PR3和MPO在多血管炎肉芽肿病中具有内皮特性的周围骨髓单核细胞的损伤和差异表达

摘要

出身背景．肉芽肿伴多血管炎(GPA)和显微镜下多血管炎(MPA)是呼吸道和肾脏血管炎症为特征的自身免疫介导的疾病。临床观察表明，疾病活动性与血清中某些类型的自身抗体水平(抗中性粒细胞胞浆抗体与胞浆[在GPA中为cANCA]或核周[在MPA中为pAN CA]免疫荧光)密切相关。病理上，这两种疾病的特征是严重的微血管内皮细胞损伤。早期内皮生长细胞(eeoc)已被证明在生理和病理条件下参与新生血管的形成。目标．我们研究的主要目的是:(i)分析eEOC系统的再生活性;(ii)测定在GPA和MPA患者中具有内皮特征的髓系单核细胞中mPR3和MPO的表达。方法．在27 GPA和10 MPA的患者中，再生活性血液来源的eeoc使用培养形成试验进行分析。Flk-1⁺, CD133⁺/ Flk-1⁺, mPR3⁺, Flk-1⁺/ mPR3⁺通过流式细胞仪分析定量骨髓单核细胞。血清血管生成素-1和TNF水平-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组血清白蛋白水平。结果. 我们发现，与健康对照组相比，GPA患者eEOC再生减少，同时血清血管生成素-1水平降低。此外，Flk-1的总数量⁺外周循环中的骨髓单核细胞减少。PR3在总蛋白和Flk-1蛋白中的表达显著升高⁺骨髓单核细胞。MPO的表达在各组之间没有差异。结论．这些数据表明，在GPA患者中，eEOC系统受损，PR3可能在这一过程中发挥作用。

1.导言

肉芽肿伴多血管炎(GPA)和显微镜下多血管炎(MPA)是一种以全身性坏死性血管炎为特征的自身免疫性疾病，主要影响呼吸道和肾脏[1]．组织病理学分析显示，微血管内皮细胞的严重结构改变，分别导致皮肤、关节、呼吸道和肾脏微循环受损。内皮损伤被认为是由充注的中性粒细胞和ANCA与内皮的相互作用引起的，随后内皮从基底膜脱离[2]．许多不同的研究表明，在GPA和MPA中，循环成熟的内皮细胞和内皮微粒的水平都增加了[3.，4]因此，患有GPA和MPA的患者遭受持续的血管损伤，这种损伤可通过免疫抑制治疗加以控制。近年来，微血管修复的新机制已被阐明。所谓的内皮祖细胞（EPCs），本质上是异质性的，最初由Asahara等人于1997年鉴定[5]，已被证明可在生理和病理条件下促进内皮细胞修复[6- - - - - -10]．根据目前EPC生物学的概念，细胞主要有两种群体，早期和晚期内皮生长细胞[11，12]．早期内皮生长细胞(eeoc)也被定义为具有促血管生成特性的髓系(造血)细胞[11]．EEOCS再生和活性已被显示为不同类型的非炎症和炎症血管疾病：ANCA相关血管炎（AAV）的患者显示出循环CD34的数量增加⁺免疫抑制治疗和疾病缓解后的造血祖细胞(HPCs)和内皮祖细胞(EPCs) [13]．最近的一项研究也表明，AAV患者中存在显著且持续的循环EPCs (eeoc)不足。作者得出结论，较低的EPC数字可能反映了血管修复机制受损，并可能导致疾病的反复复发[14]．在GPA和MPA中，针对PR3和MPO的抗体已成为诊断疾病和监测治疗中的疾病活动的重要工具[15]在GPA和一些其他慢性炎症性疾病中观察到膜结合PR3（mPR3）表达水平升高，表明mPR3通过允许与PR3-ANCA相互作用而发挥致病作用[16]．ANCA与靶抗原结合并随后激活中性粒细胞导致过早脱粒和内皮细胞损伤(ANCA-细胞因子序列理论)一直(现在仍在)作为GPA发病机制中的关键事件进行有争议的讨论[17]．最近，骨髓单核细胞也被证明在小血管炎中增加PR3基因转录[4]．此外，急性血管炎患者的高抗pr3浓度已被证明与循环单核细胞中活化的粘附分子表型相关[18]．

因此，我们研究的主要目的是分析GPA和MPA患者的eEOC系统的再生活性，并确定具有内皮特性的骨髓单核细胞中mPR3和MPO的表达。

2.患者和方法

2.1. 病人及血液样本

血样取自25GPa和10MPa患者。表1总结了患者的基线特征1．所有患者均在15个月内在大学医疗中心Göttingen的肾脏学和风湿病系中招募。本地方伦理委员会审查后批准了研究议定书。从每个科目获得符合赫尔辛基宣言和书面知情同意书中概述的原则的调查。所有GPA患者均符合美国风湿病学院以前建立的标准[19在他们的病史中，至少有一次cANCA检测呈阳性。采用有效的伯明翰血管炎评分(BVAS)对疾病活动性进行评分[20]．具有低于或等于7.5mg / d定义的缓解的0个具有低于7.5mg / d的BVA，而活性疾病由BVA≥1。BVA≥8的BVA患者被定义为高度活性，BVA为<8定义低活动。通过临床特征，PanCA检测和肾活组织检查中的活性肾小球肾炎的存在诊断。通过评估临床症状（咯血，紫癜），尿液分析（红细胞浇铸，丙二属）和CRP和/或ESR的测量来评估MPA患者的疾病活动。患者最初通过脉冲环磷酰胺治疗（10-15mg / kg适应肾功能水平），或没有浆术和口服或静脉内皮质类固醇治疗。缓解患者的缓解患者由氮嘌呤，霉酚酸酯，甲氨蝶呤和/或低剂量泼尼松（剂量：≤7.5mg）治疗。一个患有GPA的患者接受leflunomide进行维持治疗。健康，年龄和性别匹配的个人作为对照。此外，将含有19例狼疮红斑（SLE）的19例患者纳入研究，以进行控制测量。 SLE was diagnosed according to the criteria established by the American College of Rheumatology [21]．系统性红斑狼疮疾病活动性指数[22]）。对于研究，每位患者（以及各自的对照）提供了四种血液样品（各自为7.5ml），用于内皮和霉菌细胞研究中使用两（2×7.5ml），使用两种（2×7.5mL）用于执行常规实验室（见生化及血液测试)以及免疫学研究。为了量化肾功能，测量血清肌酐并收集尿液进行蛋白尿[23]．

２.２.流式细胞术

流式细胞术中，使用Histopaque-1077溶液(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)通过密度梯度离心分离单核细胞(MNCs)≈7.5 mL肝素化外周血。首先用以下一种或多种抗体在冰上孵育细胞1小时:兔抗cd133 (ab16518-Abcam, Cambridge, UK)，小鼠抗人VEGFR2 (FAB 357F-R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)，小鼠抗c- kit (3310, alexa flour 488-Cell Signaling, Boston, MA, USA)，小鼠抗mpo (ab11730-Abcam, Cambridge, UK)，小鼠抗pr3 (sc-52716, santa Cruz, CA, USA)，然后分别用pe标记的山羊抗兔Fab (CD133, 111-116-144-Jackson Immunoresearch, Baltimore, PA, USA)、pe标记的山羊抗小鼠Fab (MPO, 11730-500, Abcam, Cambridge, UK)、pe标记的山羊抗小鼠Fab (PR3, 115-116-146-Jackson Immunoresearch, Baltimore, PA, USA)在冰上进行二次培养30分钟。孵育后用PBS-BSA 1% (w/v)洗涤细胞。使用FACScalibur流式细胞仪(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)获取数据，并使用CellQuest软件(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)进行分析。FACScalibur流式细胞仪配备488 nm氩气激光器和635 nm红色二极管激光器。根据制造商的说明，使用未染色和单抗体染色细胞进行FACScalibur的设置。用同型匹配的免疫球蛋白孵育控制染色的特异性。为了量化内皮系的总外周细胞，我们统计了内皮细胞中Flk-1阳性细胞的数量、EPCs的数量、髓系单核细胞群中CD133/Flk-1双阳性细胞的数量[24，25]．

2．3.EPC增殖(菌落形成单位(CFU)测定)分析

按照制造商的方案，使用EndoCult液体培养基试剂盒（加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华StemCell Technologies）进行分析。将MNC重新悬浮在完整的EndoCult培养基中，并以5×10的速度播种⁶纤维结合蛋白涂层组织培养板上的细胞/孔（BD Biosciences，Rockville，MD，USA）。48小时后，用培养基冲洗微孔，收集非粘附细胞。非粘附细胞在10℃时被镀在其现有培养基中⁶细胞/孔在24孔纤维连接蛋白包被的组织培养板中培养3天。只有至少有20个细胞的菌落被认为是CFU-EC菌落，中间有圆形的细胞，外围有细长的细胞。在这一时期之后出现的殖民地数量被计算[12]．至少有两名实验室工作人员评估了CFU-ECs的数量。他们对被调查的患者/对照组的诊断和状态进行盲测。

２.４.免疫荧光

在所有患者中，菌落内细胞的表型得到了更详细的确定。为此，细胞的特征是摄取dii标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL) (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)和结合fitc标记的UE凝集素(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)。细胞首先用10μ基于37℃的G / mL DII-AC-LDL 1小时，后来用2％甲醛固定10分钟，然后在37℃下与UE凝集素孵育1小时。DIL-ACLDL的数量⁺/问题凝集素⁺使用倒置荧光显微镜IX-71（德国汉堡奥林巴斯德国有限责任公司），配备适当的激发和发射滤光片（德国图宾根AHF Analyzentechnik），通过激光扫描显微镜对细胞进行计数。第二个样本为10⁶每个患者的细胞在纤维连接素包被的圆形玻片上培养，并对dili - acldl摄取、UE凝集素结合和PR3表达进行染色(一抗见图)流式细胞术，二抗:驴抗小鼠IgG (NL-637, R&D Systems，威斯巴登，德国)和山羊抗小鼠IgG (Alexa Fluor 647-A21240, Invitrogen，德国)。平均为100 dilacldl⁺/问题凝集素⁺对每个患者/对照组的细胞进行mPR3表达分析。为了分析每个细胞的mPR3表达，采用单细胞激光扫描显微镜。使用IX-71倒置荧光显微镜检查细胞(见上)。使用F-View II ext. Camera (Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Germany)将各自荧光通道的图像记录为单个高分辨率16位b/w图像。每个荧光通道的图像使用CELL-F软件的mfip模块自动合并。dill - acldl的代表性图像⁺/问题凝集素⁺/ PR3⁺采用IX-71荧光显微镜(Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Germany)取细胞。

2．5．酶联免疫吸附试验(ELISA)

购买商业ELISA试验用于评估IL-6（IMMULITE，西门子，德国），TNF-  （德国西门子）、VEGF和SDF-1（美国加州大学，武汉，中国）和血管生成素-1（美国新罕布什尔州塞勒姆阿尔科）血清水平。根据制造商的方案进行ELISA试验。

2.6。免疫印迹分析

健康对照组和GPA患者培养的EPCs (EPC增殖分析（菌落形成单位（CFU）分析）)在裂解缓冲液（1%（v/v）KPO中均化₄/EDTA，5 mM EGTA，10 mMgCl₂, 50毫米β-甘油磷酸，1 嗯，那_3.农村村民₄， 0.5% (v/v) NP₄O, 0.1% (v/v) Brij-35, 0.1% (v/v) PMSF, 0.01% (v/v) Leupeptin, 0.01% (v/v) Pepstatin A，然后置于冰上孵育15分钟。在2.000 rpm离心15分钟后，每100粒重悬μ根据先前公布的方案测量PBS和蛋白质浓度的L[26]．样本羊皮纸书卷(100μL)与400混合μL的甲醇，100μL氯仿，300μL蒸馏水。在14000 rpm离心1分钟后收集蛋白并重悬于400μ在甲醇中重复离心和再悬浮一次，第三次离心后，将颗粒最终再悬浮在SDS样品缓冲液中。在12.5%三甘油酯凝胶中电泳分离等量的蛋白质（通过消光分析测量，随后通过F-肌动蛋白免疫印迹法确认）（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）并转移至免疫印迹膜（美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市BIO-RAD市PVDF膜-162-0177）中。用含TBS-T的脱脂奶粉（5%w/v）封闭后，用一抗鼠抗PR3（sc-52716-Santa Cruz，CA，USA）孵育膜在4°C下过夜。用TBS-T洗涤后，用马红色过氧化物酶结合二级抗体（多克隆兔抗鼠-P0161，1）孵育膜 : 2000年，达科，加利福尼亚州卡彭特里亚，美国），室温下60分钟。清洗膜，并使用化学发光系统（ECL Plus Western Blotting检测系统-RPN2132，GE Healthcare，Amersham，Piscataway，NJ，USA）检测蛋白质。

2.7.生化和血液学试验

根据机构指南，生化和血液学测试在大学医院Göttingen的中心实验室进行。

2.8。统计分析

所有值表示为平均值±SEM。通过Mann-Whitney比较了两个人口的手段测试。相关分析采用Spearman秩相关检验。两组之间的差异被认为在，为正相关在0.5到0.8之间。

3.结果

３．１．具有内皮特性的循环骨髓单核细胞和循环eeoc

与对照组相比，两组患者(GPA和MPA)循环中显示内皮特征的骨髓单核细胞百分比均显著降低(GPA:%对%，MPA:%对%，[占跨国公司总数的%])。相比之下，三组之间循环早期内皮生长细胞(eeoc)的数量没有差异(图)1）．所有表达CD133和Flk-1的骨髓单核细胞被定义为循环eeoc [27]．

3.2.循环EEOC的增殖活性（CFU内皮细胞数量）

先前的研究[27]以及其他人进行的分析[28研究表明，以血管损伤为特征的情况与内皮祖细胞再生受损有关。因此，为了评估eEOC系统的再生潜力，进行了菌落形成单元(CFU)测定。研究清楚地显示，与健康对照组相比，两组(GPA和MPA患者)的蜂群数量都较低(和相对，和)(图2）．在GPA中，在BVAS反射的疾病中形成的培养物和临床活性之间没有线性相关性。另外，菌落形成也与CRP，IL-6或BVA（数据未示出）不相关。最后，进行Spearman的等级相关试验，以分析EEOCs的抑制菌落与肾功能相关。我们的分析没有显示两个参数之间的线性相关性。

３．３．血管生成素-1的血清水平

血管生成素-1 (Angiopoietin-1)是内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie-2的配体。在成人血管系统中，Ang-1/Tie-2信号被认为调节维持血管静止和促进血管生成[29]．VEGF(165)/Angiopoietin-1联合激活已显示内皮祖细胞介导的治疗性新生血管增强[30]．由于我们的结果表明具有内皮特性的骨髓单核细胞和eeoc显著受损，我们测量了Angiopoietin-1的血清水平，并与健康对照组进行了比较。与对照组相比，GPA患者的血清血管生成素-1水平实际上较低(1542±315 pg/mL vs 689±224 pg/mL，）．血清血管内皮生长因子(VEGF)和血清基质细胞源性因子-1 (SDF-1)无差异。

3．4．内皮系外周细胞PR3和MPO的表达

因为我们的结果显示(i) Flk-1的百分比较低⁺(ii)抑制eEOC再生，(iii)抑制内皮细胞刺激血管生成素-1，我们试图测定mPR3和MPO在总和Flk-1中的表达⁺用流式细胞术测定骨髓单核细胞的数量。在两个细胞群中，mPR3的百分比⁺细胞的GPA高于健康对照组(%对%，和%对%，).MPA中的情况并非如此（图3.和4）．相比之下，三组之间的MPO表达没有区别。为了进一步证实MPR3表达的数据，通过Western印迹分析分析来自健康对照和GPA患者的培养的EEOC和G​​PA患者的膜结合的MPR3。除了五种分析的GPA患者中，所有的GPA患者都显示出显着的MPR3表达，而健康对照是MPR3阴性（图5）．图中还显示了GPA患者外周血内皮祖细胞的代表性免疫荧光图像和激光扫描图。流式细胞术数据显示，只有少数eeoc表达mPR3(图)5）．最后对系统性红斑狼疮患者进行分析。在这些患者中，mPR3的表达并不高于健康对照组。

3．5．血清肿瘤坏死因子-水平  （肿瘤坏死因子-）

在中性粒细胞粘附过程中，PR3的膜表达增加已被证明发生在TNF后-  刺激[31]．因此，我们试图测定血清TNF-与对照组相比，患者的GPA水平。GPA患者的TNF-平均值明显更高水平(13±1 vs 8.9±0.5 pg/mL，）．血清TNF-之间无线性相关性  以及骨髓单核细胞上CFU ECs、mPR3和mPR3/Flk-1的表达，以及TNF-和CD133⁺/ Flk-1⁺细胞。

4.讨论

目前研究的目的是分析GPA和MPA患者的eEOC系统的再生活性，并确定具有内皮特性的髓单核细胞中mPR3和MPO的表达。我们发现流通的Flk-1数量较低⁺外周循环早期内皮生长细胞（CD133）百分比无任何差异的骨髓单核细胞⁺/ Flk-1⁺骨髓细胞细胞）。此外，GPA和MPa患者显示出血液衍生EEOC的增殖活性较低（培养 - CFU测定中形成的含有含量的菌落）。这符合Závada和同事的观察结果[14在anca相关血管炎(AAV)患者中，CFU-ECs(菌落形成单位内皮细胞)显著降低。Flk-1的比例较低⁺而骨髓单核细胞的CD133水平⁺/ Flk-1⁺骨髓单核细胞可能是由内皮细胞分化的一般缺陷引起的，这可能不仅仅涉及新创在骨髓中产生eeoc，并进一步分化循环CD133⁺/ Flk-1⁺细胞转化为Flk-1⁺myelomonocytic细胞。早期研究表明，eEOC菌落形成减少与肾功能之间没有相关性[28]．这种相互矛盾的数据可能是由于患者的特点，因为大多数纳入我们研究的患者并没有严重的肾功能不全。因为总CD133⁺GPA患者的细胞高于对照组，这是CD133的正常百分比⁺/ Flk-1⁺GPA中的细胞也可能来自于补偿骨髓/血液CD133增加⁺细胞增殖：已知在造血干细胞/祖细胞（HSC/HPC）中表达Prominin 1（CD133）[32- - - - - -34]．虽然我们没有找到更高百分比的CD133⁺/ c - kit⁺细胞（最重要的代表不成熟的与对照组(数据未显示)相比，GPA中CD133增加⁺细胞能反映AAV中更分化的HPCs的动员。增加CD34的动员⁺事实上，造血祖细胞已经显示在缓解缓解后在AAV中发生[13]．

eEOC系统的再生和分化受损，伴随着血液中刺激血管生成素-1的内皮细胞水平降低。据我们所知，这是首个显示GPA患者血清血管生成素-1下降的研究，可能反映了新生血管受损。GPA抑制内皮系统的机制仍存在争议。循环血管生成素-2 (Ang-2)浓度已被证明在活动期SLE患者中升高，而血管生成素-1 (Ang-1)则降低[35]．ang1和ang2这两种介质在血管修复过程中既有激动作用又有拮抗作用。Ang-1刺激内皮细胞增殖、分化和迁移[36]，而Ang-2已被证明在某些情况下破坏血管保护的Ang1/Tie2信号[35]．

另一种可能促进GPA内皮功能障碍的因子是TNF-．肿瘤坏死因子-通过多种机制介导内皮细胞凋亡，包括caspase-3和-8的激活，以及PKCbeta的刺激(2)[37- - - - - -40].GPA患者的平均血清TNF水平较高-这表明它可能参与内皮细胞的改变。然而,肿瘤坏死因子-  与培养中形成的内皮集落数量或CD133的百分比均无相关性⁺/ Flk-1⁺血液中的细胞。因此，血清TNF升高的意义-  GPA水平仍然是推测性的-  英夫利昔单抗等阻断剂已用于治疗难治性GPA[41]研究表明，用TNF预处理细胞-诱导PR3膜表达和分泌[31]．

总的来说，不能完全排除治疗GPA患者的不同免疫调节剂对内皮细胞增殖/再生的影响。然而，有报道称环磷酰胺作为EPC动员剂[42]，而类固醇已被证实可显著增加循环内皮祖细胞[43]．

我们对骨髓单核细胞特别感兴趣的原因是这些细胞已被证明在小血管血管炎中增加PR3基因转录[4]此外，在早期的研究中已经分析了骨髓单核细胞中PR3的细胞内转运[44]另一方面，成熟的骨髓单核细胞和早期内皮生长细胞这两种细胞类型最有可能来源于骨髓中的多能造血干细胞，它们都以促血管生成的方式作用于成熟的内皮细胞[45，46]．到目前为止，尚未在培养的成熟内皮细胞中检测到膜结合PR3。据我们所知，这是首次揭示mPR3在Flk-1中表达的实验证据⁺血源性骨髓单核细胞。我们发现，与健康对照组、MPA和SLE患者相比，GPA患者的mPR3抗体结合率更高。此外，eEOC质膜制剂的免疫印迹分析证实mPR3由细胞表达。相比之下，MPA患者的perc没有表现出增加mPR3的凹痕⁺四组间细胞和MPO表达也无差异。然而需要指出的是，PR3表达的增加可能部分是由于GPA中髓单核细胞的凋亡，因为PR3已被证明在中性粒细胞凋亡过程中外化[47]．

这些发现在机械上可能的相关性是高度推测的。在中性粒细胞中表达的膜结合PR3 (mPR3)被抗中性粒细胞胞浆抗体靶向[2]．这种相互作用引起了中性粒细胞的脱颗粒，从而引起微血管的改变[48- - - - - -50]．有趣的是，GPA中PR3膜表达的增加通常在广泛性疾病状态中发现，而局部性GPA与中性粒细胞中mPR3上调无关[44]．除了介导这些作用外，mPR3也被证明参与了凋亡事件。Pendergraft和他的同事发现，mPR3通过直接切割p21(一种主要的细胞周期抑制剂)的机制诱导内皮细胞凋亡[51]．较早的一项研究报告了可比数据[52]，用蛋白酶3和弹性蛋白酶诱导(牛)内皮细胞凋亡。

其他研究人员也观察到GPA(和MPA)患者的eEOC再生受损[14，结合内皮细胞中与PR3结合的抗体明显增加，可能表明蛋白酶3在介导内皮型细胞抑制中的病理生理作用。

总之，在这项研究中，我们清楚地表明(i) eEOC系统在GPA中的损伤，其特征是内皮细胞集落形成的抑制，外周血循环中具有内皮特性的骨髓单核细胞的百分比较低。血管内皮损伤的部分原因可能是血液中血管生成素-1水平的降低。由于mPR3在总数中以及在Flk-1中被发现的百分比较高⁺骨髓单核细胞，这种抗原可能作为肿瘤诱导的GPA内皮细胞功能障碍的靶点。

作者的贡献

两位作者对这项研究贡献相同。

致谢

这些研究得到了海德雷希·冯·西博尔德方案(sp - 1560300)。作者声明他们没有任何利益冲突。

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