肠蹄S37作用方式的部分纯化和表征：产生的细菌霉素gydF4y2Ba肠球菌粪便器gydF4y2BaS37从家禽粪便隔离gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

本研究的目的是纯化和表征肠毒素S37的作用方式，肠毒素S37是由gydF4y2Ba肠球菌粪便器gydF4y2BaS37是最近从鸡粪中分离出来的菌株。Enterocin S37的分子量在4到5 kDa之间。1小时后仍保持活性gydF4y2Ba在pH值范围为4.0至9.0。此外，无细胞上清液gydF4y2Ba肠球菌粪便器gydF4y2BaS37和纯化的enterocin S37对革兰氏阳性菌均有活性gydF4y2Ba单核细胞增多性李斯特氏菌gydF4y2Ba缝隙,gydF4y2BaL. Innocua.gydF4y2BaF，gydF4y2Ba肠球菌粪便器gydF4y2BaJH2-2,gydF4y2Ba短乳gydF4y2BaF145。采用硫酸铵沉淀法纯化enterocin S37，然后采用疏水相互作用色谱法纯化。蛋白酶K治疗肠球菌素S37gydF4y2Ba-Chymotypsin，毒素证实了其蛋白质性质，而其用溶菌酶和脂肪酶的治疗导致活性的改变。肠杆菌S37是疏水性的，抗 -gydF4y2Ba李斯特菌gydF4y2Ba并且可能通过细胞内k的耗尽来表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba离子作用于gydF4y2Ba频道。这项研究有助于提高肠陶瓷的作用方式更有见解。gydF4y2Ba

1.介绍gydF4y2Ba

细菌是由细菌产生的核糖体综合抗微生物肽，其适用于其用作天然和无毒食品防腐剂的相当令人兴趣，以及它们在人类和兽医应用中的潜在使用，以及动物生产领域[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．1976年Tagg等gydF4y2Ba．gydF4y2Ba定义细菌素为杀死密切相关细菌的蛋白质化合物，但现在认识到细菌素也可以跨属(广谱)有活性[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．目标菌株的抗菌药物敏感性任何细菌素可能取决于它生长的生态条件随着盐浓度的变化,pH值、膜的破坏分子,或诱导文化,和大量的其他环境参数可以产生重大影响gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．由于革兰氏阳性细菌素的异质性，使其分类变得困难，因此，随着被鉴定的革兰氏阳性细菌素的数量不断增加，分类方案不得不不断演变[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Klaenhammer [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]建议包括I类或Mantibiotics的四类细菌素，这是小膜活性肽（gydF4y2Ba5 kDa)，含有特殊的氨基酸gydF4y2BaβgydF4y2Ba- 含甲基兰尼硫胺（因此名称Lantibiotics）和脱水残留物。Nisin是I类细菌素的最具特征。II类被定义为含有含有甘氨酸前体中的甘氨酸族加工位点的小型热稳定非本粒子活性肽，其存在具有不同量的疏水性和中度至高热稳定性的两亲螺旋的存在。这些被进一步细分为三个名为Subclass Iia的子组，这是gydF4y2Ba李斯特菌gydF4y2Ban端活性肽和YGNGV box [gydF4y2Ba9gydF4y2Ba];IIb亚类:由两个具有活性的蛋白质多肽组成的poration复合物[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]和IIc亚类，其中包含需要还原半胱氨酸残基才能发挥活性的硫醇活化肽[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．第III类是大型热不稳定蛋白，通常具有酶活性，最后是第IV类，由复杂蛋白组成。然而，最近的分类只报告了三个主要类别[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

许多gydF4y2Ba肠球菌gydF4y2Ba各种生态系统的菌株的特征是广泛的食物丧失的拮抗剂[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．通过肠球菌菌株产生的细菌素显示出异构结构和其作用方式的差异[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．大多数细菌素生产肠球菌菌株不仅从不同类型的食物中分离，而且从肉鸡中分离[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]及动物分泌物[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．据文献报道，其中一些细菌素对广谱细菌，包括革兰氏阳性细菌，如gydF4y2Ba葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba链球菌gydF4y2Ba和革兰氏阴性细菌一样gydF4y2Ba弯曲杆菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba沙门氏菌gydF4y2Ba，有医疗价值的品种[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．生产这种生物编织物的能力可能在提供非杀菌剂生产者菌株上提供生态优势的作用。以前，我们已经孤立了一种gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2Ba来自鸡肉[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba似乎是一种细菌素的制造者。在这项工作中，我们进行了这种名为肠毒素S37的肽的纯化和作用模式的表征。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2．1．细菌素生产商应变gydF4y2Ba

粪大肠gydF4y2BaS37是从位于法国西部Ancenis的一个农场收集的家禽粪便中分离出来的[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaS37通过测序整个16S rRNA基因确定[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaS37在第一例中显示了针对属于的菌株的拮抗作用gydF4y2Ba李斯特菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba弯曲杆菌gydF4y2Ba物种 [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

2．2.抗菌活性gydF4y2Ba

针对表中列出的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌评估肠蛋白S37的抗菌活性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．通过硫酸铵沉淀和两个连续反相 - 高效液相色谱（RP-HPLC）步骤使用无细胞上清液（CFS）和部分纯化的肠蛋白S37，以评估表中列出的靶菌株的拮抗作用gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaS37,gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaJH2-2,gydF4y2Ba短乳gydF4y2BaF1.114，gydF4y2Ba磅。保加利葡萄酒gydF4y2Ba340年,gydF4y2Ba磅短gydF4y2BaF145,gydF4y2Ba假单胞菌spgydF4y2Ba．131年,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaCIP 76.24,gydF4y2BaSalmonella Montevideo，Sal。血清gydF4y2Ba血清型gydF4y2Baenteinidis.gydF4y2BaCIP 81.3，gydF4y2Ba葡萄球菌epidermidisgydF4y2BaCIP 68.21,gydF4y2Ba芽孢杆菌gydF4y2BaCIP 78.3gydF4y2Ba，gydF4y2Ba和gydF4y2Ba明串珠菌属mesenteroidesgydF4y2Ba无性系种群gydF4y2Ba．mesenteroidesgydF4y2BaDSM 20240是在脑心灌注肉汤(BHI)培养基上生长的(AES, Bruz France)，而gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba缝隙,gydF4y2BaL. Innocua.gydF4y2BaF在艾利克培养基(AES)上生长。gydF4y2Ba空肠弯曲杆菌gydF4y2BaNCTC 11168在Brucella培养基（AES）中生长。gydF4y2Ba

抑菌活性用众所周知的琼脂扩散试验测定[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．为此目的，100gydF4y2Ba将目标菌株过夜培养的L添加到20ml含有0.8% (w/v)琼脂的Elliker或BHI软琼脂培养基中(Biokar diagnostics, Beauvais，法国)。在固体琼脂和50gydF4y2Ba每个被测样品的L注入井中。培养皿在室温无菌条件下放置1 h，然后根据待测菌株在适当温度下孵育18 h。在此孵育期后，通过观察含CFS的孔周围的抑制区来检测其抑菌活性。需要注意的是，上清液是在15000g的温度下离心30分钟得到的gydF4y2BaC、通宵培养gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2Ba生长在gydF4y2Ba在MRS培养基上孵育18 ~ 24 h [gydF4y2Ba17gydF4y2Ba) (AES)。加1 N NaOH中和CFS, 0.2过滤gydF4y2Bam膜(德国哥廷根萨托里乌斯)。gydF4y2Ba

任意单位(AU)的计算方法由Batdorj等人描述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．用磷酸盐缓冲液(25 mM K)连续稀释两倍gydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 25毫米KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba，pH 7）过滤通过0.2 M膜（Sartorius）。通过琼脂扩散试验测试这些样品gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba如前所述，EGDE菌株。一个任意单位定义为未显示目标菌株的生长的最低稀释的倒数。gydF4y2Ba

2．3.细菌素纯化gydF4y2Ba

将CFS中和并过滤(400 ml)，用硫酸铵沉淀至80%饱和溶液。三个不同的组分被回收并重悬在40毫升磷酸盐缓冲液(25毫米KgydF4y2Ba_2gydF4y2BaHPOgydF4y2Ba_4gydF4y2Ba， 25毫米KHgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿宝gydF4y2Ba_4gydF4y2BapH值7);采用反相高效液相色谱(ATOLL 15 MP3)对其进行分析gydF4y2Ba；gydF4y2Ba250 mm × 10 mm Interchim, Montluçon，法国)先前与溶剂A (0.05%， v/v，三氟乙酸[TFA])平衡。采用从0%溶剂B (0.045%， v/v, TFA, 80%乙腈)到100%溶剂B的梯度在45分钟内洗脱。将流速调整为3ml .mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}在220和280 nm处记录吸光度。收集10 ml馏分，测定其抑菌活性。用Speed-Vac浓缩器(SC110A, Savant)从活性组分中去除乙腈，用磷酸盐缓冲液(50 mM;(pH = 7)。将活性组分进行聚合，并在Waters Alliance装置和Millennium软件(Millford, MA, USA)上采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)继续纯化细菌素。集中细菌素(80gydF4y2Bal)被注入分析CgydF4y2Ba_18gydF4y2Ba列(对称300;5gydF4y2Bam;300球;150 × 4.6 mm, Waters, Guyancourt，法国)在0%溶剂C (0.045% TFA in HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO）和50％溶剂D（80％乙腈，20％H.gydF4y2Ba_2gydF4y2Bao，0.05％TFA）。在30分钟内以30％至100％溶剂D的线性梯度进行洗脱。将流速调节至0.8ml mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}．用光电二极管阵列检测器(PDA 996;人工收集。然后将馏分在一个快速真空浓缩器中浓缩。gydF4y2Ba

2．4．酶、pH和热处理对细菌素抗菌活性的影响gydF4y2Ba

的影响gydF4y2Ba-chymotrypsin（1 ），木瓜蛋白酶（1 )、蛋白酶K (0.5 mg/mlgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}),溶菌酶(2gydF4y2Ba)和脂肪酶(1gydF4y2Ba)(所有酶均来自德国Sigma-Aldrich)对enterocin S37的抗菌活性进行了琼脂扩散试验，如Batdorj等人所述[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．用上述酶处理CFS 1 hgydF4y2BaC. pH稳定性研究如Line等所述[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．因此，用1n HCl或1n NaOH将10ml的样品(CFS)调整到pH值从3到10不等。所得馏分在室温下孵育2 hgydF4y2BaC.在此孵育期后，用琼脂孔扩散法测定每个处理样品的抑菌活性[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．通过加热100在高温下研究肠素S37的稳定性 上清液在gydF4y2BaC 15分钟，gydF4y2BaC为1 h和gydF4y2BaC 15分钟。在冰中冷却后，用琼脂孔扩散法检测每个样品的拮抗作用[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

2.5。十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳（页）gydF4y2Ba

为了测定enterocin S37的表观分子质量，将SDS-PAGE凝胶切成两部分。用硝酸银染色法对含有分子标记物的凝胶部分及样品进行染色[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]，其余只包含样品的部分，用定期更换的MilliQ无菌水广泛清洗。第二部分用播种指示菌的软琼脂(0.8%)覆盖，直接检测抗菌活性gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba在EGDe和孵化过夜gydF4y2BaC。gydF4y2Ba

2．6．肠球菌素S37细菌素耐药变种的开发gydF4y2Ba

通过逐步培养的培养物开发肠杆菌素S37的抗性变体gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba缝隙在gydF4y2BaC在胰蛋白酶汤（Biokar诊断）中补充有0.6％（w / v）酵母提取物（Consorotechnie sa，la courneuve，法国）和称为tsye brooth（tsyeb）。在最小抑制浓度（MIC）的2-4-6-8-和10倍下加入肠杆菌素S37和10倍。麦克风是确定的gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2BaEGDe根据Naghmouchi等人[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]使用酶标仪ELx808 (BioTek Instruments, Bad Friedrichshall, Germany)。抗性变异的稳定性在50代以上进行了检验。在TSYEB生长50代后gydF4y2BaC，将菌株以10倍MIC接种于含肠毒素S37的TSYEB中。gydF4y2Ba

2.7。K.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba频道调制器gydF4y2Ba

l . monocytogenesgydF4y2BaEGDe及其抗细菌素变异株生长于gydF4y2Ba5 . C在TSYEB中孵育24 hgydF4y2Ba和KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道调制器（如Pinacidil（PI）10 克罗玛卡林(cromakalim)， 10岁gydF4y2Ba格列吡嗪(Gli)在10gydF4y2Ba肠杆菌S37与k的组合gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba在类似条件下也实现了信道调制器。所有这些KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba从Sigma-Aldrich（德国）获得通道调制器。通过测量595nm（OD的光学密度来监测生长（ODgydF4y2Ba_595gydF4y2Ba250年)gydF4y2BaL置于微孔板孔中新鲜接种培养基[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

肠杆菌S37在每k的存在或不存在下的抑制活性（Ia）gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba如naghmouchi等，计算了通道调制器gydF4y2Ba．gydF4y2Ba［gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．显然，IA的百分比= 100 - 100 (ODgydF4y2Ba_595gydF4y2Ba(x) / ODgydF4y2Ba_595gydF4y2Ba(在指数增长期间)。值(x)为含抑制剂培养物，(i)为未受抑制的对照培养物。数据用enterocin S37/K获得的IA变化百分比表示gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道调制器。gydF4y2Ba

3.结果gydF4y2Ba

3．1.Enterocin S37的活性谱gydF4y2Ba

慢性疲劳综合症的gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaS37显示出活动gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaJH2-2,gydF4y2Ba磅短gydF4y2BaF1.114，gydF4y2Ba磅短gydF4y2BaF145,gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2BaEGDE和gydF4y2BaL. Innocua.gydF4y2BaF.但对表中列出的其余菌株均未检测到抑菌活性gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．令人惊讶的是，反gydF4y2Ba弯曲杆菌gydF4y2Ba以前观察到的活动[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]在本研究中未被恢复，争论不稳定性特征(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．此外，对抗菌株观察到的活动gydF4y2Ba肠球菌gydF4y2Ba属是有趣的，以便在该属内产生关于免疫蛋白质和交叉抗性的新颖知识。gydF4y2Ba

3.2。酶和物理化学治疗对肠素S37活性的影响gydF4y2Ba

慢性疲劳综合症的gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaS37显示针对目标菌株的活动gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2BaJH2-2,gydF4y2Ba磅短gydF4y2BaF1.114，gydF4y2Ba磅短gydF4y2BaF145,gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba缝隙,gydF4y2BaL. Innocua.gydF4y2BaF即使在使用脂肪酶(1毫克gydF4y2Ba)和溶菌酶(2毫克gydF4y2Ba)．脂肪酶和溶菌酶处理的抑菌活性与未处理上清作为阳性对照的抑菌活性相似。然而，用蛋白水解酶处理，如gydF4y2Ba-胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶和蛋白酶K导致细菌素活性丧失gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．经加热处理后，enterocin S37抗菌活性的稳定性保持不变(gydF4y2BaC为1 h和gydF4y2BapH值从4到9(见表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．尝试减少肠素S37的推定二硫键桥（S）gydF4y2Ba二硫苏糖醇gydF4y2Ba（西格玛，德国）;由于这种化合物的毒性，即使在低浓度下，该实验也不确定，朝向靶菌株。gydF4y2Ba

3．3．Enterocin S37的纯化gydF4y2Ba

采用硫酸铵沉淀和反相高效液相色谱三步法纯化细菌素。第一阶段采用80%的硫酸铵沉淀，使活性组分浓缩10倍(v/v);随后，有效组分通过两个连续的反相高效液相色谱柱。活性组分(表现出抗菌活性的组分)在60%的含80%乙腈、20% H的洗脱缓冲液中洗脱gydF4y2Ba_2gydF4y2BaO, 0.05% TFA。SDS-PAGE检测各步骤后收集的各活性组分的纯度gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

细菌素的分子量似乎在4到6 kDa之间(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(a))，并将其与SDS-PAGE上观察到的抑制带拟合(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(b))。为此，将非变性条件下迁移得到的电泳凝胶直接镀在接种了0.9%的埃利克软琼脂上gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba1%容积转移的EGDe (v/v)。电泳显示的其他蛋白条带均无抗菌活性。通过培养皿琼脂扩散试验检测纯化过程中获得的各样品的抗菌活性(图)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba(c))gydF4y2Ba

3.4。K.gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba频道调制器gydF4y2Ba

两个KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道激活剂(pinacidil和cromakalim)和抑制剂(glipizide)对生长有不同的影响gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba本研究获得EGDe及其对enterocin S37的细菌素抗性变异。如图所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，联合使用enterocin S37效果最高(5gydF4y2Ba)和pinacidil (10gydF4y2Ba)．鸡蹄S37与Cromakalim组合的影响（10 )和格列吡嗪(10gydF4y2Ba)是不那么重要的gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2BaEGDE抗菌变异。gydF4y2Ba

4.讨论gydF4y2Ba

已知肠球菌在自然界中普遍存在。对于大多数肠球菌种类而言，主要的栖息地是动物和人类的胃肠道，它们可以以高达10的数量找到gydF4y2Ba^8gydF4y2Bacfu/g粪便[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．在动物源性食物(牛奶、奶酪和发酵香肠)、蔬菜和植物材料中发现肠球菌[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．此外，对于这些天然栖息地，它们涉及医院感染[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

据报道，许多肠球菌能产生被称为肠球菌的细菌素，这些细菌素种类繁多，在其结构上有很大的多样性，并对许多微生物有活性，特别是食源性病原体和对环境和医学有益的微生物[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．Theppangna等[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba研究了一组139株gydF4y2Ba大肠都有效gydF4y2Ba和gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2Ba他们得出的结论是51%的分离菌能产生肠毒素46%的分离菌能产生一种以上的肠毒素。产生肠毒素的菌株携带至少一种已知肠毒素的结构基因编码(gydF4y2Baenta.gydF4y2Ba，gydF4y2Baentp.gydF4y2Ba，gydF4y2Baentl50ab.gydF4y2Ba和gydF4y2BacylLgydF4y2Ba) [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．其他研究指出gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2Ba作为肠毒素的来源[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba］．总之，这些研究表明肠球菌菌株的分布和重要性。应该指出的是，到目前为止，大多数肠道陶瓷都研究了革兰阴性和革兰氏阳性细菌的活动[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．我们对小肠球菌素S37进行了分离和鉴定gydF4y2Ba粪大肠gydF4y2Ba最近从鸡粪中分离出来[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．肠霉素S37似乎有趣的是对食物传播病原体的活动有趣gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2BaEGDE和随便反对gydF4y2Ba空肠弯曲杆菌gydF4y2Banctc 11168（表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．然而,反gydF4y2Ba弯曲杆菌gydF4y2Ba活性仍然不稳定，不如最近在文献中观察到的其他细菌素的活性重要[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．从这项研究中收集的数据让我们想到enterocin S37可能是IIa类细菌素，因为(i)这个肽具有抗gydF4y2Ba李斯特菌gydF4y2Ba， (ii)具有分子量gydF4y2Ba10 kDa， (iii)对蛋白酶敏感，(iv)在不同pH和高温下稳定。gydF4y2Ba

纯化结果表明，enterocin S37具有高度疏水性。活动增加了几倍(从400gydF4y2Ba到51200年gydF4y2Ba)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)，专项活动增加，达到1557.17gydF4y2Ba．这种现象以前主要描述为去除抑制性化合物的结果[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba］．部分纯化的enterocin S37的光谱与CFS的光谱相同，但具有更强的活性(数据未显示)。gydF4y2Ba

这是第一次，KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba本研究揭示了肠蹄活性的通道调节剂。为此目的，我们已经使用了两kgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道激活剂(cromakalim和pinacidil)和1 KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道阻止器（粘锥胶）。Cromakalim显示在ATP敏感的钾通道上起作用，导致膜超极化，将膜电位从阈值中拉出[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．在药理学领域，有报道使用克罗马卡林治疗高血压[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．Pinacidil是一种氰胍类药物，可打开atp敏感的钾通道[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．最后，描述了粘合剂通过部分阻挡k来影响细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba频道，减少kgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba导致膜的去极化，从而导致CagydF4y2Ba^++gydF4y2Ba离子通过电压敏感的CA流入gydF4y2Ba^++gydF4y2Ba导致细胞内钙离子浓度升高gydF4y2Ba^++gydF4y2Ba离子(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．此外，Cromakalim和Lipizide对敏感和抗性生长的影响gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba对菌株进行了研究，结果显示菌株整体较弱。因此，野生型(敏感表型)对克罗马卡林和格列吡嗪的抑制率估计为14.29%gydF4y2Ba17.14%和1.38gydF4y2Ba4.08虽然抑制突变菌株（抗性表型）评价4.46％gydF4y2Ba8.93%和3.53gydF4y2Ba1.06。Pinacidil对野生型有较高的抑制活性(86.79%)gydF4y2Ba1.78）有趣的是不在突变菌株上（19.64％）gydF4y2Ba4.02)。gydF4y2Ba

肠球菌素S37与不同KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道调节器提示肠球菌素S37在细胞内钾的消耗gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba水平，由一个动作上gydF4y2Ba而不是KgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba频道。这些数据与以前用nisin A获得的数据一致，nisin A的抗菌活性与gydF4y2Ba所有细胞内钾的损失gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和ATP [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．至于enterocin As -48和enterocin P [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，肠霉素S37肯定是对细胞内k的不受控制的渗透gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba影响敏感细胞的生长。该抗性变体能够生长，但受肠球菌素S37/K组合的轻微影响gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba除了Pinacidil外，抑制作用达到49.79％gydF4y2Ba3.36，而不是23.84%gydF4y2Ba24.11%和7.73gydF4y2Ba7.07分别加入Cromakalim和粘锥蛋白酶（图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

还建立了许多细菌素，包括含肠状物，与膜脂质相互作用，导致孔的形成并随后损失细胞内部件，在细胞死亡中产生其导致其产生的[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．膜的脂质组成似乎在细菌素活性的效率中起重要作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．单独使用Enterocin S37不影响细菌素耐药变异株的生长gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2Ba缝隙。然而，联合使用enterocin S37/KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道调制器强烈影响抗性变种的生长。否则，kgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道调节剂增强了肠杆菌S37对敏感应变的抑制活性gydF4y2Bal . monocytogenesgydF4y2BaEGDE，值达到，92.86％gydF4y2Ba5.90和94.29％gydF4y2Ba4.55肠球菌素S37分别与格列吡嗪、品酸酯联用。克罗玛卡林与enterocin S37联合用药的致死率为84.29%gydF4y2Ba2.5抑制敏感菌株的生长;该数据等于单独使用肠核S37获得的84.21％gydF4y2Ba5.87(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．然而，在耐药菌株中，当enterocin S37与pinacidil联合时，其抑制活性较高(49.79%)gydF4y2Ba3.36)，与克罗玛卡林+ enterocin S37联合用药比较(23.84%)gydF4y2Ba7.73)和enterocin S37 +格列吡嗪(24.11%)gydF4y2Ba7.07)(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

肠蹄S37的作用方式可以通过与细胞膜的电位相互作用来触发。正在考虑肠蛋白S37的氨基酸序列的测定。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

CIP：gydF4y2Ba	Institut Pasteur的汇集（巴黎，法国）gydF4y2Ba
DSM:gydF4y2Ba	德国微生物研究所(德国布朗瑞格)gydF4y2Ba
据国家反恐怖主义中心:gydF4y2Ba	国家类型菌株收集(伦敦，英国)。gydF4y2Ba

致谢gydF4y2Ba

作者要感谢Antonio Galvez教授对这篇论文的批判性阅读。Y. Belguesmia是la Région des Pays de la Loire (gydF4y2Bahttp://www.paysdelaloire.fr/gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

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