苦瓜皂苷对HepG2细胞糖脂代谢的影响秀丽隐杆线虫

摘要

本研究试图探讨苦瓜皂苷(BMS)对棕榈酸和葡萄糖处理的HepG2细胞糖脂代谢的影响秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫)。结果表明，BMS能有效促进棕榈酸处理的HepG2细胞葡萄糖消耗，提高糖原和ATP水平，同时显著降低甘油三酯(TG)含量。qRT-PCR数据显示BMS对脂肪酸有促进作用β通过AMPK-ACC2-CPT1β-氧化途径，并通过上调GLUT4表达的葡萄糖摄取。在模型葡萄糖处理秀丽隐杆线虫，我们观察到BMS明显抑制脂肪堆积，朝向一些体力活动无毒性一起。BMS在代谢的潜在机制参与的多不饱和脂肪酸合成的抑制和增强的脂肪酸β氧化。综上所述，BMS在HepG2和HepG2细胞系中表现出调节能量代谢的能力秀丽隐杆线虫。

1.介绍

在过去的几十年里，肥胖及其相关的代谢紊乱已成为世界范围内的公共健康问题[1]。肥胖伴随着体重增加、胰岛素抵抗、高脂血症等，增加了II型糖尿病、非酒精性脂肪肝和其他一些代谢综合征的风险[2]。目前，备受关注已经支付给一些天然营养早期干预肥胖。苦瓜（苦瓜L.）是通常用作药用和食用的植物疾病预防，特别是肥胖和糖尿病[3]。皂苷是在苦瓜中的主要活性成分之一，其结构是由三萜烯和类固醇[的4]。大量机制研究表明苦瓜皂苷具有降低血糖、改善胰岛素抵抗等生理活性，被公认为类胰岛素[五，6]。更有甚者，BMS的脂肪降低的效果是另一种生物活性，它与葡萄糖代谢交互，以改善胰岛素抵抗。体外研究表明苦瓜三萜通过下调PPAR降低前脂肪细胞活性和脂质积累γ在3T3-L1细胞中[7];体内研究报告指出，皂素提取物苦瓜显著抑制体重增加和内脏脂肪堆积在PPARα- 与PPARγ-在肥胖小鼠中介导的通路[8]。

秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫,也称为“线虫”下文中），为毒性或生物活性的评估和机理研究全系统的有机体。最近，秀丽隐杆线虫已成为研究脂质代谢的机制的最佳模型，由于其高度的同源性哺乳动物和丰富的基因缺失突变体[9]。脂质代谢包括脂肪酸合成，氧化，不饱和度和伸长率，其被深深进化上保守的中秀丽隐杆线虫到哺乳动物。此外，在肥胖，肝脏是重要胰岛素敏感性组织中的一个和HepG2细胞系通常是通过施加刺激与脂肪酸以研究肝功能的脂质代谢。

因此，本研究的目的是找出BMS的影响上改善胰岛素敏感性和脂肪沉积在肝细胞中。在此基础上，我们进一步证实在BMS的脂肪降低效应秀丽隐杆线虫并初步揭示了我们在目前的研究中使用的模型的潜在机制。

2。材料和方法

2.1。材料和化学品

新鲜苦瓜采自中国扬中市绿涧农业站，经江苏省农业科学院鉴定。HepG2细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所。大肠杆菌OP50和N2菌株秀丽隐杆线虫获得了来自秀丽隐杆线虫遗传学中心，美国明尼苏达大学。胎牛血清和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）购自GIBCO公司，USA购买。二甲双胍和棕榈酸购自Sigma，USA购买的。MTT法，油红O染色法，葡萄糖和糖原含量测定，ATP及TG含量的测定和蛋白质测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，中国购买。TaKaRa公司MiniBEST通用RNA提取试剂盒，PrimeScript™RT预混套件和SYBR预混防爆的Taq™试剂盒购自宝生物公司，日本购买。所有引物由上海生物工程公司，中国购买。所有其他试剂和溶剂都是从国药集团化学试剂有限公司，中国购买，要么分析或色谱级的。

2.2。BMS准备

未成熟的苦瓜用清水彻底清洗，把种子去掉。然后将果肉切成薄片，冷冻干燥，研磨(直径< 100)μm).加入75%乙醇在80℃条件下回流提取2次，取滤液。然后将饱和水的正丁醇从滤液中提取3次，直到浓缩的正丁醇相呈褐色粘稠。加入甲醇和丙酮产生沉淀，然后冷冻成BMS。

2.3。HepG2细胞培养和HepG2- ir细胞模型

细胞在含10%热灭活胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养，培养温度为37℃，在含5% CO的湿化培养箱中培养，单层培养融合度达80%_2.在对数增殖期的细胞用于所有以下描述的研究中。

对于胰岛素抵抗模型(insulin resistance, IR)，将接种于96个平板的HepG2细胞上清弃用无血清DMEM培养基孵育12h，保持禁食。弃上清液，PBS洗涤2次，加入无血清含软脂酸(终浓度为0.25 mM)培养液12 h，诱导HepG2-IR细胞模型。

2.4。细胞活力和葡萄糖消耗判断

基于建立的HepG2-IR细胞模型，BMS在不同浓度的50，100，250，500，750，1000，和2000年 μg/L were incubated together with palmitic acid after 12 h fasting. The cell viability was detected by MTT method [10]。

葡萄糖消耗测定分为空白组(无细胞组)、正常组、IR模型组、BMS或2mm二甲双胍模型组。软脂酸处理12h后，用葡萄糖含量测定试剂盒和MTT法试剂盒测定葡萄糖消耗量，计算公式如下:

2.5。糖原，TG和ATP含量测定的细胞

糖原、TG、ATP含量测定分为正常组、IR模型组、BMS和2mm二甲双胍模型组。经软脂酸处理12h后，使用测定糖原、TG、ATP和蛋白含量的试剂盒。公式如下:

2.6。秀丽隐杆线虫文化

用于M9缓冲液、S-complete和线虫生长培养基(NGM)秀丽隐杆线虫培养物如先前所述制备11]。葡萄糖板是通过在冷却后将葡萄糖(1M，无菌过滤)加入到蒸压NGM中制备的。蠕虫是根据标准协议同步的[12]。为了维护，蠕虫生长在NGM板和大肠杆菌OP50是新鲜的食物来源化验,秀丽隐杆线虫用ddH治疗₂O或BMS在含或不含葡萄糖(终浓度1 mM)的NGM中从L1到L4的48小时。将各组分为正常组、模型组和BMS 100、250模型组μ克/升。

2.7。油红O染色秀丽隐杆线虫

同步L1蠕虫用BMS(100或250)处理μg/mL) for 48 h to late L4 stage followed by Oil Red O staining. Oil Red O staining (∼1000 worms per each group) was conducted by washing animals with 1x phosphate-buffered saline (PBS). Worms were washed with 1x PBS three times, fixed with 4% formaldehyde for 15 min and dehydrated with 60% isopropanol for 15 min. Oil Red O solution (0.5 g/100 mL in isopropanol) was diluted in double distilled water to 60% working solution and filtered. Fixed worms were incubated in the working solution overnight at room temperature. Dye was removed after allowing worms to settle, and 200 μ加入L的1x PBS 0.01% Triton X-100。随机选取20-30只油红O染色的蠕虫，在相同的设置和曝光时间下使用配备DIC光学的徕卡显微镜(德国韦兹拉尔徕卡)进行成像。

2.8。TG分析为秀丽隐杆线虫

同步L1蠕虫用BMS(100或250)处理μg/mL)持续48小时至L4晚期，然后测量TG。秀丽隐杆线虫(每组约有2000个蠕虫)被超声细胞破坏者破坏并离心得到上清液。上清与试剂盒反应，在510 nm波长下测定吸光度。TG和蛋白质的测定是按照制造商的说明进行的。TG含量与Bradford法测定的蛋白浓度进行归一化。

2.9。火车头活度、雏型大小及寿命测定

在敲头时，用M9缓冲液清洗蠕虫，并将其丢在另一个NGM盘子上。在立体显微镜下观察到头部颠簸的频率(每组约30只蠕虫)，并记录下一分钟内身体中部弯曲方向的变化和次数。实验重复至少3次。

在弯曲体实验中，被检测的线虫(每组约30只线虫)被取到另一个NGM板上，并在20秒的间隔内记录弯曲体的次数。体弯被认为是线虫与咽后球对应的部分沿咽后球方向的变化ÿ-轴，假设线虫沿着X设在。实验重复至少3次。

对于育雏大小，每个组中的1个随机蠕虫转移到一个新的NGM板与OP 50，每一组具有三个重复。蠕虫在再现周期期间转移到新鲜的NGM板，离开了鸡蛋被允许孵化并计数每个蠕虫的后代的数量之前生长至L4阶段。

对于寿命，约100蠕虫每组每天被转移到相应的新鲜NGM板从L4期直到全部死亡。存活的蠕虫的数量进行计数和统计结果的实际数量，以死亡或审查动物的损失会略有不同所致。死亡的指标包括缺乏运动，寄生虫的压力运动，在温婉动人一个或两个尝试后缺乏咽收缩。

2.10。实时定量PCR（定量RT-PCR）对细胞和秀丽隐杆线虫

HepG2细胞的RNA和秀丽隐杆线虫样品经对TAKARA MiniBEST通用RNA提取试剂盒提取。素脚本™RT主混合物试剂盒根据制造商的方案适用于合成的cDNA。cDNA的扩增，并使用SYBR预混实施例的Taq II试剂盒在一个CFX96-PCR检测系统定量。引物序列列于表1。数据标准化为GAPDH基因在细胞和β在肌动蛋白基因秀丽隐杆线虫，分析使用△△Ct法[13]。

2.11。统计分析

Data are presented as means ± 小号E和与统计分析系统（SAS软件研究所，NC，USA）进行分析。使用单因子变异数分析，接着Tukey多重范围试验组之间的比较进行统计学分析。差异显着性是定义 的水平。

3.结果与讨论

3.1。BMS对细胞活力和葡萄糖消耗的影响

数字图1（a）显示不同浓度的BMS对HepG2细胞存活12h的影响。BMS浓度对50的影响不显著μ克/毫升到250μg/mL细胞存活率( ）BMS的浓度分别为500 750 1000和2000μg/mL明显( ）说明BMS浓度大于500μg/mL对细胞生长有明显的抑制作用。因此，我们确定BMSE的浓度范围在50 - 250之间μ克/毫升。

不同浓度的BMS对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响如图所示图1（b）。与棕榈酸诱导，将细胞的模型组中的葡萄糖消耗显著低于在正常组（ ）说明HepG2-IR细胞模型建立成功。与Met的效果相似，BMS浓度在100和250μ克/毫升，50不 μ克/毫升，明显增强抵抗HepG2胰岛素的细胞的葡萄糖消耗（ ）这主要是由于刺激了GLUT4向细胞膜的转移[14]。

3.2。BMS改变的糖原，TG和ATP的水平的胰岛素抵抗的HepG2细胞

肝脏是调节血糖人体的主要部分。如图图2（a）在模型组糖原含量显著降低相比于正常组（ ）提示棕榈酸诱导后，葡萄糖代谢特别是糖异生发生紊乱。然而，BMS在100和250μ与模型组和Met组相比，g/mL使HepG2-IR细胞的糖原水平显著正常化( )。与Min等的研究结果一致，从苦瓜中分离得到的三萜可以抑制L6肌管和3T3-L1脂肪细胞的糖异生，从而降低葡萄糖水平[15]。

在HepG2细胞中的棕榈酸长期治疗加速了脂肪堆积，其特征在于，TG水平的增加，如图图2（b）。补充BMS在100和250 μ相比，模型组g / mL的浓度下有效地降低TG含量，这表明BMS可以抑制肝癌-IR的细胞的脂肪沉积（ )。在3T3-L1细胞系中，据报道，苦瓜三萜提取物可减少前脂肪细胞活力和脂质积累[7]。

ATP水平反映能量代谢状态。软脂酸可导致细胞线粒体呼吸链解偶联，降低ATP水平，导致氧化磷酸化的空转状态[16]。与正常组相比，模型组ATP含量明显下降( )。只有BMS 250 μ克/毫升表现出改善ATP水平，甚至没有得到满足，其图示了BMS不仅回收糖原和TG的电平，而且还改善了能量代谢紊乱。二甲双胍未能增加ATP含量，可能是由于它的能力来抑制线粒体呼吸链，从而降低ATP产生和下降ATP / AMP，这反过来又激活AMPK [之比17]。

3.3。上糖脂代谢相关基因在HepG2-IR细胞中表达BMS的影响

为了发现BMS改善代谢指标的潜在机制，我们采用qRT-PCR检测相关基因的表达。从图图3（a）用于相关基因脂肪酸β氧化作用，BMS 250 μg/mL浓度显著刺激AMPK和CPT1 mRNA表达，降低ACC2 mRNA水平( ）这增强脂肪酸β氧化(18]。对于葡萄糖摄入相关基因，BMS可以增加PGC-1的表达α和GLUT4，类似于Met的效果。GLUT4从细胞质转移到膜的增加促进了葡萄糖的吸收[19]。根据Han的研究，苦瓜中的三萜通过上调链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的GLUT4来改善葡萄糖稳态[20.]。基于这些结果，我们推测BMS的代谢涉及潜在途径包括脂肪酸ββ-氧化和葡萄糖摄取（图图3（b）)。

3.4。BMS改变了脂肪堆积葡萄糖处理秀丽隐杆线虫

秀丽隐杆线虫已被广泛用作一种体内模型，用于探索脂肪储存的遗传调控，因为在人类中具有特征的脂肪合成和分解途径的许多方面都保存在这种易于处理的生物中[21]。在肠道秀丽隐杆线虫由20个细胞组成，负责食物的消化和营养吸收，以及脂肪的合成和储存[22]。由于BMS对in的脂质代谢有较强的影响体外，我们进一步评估BMS对整体脂肪和脂代谢的影响秀丽隐杆线虫油红O染色和TG分析确认。数字4提示1mm葡萄糖能显著促进脂肪在体内的积累秀丽隐杆线虫与正常组相比，BMS均在100和250μg/mL浓度明显降低了小鼠体内的整体脂肪含量秀丽隐杆线虫（ )。同样地，在BMS组中观察到在TG水平击打还原比模型组，这进一步证实无论是在BMS的降脂功效体外而在体内。

3.5。BMS对火车头活动、子代生产和寿命的影响秀丽隐杆线虫

基因和环境因素，包括食物，已经被证明影响身体活动秀丽隐杆线虫并且还可以在脂肪堆积发挥了很大的作用[21]。因此，我们需要弄清楚BMS是否影响了生物的基本生长发育秀丽隐杆线虫。如图所示5(一个)和5 (b)我们发现，BMS对身体弯曲无影响秀丽隐杆线虫,但它提高了接受葡萄糖治疗的蠕虫的头部抽打频率，这说明BMS可能略微提高能量消耗，以降低整体脂肪。长寿的秀丽隐杆线虫有许多因素，包括环境，饮食和遗传因素[密切相关23，24]。高浓度葡萄糖被示出为表现出对线虫的寿命[有负面影响25]。关于后代生产和长寿，数据表明BMS显示对育雏大小没有影响，同时延长葡萄糖处理的蠕虫的中值寿命，表明两者100和250 μ克/毫升BMS没有表现出毒性的生长和发育秀丽隐杆线虫。

3.6。BMS调节脂质代谢相关基因的表达秀丽隐杆线虫

要发现参与BMS对减少脂肪的效果潜在的分子途径，我们确定通过定量RT-PCR相关脂质代谢的一些重要基因。在我们的研究中，我们发现，BMS治疗深刻地减少去饱和酶基因的mRNA的表达，即脂肪1，脂肪5，和脂肪-7（图6)，而多不饱和脂肪酸(PUFAs)是从头合成的物质[26]。此外，我们还检测了一个涉及脂肪酸的关键基因表达β氧化作用，核激素受体NHR-49 [27]。We found that 1 mM glucose impaired the expression of nhr-49 compared to that in normal group, while BMS significantly upregulated nhr-49 gene expression, indicating that BMS might act on nhr-49 to regulate catabolism of fatty acids by mediating theββ-氧化途径，从而减少脂肪沉积秀丽隐杆线虫。这是符合BMS对增强效果β- HepG2细胞氧化。

4.结论

综上所述，在HepG2- ir模型中，BMS通过上调GLUT4的表达，抑制脂肪在HepG2细胞和HepG2细胞中的积累，从而促进葡萄糖的摄取和消耗，对维持能量稳态发挥了有益的作用秀丽隐杆线虫通过促进脂肪酸β氧化。从苦瓜中提取的皂苷有望成为治疗肥胖或肥胖相关代谢综合征的一种潜在的益生元。

数据可用性

本研究中产生或分析的所有数据均包含在本文中。

的利益冲突

作者声明，他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是由江苏省博士后科研资助计划（2020Z070）（31701598）中国国家自然科学基金，以及大学哲学社会科学计划（2019SJA1892）的支持。

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