菌群和真菌的分子特征黑从物种地鳖虫沃克 - 基于ITS1与CaM的高通量测序

抽象

地鳖虫沃克是首次记录在有价值的中国传统动物药神农本草。以前的研究已经表明，大肠sinensis由黄曲霉毒素（AFS），这是剧毒毒素，收获，储存和运输过程中容易被污染，从而对消费者健康构成相当大的威胁。大多数情况下，这些个AF所生产黑种类。在这项研究中，我们对比了传统的基于培养的稀释镀法的高通量测序（HTS）技术，用于TCM真菌识别大肠sinensis。两种方法都使用了内部转录间隔蛋白1 (ITS1)和钙调素(CaM)测序进行真菌分子鉴定。本研究设计的新型CaM引物适用于MiSeq PE300测序鉴定黑群落中的物种DNA样本。发现了更多的真菌种类大肠sinensis使用基于培养的稀释镀法发现基于HTS比那些样品。总体而言，结合ITS1和凸轮的测序功率是用于检测的有效方法和监测潜在的毒素黑物种大肠sinensis。总之，HTS可以用来获得大量关于真菌污染的动物医学测序数据，让潜在产毒真菌的早期检测，确保高效生产和安全大肠sinensis。

1.简介

阴土鳖的干燥体地鳖虫沃克是首次记录在有价值的中国传统动物药神农本草并已作为一个传统的中国医药（TCM）几百年。昆虫收集，沸水烫死，并在阳光下或烘烤或者干燥。由于其蛋白质含量高[1]和独特的味道，它也被认为是一些餐馆和客户提供高档菜。因此，随着需求增加大肠sinensis，它在中国拥有庞大的市场潜力，医药和食品。目前，大肠sinensis通过人工养殖提高。

由于人工培育E. sinensis通常以麦麸和腐烂的树叶等有机腐殖质为食，这些残留在肠道内的饲料在昆虫的收获、加工、运输和储存过程中极易受到霉菌和真菌的污染。根据市场调查，大肠sinensis容易被黄曲霉毒素污染[2-4，影响药品安全，威胁消费者健康[五，6]。黄曲霉毒素主要是由黑菌类 [7]。早期发现黑在污染物大肠sinensis可以防止霉菌毒素进入消费市场。迅速发现黑菌类对保证中药高效生产和安全生产具有重要意义。

鉴定黑SP。是基于形态学和分子种类的识别。DNA条形码已成为真菌的分子鉴定和真菌生态学研究越来越重要。核rDNA的内转录间隔区（ITS）区是探索环境样品中的真菌多样性和社区，因为ITS区可以从通用引物[大多数DNA样本很容易放大正式DNA条形码8]并且具有识别真菌的最宽范围[概率最高9]。然而，它的序列缺乏足够的变化来区分一些黑演化支(10]。Samson等推荐calmodulin (CaM)作为第二鉴定标记黑sp。11]。凸轮使用了到目前为止，已有有限的研究黑物种鉴定社区DNA样本英寸

随着高通量测序(HTS)技术的发展，真菌与植物相关的大规模研究数量[12，13]， 动物 [14]和人类[15]增加。在这里，我们设计了CMD5 [配对的新的引物CaMr116获得不超过300 bp的凸轮扩增子长度。该扩增子可用于MiSeq PE300分析黑种类。我们提取整个中医出现的真菌社区DNA大肠sinensis基于ITS1与CaM扩增子样品，使用高温超导技术研究真菌和微生物黑SP。并采用培养稀释镀法分离真菌大肠sinensis。与传统方法相比，HTS结果两个标记显示，结合ITS1和CAM的中医识别真菌是潜在产毒的发现非常有效黑种类。

2。材料和方法

2.1。样品制备

大肠sinensis购自山东曹县，经中国医学科学院药用植物研究所林玉林教授鉴定。三个样品大肠sinensis（ES1，ES2，ES3和）在两个基于培养的稀释镀法和HTS使用。

2.2。文化为基础的平板稀释法

每三个大肠sinensissamples (4 g) was crushed in a flask containing 40 mL of sterile water and 20 glass beads; the flask was shaken at 120 r.min^-1for 5 min and allowed to stand for 5 min. The suspension was diluted to 10^-1∼10^-6,1 mL of each sample was applied to malt extract agar (MEA) medium containing 100 ppm chloramphenicol, with three repeats for each dilute concentration. The plates were cultured at 25°C, and colonies were counted and separated into single spores after seven days. The hyphae were collected and ground with liquid nitrogen in a mortar. The DNA was extracted with the M5 Fungal Genomic DNA Kit (Mei5 Biotech, China), and PCR was conducted using ITS primers (ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG and ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC) [8]与CaM引物（CMD5：CCGAGTACAAGGARGCCTTC和CMD6：CCGATRGAGGTCATRACGTGG）16),分别。PCR产物采用Sanger测序进行测序。

2.3。HTS方法

2.3.1。DNA提取

他们三个大肠sinensissamples, each weighing 40 g, were ground with liquid nitrogen in a mortar. The total community DNA was extracted from 4 g of the resulting powder with the M5 Fungal Genomic DNA Kit (Mei5, China). The DNA concentration was measured with NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA) and was ≥20 ng·μ大号^-1。该OD₂₆₀/ OD₂₈₀为1.8和2.0之间。所提取的DNA储存于-20℃用于后续的分析。

2.3.2。ITS1与CaM底漆放大

The DNA extracted from each sample was used as template DNA at 10 ng. Because the entire ITS region ranges between 450 and 700 bp which is too long for HTS, a partial sequence was used. The primers ITS1-F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) [17]和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[8，18]被用于扩增ITS1区域。ITS1-F和ITS2已经使用在过去的10年经常调查，从环境样品真菌群落的多样性和组成[19-21]。使用引物CMD5和CaMr1(5’-CCTTRGTRG TGA TYT GRC CT-3’，本研究)扩增一段CaM。使用Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶(TransGen, China)进行pcr。反应体系为4μ大号五 × Fast Pfu Buffer, 2 μ大号dNTP (2.5 mM), 0.8 μ大号each of the forward and reverse primers, 10 ng of template DNA, 0.4 μl快速Pfu聚合酶，和超纯水至20的最终体积 μ大号。PCR amplification was performed under the following conditions: 95°C for 5 min; 95°C for 30 s, 55°C for 30 s, and 27 cycles of 72°C for 45 s; and 72°C for 10 min. All samples were used in the experiment, and each sample was amplified three times. The PCR products of the same samples were mixed and detected by 2% agarose gel electrophoresis, and the PCR was recovered with the Axy Prep DNA Gel Recovery Kit (Axygen, USA).

2.3.3。Illumina的测序PE300和数据分析

扩增子（Illumina公司，USA），由上海Biozeron生物科技有限公司（上海，中国）使用Illumina MiSeq PE300平台（Illumina公司，USA），Miseq试剂盒V3（600周期）测序。

Illumina公司PE300测序数据最早包含所有样品的有效序列。基于配对末端之间的重叠（PE）读取，成对的读段拼接成的序列。最后，根据该条形码和引物序列中，通过剪接得到的各样品的高品质的序列，并根据正向和反向条形码序列方向被纠正，并在此过程中使用的引物的方向。嵌合体取出，最后得到一个有效的序列文件。使用Usearch（version10进行各样品的个OTU的生物信息的统计分析：http://drive5.com/uparse/）软件在由分类的97％的相似性水平。

以获得对应于每个OTU，在RDP分类[物种分类22]被用来代表OTU序列的97％的相似性水平进行分类，并且在每个类别等级（科，属，种和）计算各样品的群落组成。香农指数的阿尔法多样性值[23（http://www.mothur.org/wiki/Shannon）和Simpson指数（http://www.mothur.org/wiki/Simpson)were使用mothur（版本v.1.30.1计算http://www.mothur.org/wiki/Schloss_SOP#Alpha_diversity）软件[24]。用不同的测序数据的样品中的物种的丰富性，通过稀疏曲线相比较[25]。

3.结果与讨论

用于真菌的三个分离的基于培养的稀释镀法大肠sinensis样品（ES1，ES2，ES3和）。总共32个克隆真菌从所有样品获得的。我们从各32个克隆中提取基因组DNA，并使用Sanger测序测序ITS与CaM的PCR产物。通过对NCBI数据库与BLAST工具比较ITS与CaM序列，一共有六个真菌物种进行鉴定，包括白色曲霉，A pseudoglaucus，A.曲霉，塔宾，产黄青霉，和Hyphopichia burtonii。

用于HTS分析，社区DNA从每三个的提取大肠sinensis样品一式三份。基于真菌ITS1区域的扩增子测序，使用Illumina MiSeq PE300对总共9份DNA样本进行分析。扩增子的平均长度约为227 bp。共得到394,295条序列(表)1)。通过PE比对、质量过滤、嵌合体和单例删除后，每个样本回收了超过100,000条ITS1序列。Shannon稀疏分析表明，每个样本的序列数据是饱和的(图)1)。共有286个OTU中被发现大肠sinensis。的分类学和功能注解序列数据库NCBI核苷酸（NT）被用来确定140真菌属。在样品ES1和ES3，黑是大多数真菌属，占96.9％和属的99.3％，分别。然而，物种级分类未见A.曲霉或塔宾，将其使用基于培养的稀释平板法找到。在样品ES1，序列25％的注释以黑部分黑（前身为属Eurotium），但不能识别到物种（图2)。

使用HTS平台，使用凸轮基因序列的一部分来识别未定义的黑SP。在大肠sinensis样本。在黑SP。，the CaM PCR product length obtained with previously described primers was about 600 bp [16]，这是太长HTS。他们三个大肠sinensis使用CMD5和CaMr1这两种引物对样本进行了三次重复测序。扩增子的平均长度为249 bp。共得到1026,856条序列(表)2)。香农稀疏分析表明，每个样品的测序数据是饱和的（图3)。共发现193个otu。当使用分类和功能注释序列数据库Nt时，只发现13个真菌属。通过测序CaM鉴定的真菌属数远低于ITS1鉴定的真菌属数。这是因为CaM序列丰富黑属，同时在其他真菌罕见。十九黑根据CaM的热释热温度(图)对物种进行注释4)。所有四种黑种（A. candidus的，答:pseudoglaucus，A.曲霉,塔宾）使用基于培养的稀释平板法还通过基于凸轮扩增子HTS发现找到。此外，另有15黑种被发现大肠sinensis样品，包括潜在的毒素的真菌答:flavus。

ITS是主要的真菌条码标记，用于识别个体菌株和分析环境样本中的真菌多样性[26]。除了通用ITS1和ITS4引物，最引针对ITS区域被刊登在20世纪90年代[8，17]。其他ITS引物靶向ITS1或ITS2区域是最近，旨在更好地利用HTS的[18，27-29]。在本研究中，我们使用的是ITS1-F和ITS2引物，其PCR产物不超过300 bp，适用于高温超导。扩增子在区分真菌属方面是有效的中华绒螯蟹。然而，一些研究已经表明，ITS序列高度保守黑部分黑（前身为属Eurotium），不能用于区分不同的物种[10]。CAM是一个CA²⁺传感器参与了大量的生物过程。在先前的研究中，CAM序列用于区分黑种类。为了识别潜在的毒素黑使用HTS物种中华绒螯蟹，设计了一种新的用于高温超导分析的CaM引物。因此，可以用CaM HTS分析进行鉴定黑物种群落DNA样本，弥补了ITS1的不足。

在ES1样品，10.9％序列注释以答:flavus;然而，它不是通过基于培养的稀释镀法检测。众所周知，真菌的比例高，目前无法提供人工条件下培养[三十]。虽然我们粉碎了大肠sinensis样品中，真菌残留在肠道内很难分离。HTS可以更有效地鉴定内部真菌。

在ES3样品，只有两个注释以序列答:flavus通过HTS，而基于培养的稀释电镀方法不能分离答:flavus从样品。的产毒的微量答:flavus在大肠sinensis很难通过基于培养的稀释镀法来分离。在不适当的条件下贮存，潜在产毒真菌可以在绽放大肠sinensis。此外，高温超导技术只需要几个小时，而基于文化的稀释电镀方法需要近半个月。总体来说，高温超导真菌微生物的分析比基于培养的方法，更好地为早期发现潜在的产毒真菌大肠sinensis。我们的研究结果表明，HTS是在兽药识别真菌毒素非常有效大肠sinensis。

学习英语是很重要的黑SP。在订单的食品和药品，从霉菌毒素望而却步。在HTS的发展作为屏幕真菌毒素的下一步骤可以是黄曲霉毒素基因本身的检测。黄曲霉毒素的生物合成途径已被完全阐明，并且两个基因的表达水平，AFLS和aflR，调节结构基因的转录的黄曲霉毒素集群中的[31，32]。这两个基因的表达水平可以反映黄曲霉毒素产生水平。接下来，我们可检测的表达AFLS或aflR基于HTS预测中药中是否存在潜在的产毒真菌。

4.结论

我们采用培养稀释镀法和HTS研究了三种菌种的真菌组成大肠sinensis样本。污染物真菌属和由HTS鉴定物种的数量显然比通过使用基于培养的稀释电镀方法获得的高得多。基于该ITS1扩增子的HTS，286个OTU注释以140真菌属被发现。黑在所有这三个占主导地位的真菌属大肠sinensis样本。共有19个黑基于CaM扩增子的HTS发现了种。其中，只有四个黑基于所述基于培养的稀释镀法中发现的物种。有一些序列答:flavus通过高温超导在ES1和ES3中发现。联合应用ITS1和CaM是监测中药中潜在产毒真菌和霉菌毒素的有效预警方法。

数据可用性

原始序列在NCBI的序列读取存档可用的登录号PRJNA598990下。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

这项工作是由青海大学学报（2017-ZZ-15）项目“中国西部之光”高原生态与农业国家重点实验室，中科院，和医学（CIFMS CAMS创新基金打开项目支持，项目批准号。2017-I2M-1-013）。

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