防辐射24- - - - - -26),降低血脂(27),调节肠道功能(28),杀毒软件(29日),和降低血糖30.- - - - - -32]。
然而,很少有报道的影响纤孔菌属obliquus低聚糖降低血脂,没有报告的功能纤孔菌属obliquus低聚糖在预防高脂血症。的提取和纯化纤孔菌属obliquus低聚糖和纯化低聚糖的功能,防止高脂血症进行了研究。
2。材料和方法
2.1。设备和试剂
气相色谱-质谱仪被安捷伦制造有限公司有限公司,美国。纤孔菌属obliquus子实体购买从境内渭河林业局,黑龙江省,中国。deae纤维素是购自上海原液生物技术有限公司有限公司琼脂糖g - 200购买从生物技术有限公司有限公司无水乙醇和氯化钠是购自北京化工厂。苯酚是购自上海中石化三井有限公司有限公司浓硫酸是购自国药控股集团的化学试剂厂。氯仿和正丁醇三号从天津购买化学试剂厂。盐酸和葡萄糖都购自国药控股化学试剂厂。氢氧化钠是购自天津北天一化学试剂厂。总胆固醇(T-Cho)检测组件,甘油三酯(TG)测试套件,低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)测定装备,高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)测定设备,总超氧化物歧化酶(T-SOD)决心工具包,丙二醛(MDA)决心工具包是购自南京建成生物工程研究所。高脂饲料和普通饲料是购自南京Shengmin科学研究动物农场。饲料符合GB / t14924.9 - 2001标准(这个标准指定配方饲料中常规营养成分的测定方法为实验动物,也就是说,水的测定方法,粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷和总配方饲料。)。
公里的老鼠,35天,SPF级,和男性使用,数量是60。他们购买的富康生物技术有限公司有限公司(许可证号。SCXK(北京)2020 - 0004)。
2.2。的提取和纯化纤孔菌属obliquus低聚糖
的子实体粉末纤孔菌属obliquus准确称重。首先,脂肪被删除,它是由乙醇回流使脱色了三遍。然后,它用水浴加热,再用热水提取出来。旋转蒸发温度提取的58°C,和旋转速度是30 r / min。绝对乙醇添加到浓缩液体,使最终的乙醇浓度80%。这是放置在一个4°C冰箱12 h。然后,它是离心机离心加速度2158×g。Sevage试剂添加到低聚糖溶液脱朊,Sevage试剂的用量是寡糖溶液的体积的1/4。与正丁醇Sevage试剂准备:氯仿= 1:4,通常三次脱去蛋白质,和冻干−55°C, 0.05 mbar, 12 h。原油的低聚糖纤孔菌属obliquus获得了。
2.3。净化的纤孔菌属obliquus低聚糖
纤孔菌属obliquus低聚糖在前一步获得⟶和deae纤维素柱层析法⟶纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2⟶柱层析法和琼脂糖g - 200⟶纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A⟶透析⟶真空浓缩⟶冻干⟶纯化寡糖IOP-2A。每个净化IOP-2组成部分的内容纤孔菌属obliquus低聚糖是最大的。IOP-2A和琼脂糖后得到了IOP-2B g - 200柱层析法。得到了两个纯化组件:IOP-2A纯化寡糖,IOP-2B低聚糖糖蛋白。我们主要进行了结构和降脂IOP-2A的考验。
2.4。IOP-2A红外光谱的测定
六种纯化纤孔菌属obliquus低聚糖。减少小鼠血脂的初步实验。没有显著差异的降脂活性低聚糖成分。因此,接下来,我们主要研究低聚糖IOP-2A高的内容。2毫克纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A重。200毫克KBr是补充道。KBr是烘干的恒重使用前在105°C。低聚糖是与溴化钾混合研磨和平板紧迫。测定进行了红外光谱仪的波数范围400 - 4000厘米−1。
2.5。IOP-2A分子量测定纤孔菌属obliquus低聚糖
分子量测定是由高性能凝胶渗透色谱法,用一个RID-10A视差折射探测器,日本岛津公司CLASS-VP工作站,和TSKgel g - 3000 pwxl不锈钢色谱柱(7.8×300毫米)。列的温度是35°C。低聚糖的浓度样本5毫克/毫升,装载量是20μl .流动相为0.2 M氯化钠水溶液流量为0.6毫升/分钟。
2.6。的决心纤孔菌属obliquus利用扫描电子显微镜低聚糖
的低聚糖纤孔菌属obliquus利用扫描电子显微镜观察。样本、表面形态、结构、大小和其他信息可直接获取。低聚糖样品前需要喷洒黄金观察。
2.7。测定的低聚糖成分纤孔菌属obliquus
重达5毫克的纯化纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A,添加5毫升2 M三氯乙酸溶液。混合物被保持在120°C 2 h的低聚糖水解,水解是用于备用。
单糖混合标准溶液,并准备20毫克/毫升浓溶液,分别。然后,混合和稀释到混合单糖的标准解决方案0.5毫克/毫升,1.0毫克/毫升,1.5毫克/毫升,2.0毫克/毫升,2.5毫克/毫升,3.0毫克/毫升。
衍生化的1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone: 200μL, 0.5添加了氢氧化钠溶液和1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone甲醇溶液,分别。氮添加到混合物和覆盖,保持在70°C 30分钟。然后,混合物加入200毫升盐酸溶液浓度为0.5 M,使样品的pH值约7。加1毫升氯仿和提取超过三次。进水口层由液相样品进行了分析。需要200μL标准单糖溶液混合,按照同样的方法由液相色谱分析。
液相色谱条件是日本岛津公司高效液相色谱系统(LC-10ATvp泵和SPD-10AVD紫外检测器)和COSMOSIL 5 c18-paq列(4.6×250毫米)。流动相是PBS (0.1 M, pH值7.0):乙腈= 81:19 (V / V)。流量为1.0毫升/分钟,注入体积是10μl .检测波长为245 nm。
2.8。结构设置的测试纤孔菌属obliquus低聚糖
甲基化法。并用gc - ms分析:最后的甲基化产品完全晒干,用1毫升的二氯甲烷溶解。膜过滤后,进行gc - ms分析。安捷伦科技7890 b GC和5977 b MSD系统被用于GC - ms分析。色谱柱是安捷伦DB-35女士。温度上升过程:140°C 2分钟。在5°C /分钟,提高温度到170°C和保持3分钟。1°C /分钟,提高温度到180°C,保持5分钟。3°C /分钟,提高温度到220°C,保持1分钟。提高温度到295°C在20°C /分钟,保持3分钟。
2.9。鼠标测试
公里的老鼠在隔离一周。然后,他们被随机分为4组,如表所示1。他们被允许自由吃喝。纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A由填喂法。
老鼠体重一周一次。学习的效果纤孔菌属obliquus低聚糖对小鼠的体重,在年底前填喂法低聚糖的实验中,他们禁食,喝水自由12 h。血液收集鼠标轨道。血液是离心机在4°C和2158 g×15分钟。血清离心得到的是存储在一个冰箱−20°C。这是用于测定血液指标。血液采集后,老鼠被脊椎错位。肝脏和肾脏。称量肝脏后,取代0.1 g和离心管。这是用于测定SOD和MDA。用生理盐水洗涤,干燥滤纸的表面。 Place in a centrifuge tube and weigh. Liver index and kidney index were calculated. TC, TG, LDL-C, and HDL-C were determined in mouse serum. The contents of TC, TG, LDL-C, and HDL-C in mouse serum were determined by kits. SOD and MDA were determined in the mouse liver.
添加冻老鼠肝是与生理盐水的比例1:9匀浆浓度10%。血液是离心机在4°C和2158 g×15分钟。上层的拍摄,和SOD和MDA测定的值。随访的指示工具包。
2.10。研究IOP-2A降低血脂的机制
低聚糖降低血脂的机制研究在小鼠肠道菌群的变化。老鼠的粪便被超净工作台。它们被放在冷冻存储管放入液氮贮存。微生物DNA提取。DNA纯度和浓度测量。老鼠的粪便菌群是由高通量测序。可变区V4的16 s rDNA基因被放大。引物的细菌16 s rDNA V4地区如表所示2。
PCR反应体系:Phusion大师混合15μL 2μM引物3μng / L, 1μLg DNA 10μL、H2O 2μl反应过程:98°C, 10秒;50°C, 30秒;和72°C, 5分钟。
2%琼脂糖凝胶电泳分离的产品。目标条被回收。
他们使用GeneJET纯化热科学的工具。图书馆建成使用TruSeq DNA PCR-free库制备Illumina公司公司的设备。图书馆测试合格后,PCR扩增产物测序了电脑。测序数据拼接和过滤。有效数据。丰富性、多样性和物种组成辣子鸡(操作分类单位)根据有效的数据进行了分析。
2.11。测试数据的处理和分析
检测指标测量三次,平均价值。测试结果表示为“均值±标准差。使用SPSS软件进行数据处理。
3所示。结果与讨论
3.1。IOP-2A红外光谱的测定结果
根据红外光谱波数1000 - 1200厘米−1对应于C-O-C的伸缩振动吸收峰。波数1300 - 1500厘米−1对应于碳氢键变形振动吸收峰。波数1600厘米−1对应于C = O键结构,波数2900厘米−1对应于碳氢键的伸缩振动吸收峰。波数约3400厘米−1对应地伸展振动吸收峰。附近有很强的吸收峰波数为880厘米−1。因此,可以看出IOP-2A主要的糖苷键β型糖苷键。参见图1。
3.2。扫描电子显微镜测量IOP-2A的结果
参见图2的测量结果纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A使用扫描电子显微镜。从图可以看出这一点纤孔菌属obliquus低聚糖大分子形成一个分层结构。
3.3。分子量的测定结果和IOP-2A组成
低聚糖的分子量是衡量高性能凝胶渗透色谱法。结果表明,锰IOP-2A约1000 Da,如图3。的单糖组成及摩尔比IOP-2A葡萄糖:木糖:半乳糖:甘露糖= 54.1:13.6:13.2:6.7。此外,它还含有少量的半乳糖、葡糖酸、鼠李糖、岩藻糖。参见图4。
3.4。甲基化分析的结果纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A
完整的甲基化后,酸水解、还原和乙酰化作用的样本,甲基糖醇乙酸酯衍生物。gc - ms技术分析了糖苷键。图5是低聚糖的分离色谱图。每个峰的质谱色谱分析。与标准的地图相比,糖基的类型总结了示例表中联系3。每个峰对应的离子碎片峰图所示6。
3.5。老鼠体重测试的结果
老鼠体重一周一次。学习的效果纤孔菌属obliquus低聚糖对KM小鼠的体重,每组小鼠的体重值和重量随时间的变化趋势如图所示7。小鼠的肝脏和肾脏指数的测量结果如图所示6。数据显示肝脏指数的高脂模型组与空白对照组相比显著增加,由于高脂肪食物的摄入。的测定结果TC, TG,低密度和高密度脂蛋白胆固醇血清KM小鼠如表所示4。见表5SOD和MDA含量测定结果的KM小鼠的肝脏。数据显示,纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A具有明显的降脂效果,并有显著的剂量依赖关系。
3.6。测量结果KM小鼠肝脏和肾脏的索引
参见图8。从图可以看出,IOP-2A能使小鼠的肝指数和肾脏指数接近正常的价值观,和有一个明显的量效关系。
3.7。测定结果的TC、TG、低密度和高密度脂蛋白胆固醇在小鼠血清
见表4。数据显示,IOP-2A可以预防高脂血症和具有明显的剂量反应关系。
3.8。SOD和MDA含量测定结果的老鼠的肝脏
见表5。数据显示,IOP-2A可以保护肝脏和具有明显的剂量反应关系。
3.9。不同的老鼠的粪便菌群水平
降低血脂的机制研究了低聚糖在小鼠肠道菌群的变化。老鼠的粪便被超净工作台和放置在冷冻存储管。他们被保存在液氮备用。微生物DNA提取,其纯度和浓度测量。老鼠的粪便菌群是由高通量测序。在每一组的差异是决定根据基因相似度97%。有1327种细菌在老鼠的粪便菌群在正常组(N组)、高脂模型组(M组),高剂量IOP-2A组(H组)和低剂量IOP-2A组(L组)。离开IOP-2A高剂量组的物种(H组)888人,占66.92%,丰度最高。IOP-2A高剂量组(H组)> IOP-2A低剂量组(L)组>正常组(N组)>高脂模型组(M组),如图9。
3.10。α多样性老鼠粪便菌群分析
α多样性,物种多样性指数选择。它可以代表物种分布的多样性和均匀性,可以显示的深度和数量的数据排序。多样性指数曲线的高脂血症预防空白组(N组),高脂血症模型组(集团)IOP-2A高剂量组(H组)和IOP-2A低剂量组(L组)如图10。
3.11。β多样性老鼠粪便菌群分析
第一主成分的贡献率的KM小鼠粪便菌群样本差异为57.58%。第二主成分的贡献率样本差异为16.37%。IOP-2A高剂量组(H组)和IOP-2A低剂量组(L)有很强的相关性,如图11。
3.12。门级别的多样性分析
超过1300种基因测序分析微生物检测的老鼠粪便菌群。以下是根据类群的分类顺序,分析类,顺序,家庭,属,物种。门的十大级别如下:拟杆菌门,壁厚菌门,Verrucomicrobia,变形菌门,放线菌,Desulfobacterota,身份不明的细菌,Deferribacteres,Campilobacterota,和Acidobacteria。门口的多样性分析如图12。在植物组间有显著差异。增加壁厚菌门比拟杆菌能产生更多的脂肪酸和增加血脂。从图可以看出10厚壁菌门和拟杆菌门的比例在高脂模型组(M)增加(33,34]。这将导致增加血脂。植物的成分组织L和N关系密切,和血脂水平接近正常价值。厚壁菌门的比例在H组拟杆菌门偏离了正常价值。此外,血脂水平接近正常价值,表明IOP-2A的脂肪和胆汁吸附量增加。因此,脂肪酸的吸收减少,阻止了血脂的崛起纤孔菌属obliquus低聚糖。
3.13。多样性分析水平
前10位如下:细菌性的,Verrucomicrobiales, Erysipelotrichales, Burkholderiales, Lachnospirales, Lactobacillales, Coriobacteriales, clostridia_ucg - 014, Desulfovibrionales,梭菌属的,clostridia_ucg - 014属于普里西拉的顺序,可抑制脂肪的增加的因素。clostridia_ucg - 014的比例高剂量组纤孔菌属obliquus低聚糖高于低剂量组。有一个显著的降血脂药的效果和数量之间的关系。细菌性的属于的顺序拟杆菌。在高剂量组的细菌性的比例纤孔菌属obliquus低聚糖是较低的。细菌性的降血脂药效果负相关(35]。它是与高剂量低聚糖组一致。参见图13。
4所示。结论
的分子量兆瓦纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A由热水提取1 kDa。主要的单糖组成及摩尔比纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A葡萄糖:木糖:半乳糖:甘露糖= 54.1:13.6:13.2:6.7。此外,有少量的阿拉伯糖,银河酸、葡糖酸、鼠李糖、岩藻糖。单糖分子之间的糖苷键β型糖苷键。低聚糖大分子形成一个分层结构。IOP-2A预防高脂血症的作用。IOP-2A预防高脂血症的机理是降低脂肪酸和其他营养物质的摄入通过改善小鼠肠道菌群的平衡,从而实现预防高脂血症的作用。纤孔菌属obliquus低聚糖IOP-2A可以用作功能性食品成分防止高脂血症,具有一定的理论和应用价值。我们的研究团队认为进一步的机理纤孔菌属obliquus低聚糖在高脂血症的预防。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。
确认
这项研究得到了国家重点研究和开发项目“高效制备功能组件的食用菌和创新产品开发和产业化示范”(项目号2018 yfd0400204)。