耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在México的手工奶酪中

摘要

牛奶和乳制品经常与葡萄球菌食物中毒有关，受污染的原料奶也经常涉及。研究的目的是确定甲氧西林耐药的发生情况金黄色葡萄球菌（MRSA）在墨西哥生产的生牛奶奶酪中。筛选了共有78个未腐败的牛奶奶酪样品金黄色葡萄球菌．分离株鉴定为金黄色葡萄球菌基于形态学、革兰氏染色、过氧化氢酶试验、凝固酶试验和甘露醇盐琼脂发酵。对分离株进行生物分型，使用纸片扩散法分析对甲氧西林的耐药性，以及葡萄球菌肠毒素A（SEA）生产过程通过斑点杂交分析进行检测。在本研究分析的78份未经高温消毒的奶酪样品中，有44份奶酪检测结果呈阳性金黄色葡萄球菌；然而，观察到不同类型奶酪之间存在差异污染，adobero奶酪的污染风险较高（12,95%CI 1.75至94.20； )．在本研究中，甲氧西林耐药的频率金黄色葡萄球菌（MRSA）为18.1%（8/44），肠毒素A产生菌为18.1%（8/44）。按生物型分类，MRSA仅属于人类ecovar生物型（2/8，25%）和D生物型（4/8，50%）。金黄色葡萄球菌肠毒素A的生产者分布在特定的非宿主生物型中。

1.导言

葡萄球菌食物中毒(SFP)是世界上最常见的食源性疾病之一，主要由食用含有葡萄球菌肠毒素(SEs)的食物引起金黄色葡萄球菌［1］.金黄色葡萄球菌在环境中无处不在，可以在空气、水、人类和动物中找到[2］.牛奶和奶制品经常与葡萄球菌食物中毒有关，而受污染的生牛奶也经常涉及[3.］.能力金黄色葡萄球菌在广泛的条件下生长和生产SE是明显的，这些食物中涉及葡萄球菌食物中毒的各种食物[4].事实上，牛奶是一种很好的营养素金黄色葡萄球菌乳制品是已知的中毒来源[3.］.此外，已经描述了这种微生物在人类处理，水，挤奶设备和环境中发现，被认为是污染的重要来源[5］.新鲜奶酪是由全脂牛奶凝乳或低脂牛奶凝乳通过酪蛋白与凝乳酶凝结而成，在许多情况下，无需热处理[6］.很多奶酪都是在墨西哥制造的，包括panela, fresco, ranchero, oaxaca, asadero, mozzarella, morral, adobero和cottage。fresco是一种软的、新鲜的、未经压榨的、未成熟的奶酪，是通过生牛奶的酶凝而得到的。要求是乳清干酪，在85 ~ 90℃的温度下加热得到，酶凝得到上清液，收集新的凝固馏分，自由排干。瓦哈卡奶酪是一种来自墨西哥的新鲜意大利面“filata”奶酪，由生牛奶制成，牛奶中的微生物使其自然酸化。Cotija奶酪是一种墨西哥手工制作的产品，由生牛奶制成，其成熟过程是自发的，而且可能受到环境条件的影响。Adobero是cotija奶酪的一种，唯一不同的是在奶酪的表面，这是辣的。墨西哥的许多新鲜奶酪生产商使用未经巴氏消毒的(生)牛奶，因为他们相信生牛奶的原生菌群会给最终产品带来宜人的香气和风味。大部分奶酪消费者也更喜欢用生奶制成的奶酪[7].然而，已知生奶产品会污染金黄色葡萄球菌．甚至已经描述过，奶酪制造商携带肠毒素生产金黄色葡萄球菌他们的鼻子或手被认为是身体接触或通过呼吸道分泌物引起的食物污染的主要来源[8].本研究的目的是确定耐甲氧西林的发生率金黄色葡萄球菌(MRSA)。并对分离菌株的肠毒性进行了研究。

2。材料和方法

2016年1月至3月期间，我们从墨西哥格雷罗州奇尔潘辛戈三个地区的街头小贩和当地市场收集了78份未经巴氏消毒的牛奶奶酪样品:旧金山、洛杉矶和卡米诺斯。78份样品包括新鲜奶酪(15份)、科提亚奶酪(15份)、阿德贝罗奶酪(16份)、瓦哈卡奶酪(16份)和索索奶酪(16份)。

所有干酪样品均准备进行定量分析金黄色葡萄球菌通过均化25g奶酪和225ml 0.8％盐溶液1分钟。使用无菌0.8％盐溶液制备额外的10倍稀释液。在补充蛋黄碲酸盐乳液（生物氧化蛋白）的Baird-Parker琼脂上，在0.1ml的体积下涂布合适的稀释液，并在37℃下在有氧条件下孵育。孵育24小时后，计算典型的菌落（黑色，有光泽，带有或没有不透明区的清晰区域的凸形殖民地）。奶酪中的检测限是100 cfu / g。如果存在，从每个样品中选择5个蛋黄反应阳性菌落以进一步识别[9]。所有可疑菌落均在第二种培养基（即甘露醇盐琼脂（Bioxon））上扩散。分离株鉴定为金黄色葡萄球菌根据它们的菌落形态(黄色菌落和周围的甘露醇盐琼脂中的黄色培养基)、碲酸盐还原、卵磷脂酶活性和甘露醇发酵以及它们凝结人血浆的能力(试管凝固酶试验)[10]。如果至少分离到一个菌落形成单位，则样本被归类为阳性。在具有多个菌落形成单位的样本中，只有一个菌落满足金黄色葡萄球菌(凝固酶阳性和甘露醇发酵葡萄球菌，碲酸盐还原阳性)。所有44个分离株按照Devriese在1984年描述的方法进行生物分型[11］.该方法包括四种表型试验:葡萄激酶(K)的产生，β-溶血素(β)牛血浆凝固（BPC）和结晶紫琼脂生长（CV）（表1)．结合测试结果产生四种宿主特异性生物型(ecovars)，即人类、家禽、牛和绵羊，以及五种非宿主特异性生物型(NHS生物型)，分别以测试结果命名:K -β+CV:C（生物型A），K−β+ Cv：a（Biotype B），K +β−CV: A(生物型C)， K +β+ Cv：A（Biotype D）和K -β− CV:C（生物型E）。根据临床实验室标准研究所指南，采用纸片扩散法在Mueller–Hinton琼脂（oxoid）上对分离株进行甲氧西林耐药性测试。测试的抗菌剂为头孢西丁（30 μg /磁盘)。金黄色葡萄球菌ATCC 25923是每次试验的对照菌株[12］.

肠毒素A的测定是在实验室进行的。简言之，24 h文化金黄色葡萄球菌(1 × 10⁹CFU/mL)，在37℃下培养，在含有5 mL BHI(脑心灌注)培养液的试管中，8000 × g离心20分钟，从细胞中分离。对于哪个样本，6μ在5%脱脂牛奶中封闭1小时后，将1 L上清液置于硝化纤维素膜（美国圣克鲁斯生物技术公司）中 h、 将印迹在4°C下与anti-seA（马萨诸塞州剑桥市Abcam，稀释1 : 然后在TBS-T（Tris缓冲盐水，0.1%吐温20）（20 mM-Tris，pH值7.5.150 mM NaCl 0.1%吐温20），孵育1小时 在室温下，用HRP（辣根过氧化物酶）结合抗小鼠IgG（马萨诸塞州剑桥市Abcam，稀释1:1000）进行h，并在用TMB底物（3,3′，5,5′-四甲基联苯胺）进行信号检测之前再次清洗（美国圣克鲁斯生物技术公司）1分钟后，观察到染色斑点为膜上的紫色斑点，证实产生肠毒素A。

一种奶酪作为风险因素金黄色葡萄球菌采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验(STATA V.12 for Windows)对污染进行分析。用logistic回归分析单变量模型中显著的变量，以确定独立的危险因素。一个值<0.05认为有统计学意义。OR值大于1被认为是危险因素。每一组都与分离株较少的组(瓦哈卡干酪组)进行比较。

3.结果和讨论

3.1。发生金黄色葡萄球菌在手工奶酪

在这项研究中分析的78份未经巴氏消毒的奶酪样品中，44份奶酪对金黄色葡萄球菌；然而，观察到不同类型奶酪之间存在差异污染，adobero奶酪的污染风险较高（12,95%CI 1.75至94.20； ），cotija奶酪(8.25,95%置信区间1.32至56.17; ），壁画奶酪（8.25,95%可信区间1.32~56.17； ）（表2)．

发生金黄色葡萄球菌在本研究中占56.4%，高于土耳其的研究(12.5%)[13]及伊朗(16%)[10]; 与意大利和塞尔维亚的研究相比，这是一个低频率，报告频率为80%[14，15］.这项研究中细菌的高频率，以及其他研究与之前的一项研究一致[16]，表明微生物可以在人工生产的不同阶段进入手工奶酪制作过程，定植的奶酪制造商可能是微生物的来源金黄色葡萄球菌，以及在意大利的研究[14]及波兰[17在报告中，他们描述了来自不同地区和年份的多个奶牛场的样本中存在许多菌株，突出了病毒的传播金黄色葡萄球菌在小规模的奶酪生产工厂。本研究获得的频率数据非常重要，因为目前只有一项研究进行了关于金黄色葡萄球菌2014年在墨西哥的Cotija奶酪中[18］.目前，奶酪制作是墨西哥最重要的产业之一，它使用了该国生产的大约25％的牛奶，这一行业的重要性反映在估计中，大约70％的墨西哥奶酪来自小型-scale制作[19]，突出了本研究的重要性。此外，由于食用受污染的手工奶酪而引发的疫情金黄色葡萄球菌在采样年份报告了该地区的情况。

3．2.的分布金黄色葡萄球菌生物型

干酪分离物之间的生物型分布存在各种显著差异。生物型C是普遍存在的生物型（14/44），并存在于所有干酪中，生物型D也是如此。人类ecovar（7/44）存在于cotija、adobero和fresco干酪中。在本研究中，与农场相关的生物型频率较低（家禽生态变种（2/44）；牛生态变种（0/44））（表1)．

ecovar的分离菌株的多样性可以解释这些奶酪与多个因素的污染在细化过程中,相关的环境中获得的原料(猪ecovar),并在某一阶段的过程和操作(人类ecovar)。在这最后一点，它被描述为金黄色葡萄球菌是人类皮肤和粘膜中常见的共生细菌[20.]，而且很容易被加热和消毒剂破坏，因此，在加工食品中存在这种物质通常表明卫生条件差和/或巴氏杀菌不够[4］.

3．3.发生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和产肠毒素A金黄色葡萄球菌

在本研究中，甲氧西林耐药的频率金黄色葡萄球菌（MRSA）为18.1%（8/44），肠毒素A产生者为18.1%（8/44）（图1).肠毒素A金黄色葡萄球菌从所有类型的奶酪中分离出菌株（表1）3.)．

获得的菌株，MRSA的患病率为18.1％;在研究包括在塞尔维亚[15)、意大利(14]，以及伊朗[10]，未检测到具有此特征的菌株；只有一项来自巴西的研究，频率为22%[21]这反映了在奶酪中循环的菌株的多样性，强调只有一项研究监测食物的MRSA [22］.产生肠毒素a的菌株的频率为18.1%，这一事实很难进行比较，因为各种研究已经描述了肠毒素生成谱，并通过PCR寻找感兴趣的基因[23- - - - - -25]，尽管肠毒素基因的存在不是SE蛋白表达的有效指示[26]但是，即使采用不同的技术，也要强调的是，本研究中选择的肠毒素在所有肠毒素中是最常见的[1］.墨西哥立法规定金黄色葡萄球菌算作奶酪质量和安全的指标。在这项研究中，三十个样本显示金黄色葡萄球菌高于标准（3.0 日志（CFU/g）[27]由墨西哥法律建立，并仅在其中一个分离出肠毒素A产生的菌株（5.6 log Cfu / g）;剩余的菌株与不超过该极限的样品分离。允许的限制金黄色葡萄球菌根据墨西哥法律的规定，肠毒素的生产与食品中细菌的增殖有关，因此菌落计数被用来确定产品的安全性，因此只考虑食品样品的含量高金黄色葡萄球菌存在风险；但是，该数字不能确保菌株的产肠毒素能力，因为已证明基质对seD和seiR产生的硒水平的影响[28].此外，已经描述了预成型肠毒素可以抵抗产品中的热处理（需要100°C 5-10小时） 最小值（待销毁）[4的营养细胞金黄色葡萄球菌被淘汰;因此，CFU的枚举会低估这种可能性[29］.同一法例表示使用稳定热核酸酶测试，并间接将该测试与肠毒素的生产联系起来[30.]; 因此，考虑到该试验不足以证明肠毒素的产生者，特别是肠毒素A的产生者，我们还将该技术的敏感性和特异性与斑点杂交法产生肠毒素A的60%进行了比较和分析。从这个意义上说，关于该试验的效力存在着相互矛盾的研究[31，32，这就建议寻找新的快速间接或直接检测方法，将其与肠毒素产生联系起来金黄色葡萄球菌．可靠，快速和敏感的SE检测方法的可用性不仅在SFP调查中很重要，而且还产生允许风险管理人员为SES设置食品安全标准的数据，因此防止SFP。

3．4．耐甲氧西林的关系金黄色葡萄球菌(MRSA)，产生肠毒素A金黄色葡萄球菌，和生物型

50%的MRSA菌株(4/8)与D ecovar相对应，25%与人ecovar相对应(见表)4)．此时，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌在世界各地传播[21]包括已经描述过的食品处理人员[33，34]，它们被手动接触或通过呼吸分泌物视为食物污染的主要来源[19]肠毒素A产生菌的频率分布在不同的生态系中。研究表明，污染源（ecovar）与生产硒的类型之间存在关系金黄色葡萄球菌.SeA和SeB与人类来源的污染有关[35］.这些数据可以解释肠毒素的发生金黄色葡萄球菌然而，在人类ecovar和生物型A中，甚至有人描述了编码肠毒素的基因在所有来源中都分布或存在[36];这支持来自不同ecovars的海中的数据金黄色葡萄球菌在这个研究中。

4.结论

我们的结论是墨西哥的手工奶酪受到了多种金黄色葡萄球菌具有不同致病性和流行病学特征的生物型。此外，每种奶酪的污染风险不同，因此有必要对这些食品的制备过程进行监控。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者宣布关于本文的出版物没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了Educación Pública, México秘书处的“incorporación新时代教授计划”的资助。

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