文摘

炎症性肠病(IBD)是慢性炎症性疾病包括胃肠道的全部或部分。的压力激发了serine-threonine蛋白激酶蛋白D1 (PKD1)曾被卷入肠道免疫调节。本研究的目的是评估的影响人类PKD1与肠道炎症,使用肠上皮Caco-2细胞共培养模型和RAW264.7巨噬细胞。炎症反应是由脂多糖诱导的巨噬细胞(有限合伙人),上调表达的肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、白介素- 1 (IL)β除了增加,il - 6的分泌TNF -α蛋白质。PKD1 Caco-2是行政的影响评估与改进的炎症和抑制炎症引发的能力。管理PKD1 (10 - 100 ng / ml)的差别诱导炎症诱导后对这些肿瘤坏死因子-α在RAW264.7细胞表达。此外,PKD1管理3 h LPS刺激之前减少了后续的炎症反应的差别通过对这些肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 6在RAW264.7细胞。这些结果表明PKD1的潜在作用肠道上皮细胞和免疫细胞之间的细胞间通信,提出了一种保护作用的PKD1诱导巨噬细胞的炎症反应,炎症性肠病发病机制中一个重要方面。

1。介绍

炎症性肠病包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)的特点是一种肠道屏障功能受损和增强肠道炎症。炎症性肠病已经成为全球疾病发病率增加专门在新兴工业化国家(1]。炎症性肠病的发病机制与肠屏障功能,减少阻碍肠道上皮细胞之间的隔离(iec)和肠道环境。具体来说,一种肠道屏障功能受损与疾病严重程度在IBD患者2]微生物渗透底层组织,诱导不当和过度激活的粘膜免疫系统3]。事实上,不恰当的反应这些外在刺激树突状细胞等免疫细胞和巨噬细胞对炎症性肠病的发病机制和免疫组织内稳态扰动(4]。减少炎症IBD患者是至关重要的,特别是促炎介质如il - 6和TNF -α增强CD和加州大学(5]。事实上,免疫调节核转录factor-kappaB (NF -κB)强烈激活在iec和巨噬细胞在炎症性肠病的过程中,增加促炎细胞因子的分泌TNF -α、il - 1、il - 6、il - 12和IL-23 [6]。然而,促炎细胞因子如il - 1的有利影响β、il - 6和TNF -α还观察到与炎症和reepithelialization受伤肠组织,强调时间的重要性适当控制自己的表情来平衡反应肠道损伤和炎症(7- - - - - -9]。

人类PKD1压力激发了蛋白激酶参与信号转导、细胞增殖、分化、迁移、和免疫调节(10]。PKD1表达在B - t细胞(11)和激活RAW264.7巨噬细胞细胞在识别细菌病原体的DNA,诱导激活NF -κB和随后的促炎细胞因子的表达,TNF -α、il - 6、引发和il - 1212]。此外,PKD1诱导激活NF -κB在氧化应激反应13],防止iec oxidative-stress-induced凋亡[14]。这表明PKD1与肠道炎症的一个重要的角色。在目前的研究中我们调查了两个重要问题:(1)可以管理人类重组PKD1 iec改善一个已经建立了在巨噬细胞炎症反应吗?(2)可以管理人类重组PKD1 iec抑制启动后续LPS-induced在巨噬细胞炎症反应吗?研究这些影响,我们使用一个在体外肠道炎症模型使用与肠上皮Caco-2细胞培养系统和RAW264.7细胞巨噬细胞(图1)[15]。


图1
培养系统的图解说明。蛋白激酶D1 (PKD1)管理Caco-2细胞生长的21天transwell插入,而脂多糖(LPS)是管理RAW264.7细胞巨噬细胞诱导炎症反应。

2。材料和方法

2.1。细胞系和培养

人类上皮结直肠恶性腺瘤细胞系,Caco-2,请捐赠的Jan Trige拉斯穆森(丹麦奥尔胡斯大学)。细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM、生命技术、丹麦)补充10%胎牛血清(FCS、Bio-Whittaker、丹麦),玫瑰(10毫米,生活技术),GlutaMax(2毫米,生活技术)和penicillin-streptomycin (1% v / v, Sigma-Aldrich、丹麦)。写明ATCC, RAW264.7细胞巨噬细胞(德国)在DMEM培养补充10% FCS, 2毫米GlutaMax, v / v penicillin-streptomycin 1%。细胞被维持在37°C和5%的公司2。Caco-2细胞通过使用0.05% Trypsin-EDTA(技术)和RAW264.7细胞被刮掉一段细胞融合时达到80 - 90%。

2.2。共培养模型

Caco-2细胞(段落10到12)被播种密度 细胞/厘米2在聚对苯二甲酸乙二醇酯细胞培养插入孔隙大小为0.4μ米(BD猎鹰,VWR,丹麦),放置在6-well细胞培养板(BD猎鹰,VWR,丹麦)。细胞培养为21天。20天,RAW264.7细胞(段落5到8)被播种在6-well细胞培养板的密度 细胞/厘米2在10% FCS细胞培养基。建立共培养模型,Caco-2插入被转移到RAW264.7井21天。与1 RAW264.7细胞被刺激μg / ml有限合伙人(大肠杆菌O127: B8 Sigma-Aldrich),而0.001、0.1,10,100 ng / ml PKD1 (129.3 kDa,热费希尔科学、丹麦)添加水、Caco-2细胞(图1)。进行了两项研究,有限合伙人管理3 h其次是PKD1 3 h或PKD1管理3 h有限合伙人6 h紧随其后。上层清液被收集并存储在−ELISA分析80°C,而细胞被收集并存储在RNAlater−qPCR分析80°C。我们执行了三个生物复制品。

2.3。Transepithelial电阻

一式三份的测量进行了使用Millicell-ERS volt-ohm计结合MERSSTX03电极(微孔、丹麦)根据制造商的指导方针。Caco-2细胞被认为是完全分化后达到稳定的大约700Ωcm阅读2。

2.4。酶联免疫吸附试验

Quantikine ELISA分析小鼠肿瘤坏死因子-α进行上层清液从RAW264.7细胞。样本分析重复根据制造商的指导方针(研发系统、啊诊断、丹麦)。吸光度测量在540 nm波长450 nm和纠正使用一个设想2103年Multilabel读者(美国PerkinElmer)。

2.5。实时逆转录聚合酶链反应

总RNA分离和纯化使用NucleoSpin RNA II装备根据制造商的指南(Macherey-Nagel,德国)。总RNA浓度和纯度是评估通过测量吸光度使用NanoDrop分光光度计在260和280海里。纯化RNA是反向转录使用益生元(dT) 12 - 18引物,随机引物,上标三世逆转录酶(表达载体、丹麦)。互补脱氧核糖核酸的合成进行了42°C 60分钟紧随其后的是反应失活在70°C 15分钟一个能源管理公司迅速MaxPro热循环(河中沙洲& Halby、丹麦)。互补脱氧核糖核酸样本稀释1:10和标准样本稀释1:5。实时PCR定量标准稀释系列1:4制备和分析一式三份,而互补脱氧核糖核酸复制样本进行分析。管家基因,次黄嘌呤phosphoribosyl转移酶(HPRT1),量化了SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司、瑞典)使用正向引物:5′-CAGTCAACGGGCGATATAAAAGTA-3′, 5′-CCAGTGTCAATTATATCTTCAACAATCAA-3′反向引物。其他选择的基因分析TaqMan™基因表达分析组成的预先设计未标记的PCR引物(表1与荧光素),TaqMan MGB探针标记amidite (FAM)和TaqMan普遍掌握混合(应用生物系统公司、瑞典)。荧光检测使用Viaa7实时PCR系统(应用生物系统公司、瑞典)40周期如下:1.6°C / s - 95°C了15秒之后,1.6°C / s - 60°C 1分钟。GAPDH和HPRT1被选为RAW264.7看家基因和Caco-2细胞,分别。

表1
选择基因的引物PCR定量期间使用Caco-2和RAW264.7细胞。
2.6。统计分析

数据分析使用统计分析软件的混合过程(SAS研究所Inc .)、美国版本9.3)。平均Ct值GAPDH或HPRT1用于规范化目标基因的转录RAW264.7和Caco-2细胞,分别。实时rt - pcr数据提出了LSMEANS置信区间为95%,相对于如果负控制(= 1)的复制实验。ELISA结果表现为LSMEANS±标准平均误差(SEM)的复制实验。显著差异被判定 。

3所示。结果

3.1。PKD1刺激分泌TNF -α从RAW264.7细胞

评估PKD1我们使用已经建立的免疫反应共培养模型与肠上皮Caco-2细胞和巨噬细胞RAW264.7细胞(15- - - - - -18]。Caco-2细胞成长为21天,直到形成一个支流enterocyte-like细胞单层(19),此时与建立了RAW264.7巨噬细胞共培养,使两个单个细胞层(图之间的串扰1)。RAW264.7巨噬细胞被刺激与LPS浓度为1μg / ml 6 h,达到最大TNF -α在24小时内分泌物(数据没有显示)。不同浓度的PKD1水服用蛋白质以Caco-2细胞之前或之后与LPS刺激的RAW264.7细胞。这使我们学习的能力PKD1改善已建立的炎症反应以及能够抑制炎症反应的起始随后LPS引起的。

与LPS诱导炎症反应刺激RAW264.7细胞6 h内观察到的分泌TNF -α的浓度大约11.5 ng / ml到基底外侧间室(图2)。这6 h LPS刺激,期间的完整性Caco-2单层保持稳定(数据没有显示)。政府之前PKD1 Caco-2细胞刺激与LPS诱导肿瘤坏死因子-α分泌浓度( )。相比之下,PKD1管理与LPS刺激后诱导肿瘤坏死因子-α分泌PKD1只有0.1 ng / ml。


图2
PKD1刺激分泌TNF -α从LPS-stimulated RAW264.7细胞。蛋白激酶D1 (PKD1;0.001,0.1,100 ng / ml)管理水Caco-2细胞与RAW264.7细胞共培养。炎症反应在RAW264.7细胞诱导1μg / ml脂多糖(LPS,大肠杆菌:O127)。肿瘤坏死因子- PKD1对分泌的影响α从RAW264.7细胞在两种不同情况下进行评估:(■)有限合伙人管理RAW264.7细胞3 h,其次是PKD1 Caco-2细胞3 h调查PKD1能否改善一个已经引起炎症。(□)PKD1 Caco-2细胞接种3 h此时RAW264.7细胞与LPS刺激6 h评估PKD1是否能抑制炎症启动。肿瘤坏死因子-α水平控制(没有LPS刺激)是检测不到(ND)。提出了数据意味着±SEM ( )。显著差异( )的浓度PKD1由小写字母表示。
3.2。PKD1对炎症标记物的表达

评价各种治疗方法的影响,从Caco-2 mRNA, RAW264.7细胞被孤立和选择基因的表达被实时rt - pcr进行评估。对LPS诱导的炎症反应证实了RAW264.7细胞调节il - 1的表达β、il - 6和TNF -α如果控制(数据相比3(一个)- - - - - -3 (c))。具体来说,相当upregulation的il - 6和il - 1β表达水平观察(> 5000次)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
PKD1对il - 1的影响β、il - 6和TNF -α在RAW264.7细胞信使rna表达。蛋白激酶D1 (PKD1;0.001,0.1,100 ng / ml)管理水Caco-2细胞与RAW264.7细胞共培养。炎症反应在RAW264.7细胞诱导1μg / ml脂多糖(LPS,大肠杆菌:O127)。PKD1对il - 1的影响β、il - 6和TNF -α在两种不同情况下表达水平进行评估:(■)有限合伙人管理RAW264.7细胞3 h,其次是PKD1 Caco-2细胞3 h调查PKD1能否改善已建立的炎症。(□)PKD1 Caco-2细胞接种3 h此时RAW264.7细胞与LPS刺激6 h评估PKD1是否能抑制炎症启动。数据给出的意思是转录水平相对于负控制(0% FCS,如果)和95%置信区间( )。显著差异( )在PKD1浓度和有限合伙人由大写字母表示。

治疗与PKD1 LPS-stimulated Caco-2 / RAW264.7培养导致TNF的表达——改变α,而il - 1β,在RAW264.7细胞il - 6与PKD1治疗期间保持不变(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。肿瘤坏死因子-浓度的影响α观察低浓度的PKD1 (0.001 - -0.1 ng / ml)移植肿瘤坏死因子-α表达和高浓度的PKD1 (10 - 100 ng / ml)下调TNF的表达α相比与有限合伙人控制( ,图3 (c))。有趣的是,对肿瘤坏死因子-观察到的影响α表达水平是独立的PKD1,也出现了类似的浓度效应,当管理PKD1 LPS刺激之前RAW264.7细胞。同样,管理PKD1有限合伙人之前表达下调il - 1的表达β(100 ng / ml)和il - 6 (0.001 -100 ng / ml),相比与有限合伙人控制( 用RAW264.7细胞(数字)3(一个)和3 (b))。

而炎症反应启动Caco-2 RAW264.7细胞刺激免疫反应的细胞所观察到的一个调节引发和TNF的表达α,只有轻微的微分效应观察PKD1(数字4(一)- - - - - -4 (d))。PKD1在引发的表达的影响,β连环蛋白和PPAR -γ在Caco-2细胞是不重要的影响,而治疗0.1 ng / ml PKD1与LPS刺激后调节TNF的表达α相比与有限合伙人控制Caco-2细胞( )。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
PKD1对引发的影响,TNF -α,β连环蛋白和PPAR - 在Caco-2细胞信使rna表达。蛋白激酶D1 (PKD1;0.001,0.1,100 ng / ml)管理水Caco-2细胞与RAW264.7细胞共培养。炎症反应在RAW264.7细胞诱导1μg / ml脂多糖(LPS,大肠杆菌:O127)。PKD1对引发的影响,TNF -α,β连环蛋白和PPAR - 在两种不同情况下表达水平进行评估:(■)有限合伙人管理RAW264.7细胞3 h,其次是PKD1 Caco-2细胞3 h调查PKD1能否改善已建立的炎症。(□)PKD1 Caco-2细胞接种3 h此时RAW264.7细胞与LPS刺激6 h评估PKD1是否能抑制炎症启动。数据给出的意思是转录水平相对于负控制(0% FCS,如果)和95%置信区间( )。显著差异( )在PKD1浓度和有限合伙人由大写字母表示。

4所示。讨论

4.1。LPS刺激Caco-2和RAW264.7细胞的炎症反应

评估PKD1与肠道炎症的影响我们与肠上皮Caco-2细胞共培养模型和LPS-stimulated RAW264.7巨噬细胞与肠道炎症,如前所观察到的(16- - - - - -18]。Tanoue等人证实这些细胞之间的串扰,LPS-stimulated RAW264.7细胞分泌TNF -α,从而诱导引发mRNA表达Caco-2细胞(15]。在协议中,我们观察到LPS-induced分泌TNF -α(11.5 ng / ml) RAW264.7细胞RAW264.7细胞被刺激时1μ克/毫升的有限合伙人(大肠杆菌O127,图2)。同时,肿瘤坏死因子表达的调节α、il - 6和il - 1β在RAW264.7细胞(数据吗3(一个)- - - - - -3 (c))。不同浓度的有限合伙人已经用于诱导炎症反应。Tanoue等人报道的分泌TNF - 50 ng / mlα当刺激100 ng / ml的有限合伙人(大肠杆菌O127) 3 h [15),而5 ng / ml的有限合伙人(大肠杆菌O127) 3 h诱导的分泌TNF -α水平350 pg / ml (16]。这些微分反应可能是由于不同细胞密度以及不同段落的RAW264.7细胞用于研究,可能影响对LPS刺激的反应。与此同时,LPS刺激的RAW264.7细胞诱导引发的调节表达和肿瘤坏死因子-α在Caco-2细胞(数字4(一)- - - - - -4 (b))。具体的表达引发Caco-2细胞与1当刺激诱导了近4倍μ有限合伙人的g / ml,相比大幅度增加2倍感应Tanoue et al .,观察到当刺激100 ng / ml的有限合伙人(15]。因为先前的研究已经确定了Caco-2细胞对有限合伙人(20.),这些结果强烈表明RAW264.7细胞巨噬细胞刺激Caco-2 LPS诱导炎症反应的细胞通过两个单个细胞层之间的串扰。

4.2。PKD1显示浓度效应的改善肠道炎症

测试的能力PKD1蛋白改善肠道炎症,RAW264.7细胞与LPS刺激3 h。其次是政府的PKD1 Caco-2层3 h。而不影响观察il - 1βRAW264.7细胞中il - 6、TNF浓度影响α表达水平。这里管理10 - 100 ng / ml PKD1下调TNF -α,而低浓度(0.001 - -0.1 ng / ml)造成upregulation TNF -α在RAW264.7细胞。然而,类似的效应没有被观察到的分泌TNF -α(图2),表明观察转录效应没有直接转化为相应的效应蛋白水平在这6小时时间。自anti-TNF -α治疗已成为中央目标改善炎症性肠病(21),这强调了潜在观察TNF -差别PKD1-induced对这些基因的重要性α在RAW264.7细胞。然而,PKD1 (0.1 ng / ml)调节TNF的表达α在Caco-2细胞(图4 (b)),展示一个不利影响时iec PKD1对待。然而,由于有限的效果观察Caco-2细胞,其他潜在的介质诱导在PKD1治疗可能施加的影响观察RAW264.7细胞。

4.3。PKD1影响肠道炎症的起始

PKD1阻碍炎症的能力开始被管理调查PKD1 Caco-2细胞3 h前6 h LPS刺激RAW264.7细胞。RAW264.7细胞,管理PKD1 Caco-2细胞抑制il - 1的LPS-induced炎症反应β(100 ng / ml PKD1), il - 6 (0.001 -100 ng / ml PKD1)和肿瘤坏死因子-α(10 - 100 ng / ml PKD1)表达水平下调。具体地说,观察il - 6的差别浓度对这些。促炎细胞因子il - 6是增强在急性和慢性伤口(7和与炎症性肠病的22]。这因此演示了一个潜在的重要差别PKD1-dependent对这些效应的PKD1阻碍肠道炎症。肿瘤坏死因子-α反应中观察到RAW264.7细胞移植PKD1较低水平和高水平表达下调TNF -αPKD1观察的mRNA水平意味着这个浓度效应。有趣的是,分泌TNF -α从LPS诱导显著控制不依赖于PKD1的浓度(图2)。管理PKD1 Caco-2细胞诱导肿瘤坏死因子-α从RAW264.7细胞分泌,而下调mRNA表达PKD1 10 - 100 ng / ml。因此,观察对mRNA和蛋白水平的影响没有直接关联。自TNF -α信使rna和蛋白质含量是评估在相同的时间,这些变化可能被视为转录变化转化为影响蛋白质含量有一定延迟,限制了两者之间的相似性分析。有趣的是,PKD1曾被发现产生TNF的表达α和RAW264.7细胞il - 6在刺激与细菌的DNA (12]。在这项研究中观察到的差别,对这些因此代表了一个微分的影响PKD1一旦管理Caco-2细胞炎症启动之前。

前列腺素从LPS-stimulated PPAR -巨噬细胞产生刺激γ和后期的激活il - 10在iec 72 h (23]。这里,三通的变化(数据没有显示)和PPAR -的表达γ在Caco-2细胞保持不变。同样的,β连环蛋白,一个主要组件的形成(能)[粘合连接处并且24),在各种治疗仍未受影响,尽管以前的观测PKD1和之间的串扰β连环蛋白(25,26]。因此,本文提供的研究表明,6小时治疗期和有限合伙人inflammation-induced评价不足的影响β连环蛋白和PPAR -γ在Caco-2细胞。重要的是,我们没有评估的PKD1 RAW264.7细胞上清液。观察巨噬细胞的影响可能因此造成的间接或直接影响,取决于PKD1渗透Caco-2细胞和transwell插入,进入低舱。

引发和TNF的表达αCaco-2细胞的各种治疗方法的影响,这意味着要么表达的影响在其他时间或其他细胞介质可能受到PKD1的影响。重要的是,从这些研究似乎PKD1有限一旦启动炎症反应的影响。这表明潜在的抗炎效应PKD1无法影响严重的促炎反应启动RAW264.7细胞与LPS刺激后。在相反的位置,似乎与PKD1预防性治疗有能力阻碍后续促炎反应诱导的巨噬细胞。然而,我们不得不考虑PKD1治疗的时间之间的差异在这两项研究。而预防PKD1治疗管理3 h 6 h LPS刺激前,给了总共9 h与PKD1治疗,Caco-2细胞只有对待PKD1总共3 h学习时已建立改善炎症反应的能力。自从炎症启动3 h PKD1治疗前,启动炎症反应可能是太浓重了PKD1 3 h期间造成重大影响。

总之,PKD1一个持续的改善肠道炎症Caco-2 / RAW264.7在高浓度的PKD1培养,主要的差别通过对这些炎性细胞因子、肿瘤坏死因子-α。相比之下,PKD1管理之前启动炎症反应显示浓度促炎介质的差别通过对这些基因的抗炎效果,il - 6和TNF -α。研究潜在的有益和防护提供依据PKD1与肠道炎症的影响。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢珍妮b Funch Adamsen和卡斯帕Vrangstrup Poulsen实验室援助和他诉Curtasu提供图解的培养系统。这项工作得到了丹麦独立研究理事会(批准号1335 - 00116年)。