血液样本来自25 GPA,从10 MPA患者。患者的基线特征归纳在表格 1。所有患者肾脏学和哥廷根大学风湿病学医学中心的15个月。研究协议是由当地伦理委员会审查后批准。调查符合赫尔辛基宣言中概述的原则和书面知情同意了从每个主题。所有GPA患者符合先前建立的标准由美国风湿病学院( 19),阳性cANCA至少一次在他们的历史。使用验证伯明翰血管炎疾病活动得分得分(英国) 20.]。bva 0强的松的剂量低于或等于7.5 mg / d缓解而定义的一个活跃的疾病定义bva≥1。bva的患者≥8”指的是高度活跃的,定义的< 8 bva低活动。MPA被临床特点诊断,检测pANCA,存在活跃的肾小球肾炎肾活检。MPA患者的疾病活动被评估评估临床症状(咳血,紫癜)、尿液分析(红细胞投,棘细胞)和c反应蛋白和/或ESR测量。患者最初被脉冲环磷酰胺治疗(10 - 15毫克/公斤适应肾功能水平)和口服或静脉注射糖皮质激素有或没有血浆置换。患者在缓解期治疗通过咪唑硫嘌呤,霉酚酸酯、甲氨蝶呤和/或小剂量强的松(剂量:≤7.5毫克)。一个病人与GPA收到leflunomide维持治疗。健康,年龄和准确性个人担任控制。此外,总数的19例系统性红斑狼疮(SLE)患者纳入研究为了执行控制测量。 SLE was diagnosed according to the criteria established by the American College of Rheumatology [ 21]。在系统性红斑狼疮活动评估咽部(系统性红斑狼疮疾病活动指数( 22])。的研究中,每个病人(和相应的控制)提供四个血液样本(7.5毫升),从这两个(2×7.5毫升)被内皮和myelomonocytic细胞研究和两个(2×7.5毫升)被用于执行常规实验室(见 生物化学和血液测试)以及免疫学研究。quantifiying肾功能,serumcreatinin测量和蛋白尿(尿收集 23]。

进行流式细胞术,单核细胞(跨国公司)是由密度梯度离心法分离使用histopaque - 1077解决方案(σ诊断,圣路易斯,密苏里州) ≈7、5毫升的肝素化外周血。细胞主要是孵化1小时的冰与一个或多个以下抗体:兔子anti-CD133 (ab16518-Abcam,剑桥,英国),鼠标反VEGFR2(工厂357 f-r&d系统,明尼阿波利斯,美国),鼠标anti-c-Kit(488 - 3310年,alexa面粉细胞信号,波士顿,MA,美国),鼠标anti-MPO (ab11730-Abcam,剑桥,英国),鼠标anti-PR3 (sc - 52716 -圣克鲁斯、钙、美国),其次是二次孵化与PE-conjugated goat-anti-rabbit工厂(CD133 111 - 116 - 144 -杰克逊Immunoresearch,巴尔的摩,PA,美国),PE-conjugated山羊anti-mouse (Abcam MPO, 11730 - 500年,剑桥,英国),PE-conjugated山羊anti-mouse (PR3, 115 - 116 - 146 -杰克逊Immunoresearch,巴尔的摩,PA,美国)30分钟在冰上,分别。孵化后细胞被洗PBS-BSA 1% (w / v)。数据获得使用FACScalibur血细胞计数器(德国海德堡,正欲)配备了488 nm氩激光和635海里的红色二极管激光器和分析使用CellQuest软件(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)。FACScalibur的设置是根据制造商的说明进行使用无污点的和单抗体染色细胞。特异性染色则由孵化isotype-matched免疫球蛋白。量化的总外围细胞内皮血统,Flk-1阳性细胞的数量,量化内皮祖细胞CD133的数量/ Flk-1 double-positive细胞myelomonocytic内细胞群被数( 24, 25]。

试验是由使用EndoCult液体介质套件(公元前干细胞技术,温哥华,加拿大)/制造商的协议。跨国公司在完成resuspended EndoCult介质和播种5×10⁶细胞/在fibronectin-coated组织培养板(BD生物科学,罗克维尔市,医学博士,美国)。48小时后,井与媒体和不依从细胞收集洗。不依从细胞被镀在他们现有的媒体10⁶细胞/好24好fibronectin-coated板材组织培养三天。只有殖民地至少20个细胞,含有圆形细胞中间和细长的细胞边缘,被视为CFU-EC殖民地。殖民地的数量在这一时期出现数( 12]。至少两名成员的实验室工作人员评估CFU-ECs的数量。他们被调查患者的诊断和状态/控制。

在所有患者中,细胞的表型在殖民地决心更详细。为此,细胞的吸收特征DiI-labeled乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和绑定的FITC-labeled问题凝集素(σ诊断,圣路易斯,密苏里州)。细胞被第一次孵化10 μ在37°C g / mL DiI-ac-LDL 1 h和后用2%甲醛固定10分钟,其次是孵化问题凝集素在37°C 1 h。Dil-acLDL的数量⁺/问题凝集素⁺细胞是由激光扫描显微镜计数用倒置荧光显微镜ix - 71(奥林巴斯德国GmbH,汉堡,德国)配备适当的激发和发射过滤器(AHF Analysentechnik Tuebingen,德国)。第二个示例10⁶每个病人的细胞培养在fibronectin-coated圆形玻璃底部幻灯片和彩色吸Dil-acLDL问题凝集素结合,PR3表达式(主要抗体 流式细胞术二次抗体:驴anti-mouse免疫球蛋白(nl - 637、研发系统、威斯巴登、德国)和山羊anti-mouse (647 - a21240 Alexa萤石、表达载体、德国))。平均100 Dil-acLDL⁺/问题凝集素⁺每个病人细胞mPR3表达式/控制进行了分析。为了分析mPR3表达每个细胞,单个细胞激光扫描显微镜。用倒置荧光显微镜检查细胞ix - 71(见上图)。各自的荧光通道的图像被记录为单一使用一个高分辨率的16位b / w图像F-View II ext。相机(奥林巴斯德国GmbH,汉堡,德国)。每一个荧光通道的图像自动合并使用的MFIP-module CELL-F软件。代表性的图片Dil-acLDL⁺/问题凝集素⁺/ PR3⁺ix - 71细胞的细胞被使用荧光显微镜(奥林巴斯德国GmbH,汉堡,德国)。

商业评估ELISA测试购买的il - 6 (IMMULITE、西门子、德国)、肿瘤坏死因子- α (西门子、德国),VEGF和SDF-1 (USCN,武汉,中国),而(美国Alpco,萨勒姆,NH)血清水平。ELISA测试是根据制造商的协议执行。

从健康对照组和GPA患者培养内皮祖细胞( 分析EPC增殖(菌落(CFU)测定))在均质裂解缓冲(1% (v / v) KPO₄/ EDTA、5毫米EGTA MgCl 10毫米₂,50毫米 βNa -glycerolphosphate 1毫米₃农村村民₄,0.5% (v / v) NP₄啊,0.1% (v / v) Brij-35, 0.1% (v / v) PMSF, 0.01% (v / v)亮抑酶肽,0.01% (v / v)抑肽素),其次是15分钟的孵化在冰上。离心后15分钟2.000 rpm,球团矿在100年resuspended μL (PBS和蛋白质浓度测定根据以前公布的协议( 26]。样本羊皮纸书卷(100 μ与400年L)涨跌互现 μL甲醇,100 μ氯仿的L, 300 μL destilled水。离心后收集1分钟14.000 rpm蛋白质,400年resuspended μL的甲醇。离心分离和再悬浮在甲醇重复一次,第三个离心球后终于在SDS resuspended样本缓冲区。等量的蛋白质(衡量灭绝分析,后来证实了f -肌动蛋白免疫印迹)在12.5% electrophoretically分离Trisglyceride凝胶(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和转移到免疫印迹膜(PVDF膜- 162 - 0177,BIO-RAD大力神,CA,美国)。阻塞后TBS-T-containing脱脂奶粉5% (w / v),膜是初级抗体孵育鼠标anti-PR3 (sc - 52716 -圣克鲁斯、钙、美国)一夜之间在4°C。与TBS-T洗涤后,膜被孵化与horse-reddish peroxidase-conjugated二级抗体(多克隆rabbit-anti-mouse-P0161 1: 2000年,DAKO, Carpenteria、钙、美国)在室温下为60分钟。膜清洗和蛋白质是使用化学发光检测系统(ECL +免疫印迹检测System-RPN2132,通用电气医疗集团,Amersham,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。

生物化学和血液测试是执行在哥廷根大学医院的中心实验室,根据机构的指导方针。

所有的值表示为±SEM。两个种群的方法被Mann-Whitney相比 U 测试。相关分析是由斯皮尔曼等级相关的测试。两组之间的差异被认为是重要的 P < 0.05 ,正相关关系被认为是 r 在0.5 - -0.8之间。

循环myelomonocytic细胞的百分比显示内皮特征两组中均有显著降低的患者(平均绩点和MPA)相对于控件(平均绩点: 0.19 ± 0.08 %与 0.52 ± 0.09 %, P = 0.015 MPA: 0.08 ± 0.082 %与 0.52 ± 0.09 %, P = 0.002 (跨国公司)总额的%)。相比之下,没有数字的差异循环早期内皮细胞产物(eeoc)三组之间(图 1)。所有myelomonocytic细胞表达CD133和Flk-1被定义为循环平等就业机会委员会( 27]。

先前的研究[ 27和分析由他人 28)表明,环境特点是血管损伤与受损的内皮祖细胞再生。因此,为了评估再生潜力的平等就业机会委员会系统,克隆形成单位(CFU)进行分析。清楚显示,两组低数量的殖民地,GPA和MPA患者与健康对照组相比( 24.3 ± 5.1 和 22.5 ± 4.3 与 45.9 ± 6.8 , P = 0.0027 和 P = 0.01 )(图 2)。GPA,没有线性相关性的殖民地形成的文化和该病的临床活动所反映的英国。此外,集落形成了还不是与CRP、il - 6、bva(数据没有显示)。最后,斯皮尔曼等级相关的测试执行,以分析是否抑制由平等就业机会委员会与肾功能集落形成。我们的分析并没有显示这两个参数之间的线性相关。

而endothelium-specific (Ang-1)是一种配体受体酪氨酸激酶Tie-2。在成人血管,Ang-1 / Tie-2信号被认为是调节血管静止的维护和促进血管生成( 29日]。内皮祖细胞治疗新血管形成是增强了VEGF(165) /相结合而激活( 30.]。从我们的研究结果建议的重要障碍myelomonocytic与内皮细胞属性,平等就业机会委员会,而血清测定健康对照组相比。患者血清而低水平实际上是GPA与控件(1542±315 pg / mL和689±224 pg / mL, P = 0.034 )。没有差异,血清血管内皮生长因子(VEGF)或血清基质细胞衍生因子- 1 (SDF-1)。

因为我们的研究结果显示,(我)降低Flk-1的百分比⁺myelomonocytic细胞,(ii)抑郁平等就业机会委员会再生,和(3)抑制内皮细胞的刺激而,我们试图确定mPR3 MPO表达总以及Flk-1⁺通过流式细胞术myelomonocytic细胞群。在这两种细胞群,mPR3的百分比⁺细胞在绩点高于健康对照组( 10 ± 3所示。1 %与 0.38 ± 0.14 %, P = 0.04 和 0.33 ± 0.05 %与 0.13 ± 0.03 %, P = 0.0 29日 )。这不是MPA(数据的情况 3和 4)。相比之下,MPO表达式三组之间没有差别。为了进一步确认数据mPR3表达,培养平等就业机会委员会从健康对照组和GPA患者分析膜结合mPR3通过免疫印迹分析。五个人中只有一个分析GPA病人显示重大mPR3表达式,而健康对照组mPR3负(图 5)。相同的图还显示了代表免疫荧光图像和激光扫描块外围血液从GPA患者内皮祖细胞。流仪所显示的数据,只有少数的平等就业机会委员会表达mPR3显示(图 5)。最后,分析了系统性红斑狼疮病人。在这些患者中,mPR3表达并不高于健康对照组。

增加膜的表达在中性粒细胞粘附PR3已被证明发生在TNF - α 刺激( 31日]。因此,我们试图确定血清TNF - α 水平GPA的病人比控制。GPA病人显示实际上更高意味着TNF - α 水平(13±1和8.9±0.5 pg / mL, P = 0.04 )。没有发现血清TNF -线性相关性 α CFU-ECs、mPR3 mPR3 / Flk-1表情myelomonocytic细胞,以及肿瘤坏死因子- α 和CD133⁺/ Flk-1⁺细胞。