文摘

背景。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)能刺激大量细胞因子释放。氯胺酮抑制肿瘤坏死因子(TNF)分泌MRSA-stimulated RAW264.7巨噬细胞,和机制可能涉及N-methyl-D-aspartic酸(门冬氨酸)受体拮抗。NMDA-mediated TNF的下游效应抑制,特别是PI3K / Akt mTOR调制,并没有被描述。方法。与10 RAW264.7细胞被刺激了18小时⁵到10⁷CFU /毫升接种物的两种典型的社区——(CA)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株,USA300应变LAC和USA400对象。然后我们添加了NMDA抑制剂氯胺酮或2 r-amino-5-phosphonopentanoate (AP5)、门冬氨酸衬底,LY294002,雷帕霉素在不同的组合。结果。门冬氨酸抑制抑制TNF分泌比no-ketamine控制了近三分之一。门冬氨酸底物添加时,TNF分泌增加了10%。添加LY294002巨噬细胞抑制肿瘤坏死因子生产的20%。雷帕霉素展出一个浓度TNF induction-suppression回应:诱导剂量的0.1和1 ng / mL和抑制在10和100 ng / mL。诱导肿瘤坏死因子被废除LY294002时添加和抑制变得均匀。Ketamine-induced抑制TNF分泌加剧10 - 15%时添加了雷帕霉素,但不是当LY294002补充道。结论。这些发现表明,NMDA-induced抑制肿瘤坏死因子可以增强并发mTOR抑制。

1。介绍

脓毒症是一种发病率和死亡率的主要原因,在儿科人口估计发病率每年每1000人0.56例。葡萄球菌感染败血症的主要原因是(1,2]。组件和细菌分泌毒素能刺激大量细胞因子释放和导致感染性休克,急性呼吸窘迫综合征,和死亡3]。很可能策略旨在调节过度而持久的宿主炎性反应可以改善这种感染的结果。巨噬细胞细胞促炎细胞因子的主要来源,包括白细胞介素如il - 1β,引发il - 6分泌白介素、肿瘤坏死因子(TNF)在细菌刺激4,5]。产生肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子,主要由激活巨噬细胞和内毒素休克中起着重要的作用,免疫、炎症、抗病毒反应和恶病质和非胰岛素依赖糖尿病等疾病6- - - - - -8]。在我们先前的研究显示,肿瘤坏死因子的分泌取决于某些毒性表达的因素,特别是四细胞溶解的phenol-soluble modulin (PSM)肽(9]。可以减少炎症反应在存在nonlytic抗生素,daptomycin [9,10]。我们还显示,最推荐的麻醉剂对脓毒性休克,氯胺酮,能抑制TNF分泌独立于PSM的表达式或nonlytic抗生素作用机制(11]。肿瘤坏死因子激活的核因子kappa-light链增强剂激活B细胞(NF -κB)通常是不活跃的,隐藏在细胞质中结合抑制剂(12]。激活的转录因子NF -κ通过磷脂酰肌醇B由TNF介导3-kinase (PI3 K)通路(12]。

氯胺酮的行动始于对立的n -甲基- d -门冬氨酸受体。它对下游通路的影响是未知的。它最近已被证明,克他命有一个快速抗抑郁效应是由于激活的哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR) [13]。钙调磷酸酶抑制剂吸收FK506和环孢霉素可以抑制海马NMDA受体(14]。雷帕霉素或西罗莫司,是一个大环内脂类抗菌素mTOR抑制剂与结构,有助于预防同种异体移植物丢失的15- - - - - -21]。这是首次发现在复活节岛土壤(拉帕努伊岛)的产物链霉菌属hygroscopicus(15,22]。它产生免疫抑制效应一样环孢霉素A和吸收FK506,通过绑定immunophilins和干扰t淋巴球增生的信号通路23]。雷帕霉素与胞质蛋白结合FK-binding蛋白质12 (FKBP12)相同的方式在结构上类似的吸收FK506 [24]。FKBP12蛋白质是由人类FRAP1基因位于染色体上,是一个phosphatidyl-inositol激酶(压力中介)25,26]。rapamycin-FKBP12复杂结合mTOR复杂1 (mTORC1) [27- - - - - -29日),这是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸激酶和功能作为氧化还原传感器,调节细胞生长、增殖,能动性,和生存以及蛋白质合成和转录30.]。最近研究显示抑制TNF生产通过刺激血管平滑肌细胞脂多糖(LPS) 1 ng / mL(雷帕霉素添加时31日]。雷帕霉素在单核细胞凋亡CD34-derived树突细胞,但无法单核细胞和巨噬细胞(32)在人类内皮细胞的一些研究显示,雷帕霉素的添加剂量接近10和100 ng / mL可能导致加速细胞死亡和损失的细胞迁移33]。本研究进一步探讨了门冬氨酸抗炎通路,特别是PI3K / Akt的角色系统,mTOR,雷帕霉素community-associated - (CA)耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞模型。它评估是否NMDA-induced肿瘤坏死因子可以增强与雷帕霉素抑制,根据观察到的克他命雷帕霉素antidepression模型(13]。门冬氨酸的组合和对肿瘤坏死因子抑制mTOR抑制性影响反应可以在脓毒症是一个重要的临床方法。

2。材料和方法

2.1。细菌

这些研究中,我们利用两个良好的临床分离株,漆(洛杉矶),代表USA300群生物,主导CA-MRSA克隆与密切相关的软组织感染和严重的侵袭性疾病在孟菲斯地区和对象,另一个临床分离从中西部孩子致命CA-MRSA败血症,代表USA400群生物构成的其他主要沿袭CA-MRSA隔离在美国(34,35]。

奥托和DeLeo和他的同事们最近生成的同基因的菌株LAC和对象设计缺乏表达的psmδ毒素和慷慨地提供这些菌株的研究:在这个实验中我们使用了Δ-PSM -α-LAC-MRSA稳定的菌株,可以减少肿瘤坏死因子响应相比同基因的野生型菌株(11,36]。

细菌生长对数期后期在大豆胰蛋白酶的肉汤37°C (Becton, Dickinson和公司,火花,医学博士,美国),洗了三次endotoxin-free磷酸盐。浓度测定菌落计数。一系列浓度的细菌(10⁵-10年⁷CFU /毫升)进行了研究,根据我们先前公布的数据与其他CA-MRSA菌株和我们的初步实验9- - - - - -11]。这些菌株的最小抑制浓度(麦克风)是由使用以及方法在微生物实验室Le Bonheur儿童医院(LBCH)。两菌株都完全对万古霉素敏感(LAC:麦克风万古霉素1.0μg / mL;对象:麦克风万古霉素< 0.5μg / mL)。刺激巨噬细胞在细菌,我们使用细菌脂多糖等产品(有限合伙人),革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分,和lipoteichoic酸(LTA),革兰氏阳性细菌细胞壁的组成部分,与雷帕霉素实验。这样做是为了确认雷帕霉素影响是独立于任何rapamycin-MRSA交互。

2.2。细胞培养

RAW264.7细胞小鼠macrophage-like写明ATCC和培养买来的杜尔贝科修改鹰的介质(美国弗吉尼亚州赫恩登Mediatech Inc .,)补充10%胎牛血清(美国UT HyClone,洛根)和2毫米谷氨酰胺(美国纽约GIBCO,大岛)。实验是在24-well完成组织培养板(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)的目标细胞每口井。

万古霉素,在临床上可以实现集中的20倍μg / mL,之前立即添加到细胞培养的葡萄球菌(10⁵-10年⁷CFU /毫升)。细胞培养18个小时(10]。万古霉素是购买通过药房学系LBCH从Hospira(美国IL森林湖)。它抑制了控制MRSA和巨大的肿瘤坏死因子生产的增长。

这些实验是重复在并行和各种组合的克他命(100μ米),AP5(3毫米),ly - 294002(500海里),和门冬氨酸基板(30μ在浓度为0.1米)。雷帕霉素的加入,1、10、100 ng / mL:浓度的相关性选择一直在前面描述的(32,33]。的调制MRSA-stimulated巨噬细胞肿瘤坏死因子生产10克他命在浓度进行了测试,五十,100,150μM,选定的浓度(100μM)是基于可行的麻醉浓度,在现有文献和自己的工作(5,11,37- - - - - -43]。氯胺酮的来源是Ketalar,外消旋混合物(1:1)的旋光异构体(R和L)的药物,从LBCH药房购买。在实验中被强调与临床相关情况;因此,外消旋氯胺酮,最常见的临床使用的产品,被选中。AP5、门冬氨酸和雷帕霉素买来西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。

孵化后,浮在表面的游离收集和化验TNF浓度用固相夹心酶联immunoabsorbent试验作为指定的制造商(eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。肿瘤坏死因子是一个关键在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌刺激巨噬细胞产生的细胞因子。我们测量其他细胞因子的分泌,可以发现,il - 6和il - 12与TNF分泌分泌物有紧密的关联响应这些细菌(和0.91,分别地)。这些结果与我们之前的研究(9,11]。我们为这些研究集中于TNF分泌。

万古霉素的检测浓度,氯胺酮、AP5 NMDA, LY294002,和雷帕霉素没有影响RAW264.7细胞的生存能力,由单层的目视检查,低功耗单层的微观检查,排除0.2%台盼蓝染料。细胞生存能力被证实使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium内盐(MTS)根据制造商的指示(Promega)。MTS试剂是降低新陈代谢活跃的细胞变成彩色甲瓒产品然后测量其吸光度。总之,MTS的解决方案是添加到井的96 -微量滴定板,细胞培养2 h。然后在490 nm吸光度测量。

的比较实验,TNF分泌平均测量验证了至少三个复制和每个实验至少重复三次(总共有9个样本)。实验分别进行LAC野生型,Δ-PSM -α虫胶,《野生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株。我们确认统一的MRSA菌株反应在所有的实验。有一个内在的实验性肿瘤坏死因子生产的绝对最大值的变化在不同的细胞培养瓶由于独特的细胞培养和内源性巨噬细胞差异,找到一致的在我们先前的研究9- - - - - -11]。尽量减少变异,我们进行了每个实验细胞相同的人口。我们标准化反应(TNF)生产实验设置“控制”的反应,也就是说,没有刺激药物暴露或其他修改。我们报道的百分比控制的结果。百分比表达有助于更好地了解治疗效果。从我们的经验与巨噬细胞以及临床观察脓毒症模型,一个“理想的响应”是一个一致的TNF减少10 - 40%。肿瘤坏死因子水平降低(但不完全抑制)与最好的临床结果(44- - - - - -48]。百分比可以很容易地转化为实际价值,因为实际控制价值(pg / mL)给出了每个实验;例如,当响应是控制和实际控制的80%价值33561 pg / mL,那么响应0.8×33561 pg / mL = 26849 pg / mL。数据4(一)和4 (b)图的描述相同的结果4(一)褶皱变化的控制和数字4 (b)pg / mL TNF生产。

2.3。数据分析

结果进行了分析和R 2.13.1 ggplot2图方案。他们被SPSS19-IBM验证。阶乘的实验设计包括多个测量。Kolmogorov-Smirnov的常态评估测试和阴谋。方差分析是独立团体之间,我们测试了方差的同质性与列文的测试。我们将预先计划(先天的)对比;我们提前集合我们所有的比较多个设置实验。显著差异是假定的概率值。当事后测试使用了我们应用Bonferroni调整。结果是画的褶皱增加相比,控制使用误差和95%置信区间。

3所示。结果

门冬氨酸通路抑制或诱导调节RAW264.7小鼠巨噬细胞的肿瘤坏死因子响应刺激CA-MRSA野生型菌株对象和虫胶。

我们的目标是测试门冬氨酸通路下游(PI3 K)或抑制NMDA诱导与门冬氨酸(NMDA衬底)单独或同时抑制(氯胺酮和AP5)。RAW264.7小鼠巨噬细胞被刺激了18小时10⁶-10年⁷CFU /毫升的对象野生型和LAC野生型CA-MRSA。细菌刺激巨噬细胞肿瘤坏死因子分泌没有暴露于氯胺酮,AP5 (APV), ly - 294002,或门冬氨酸基质作为控制。控制肿瘤坏死因子生产与刺激的PI3 K抑制剂LY294002(500海里),门冬氨酸底物(30μ米),门冬氨酸衬底和LY294002的组合。相同的序列的暴露(LY294002 NMDA衬底,LY294002和门冬氨酸衬底)是重复的NMDA抑制剂氯胺酮(100μ米)或AP5(3毫米)。

LY294002抑制肿瘤坏死因子的存在生产18% ()。添加NMDA衬底TNF生产增加了20% ()。LY294002在NMDA衬底TNF分泌下降只有8%——比控制差异不显著不同。氯胺酮的加入降低TNF生产35% ()。氯胺酮和LY294002加在一起时,减少肿瘤坏死因子显著(33%)和控制不同(),但没有显著不同浓度氯胺酮引起的孤独。抑制NMDA和氯胺酮诱导7%,没有明显不同于控制响应。ketamine-NMDA-LY294002反应是减少17%,明显不同于控制()。结果在图1(一)。

结果类似,当AP5 (APV)是用来代替氯胺酮在同一序列的实验设置(图1 (b)描述了AP5影响TNF生产后CA-MRSA对象刺激)。在这个实验中,有15%的降低TNF分泌控制暴露在LY294002相比,增加了30%暴露在NMDA substrate-both明显不同。TNF分泌水平存在的NMDA和LY294002(下降8%)没有明显不同于控制。AP5 25%抑制肿瘤坏死因子引起的生产和AP5 + LY294002造成33%的抑制,同时显著差异。AP5 NMDA和AP5 NMDA和LY294002减少增加(10%和7%)没有显著不同的控制。反应类似CA-MRSA菌株对象和虫胶(没有显示)。

il - 6和il - 12生产了类似的反应模式当衬底门冬氨酸增加了增加13%和11%,分别为(),抑制与氯胺酮治疗的25%和22%的控制()。控制响应白介素±标准错误(SE)pg / mL, il - 12的响应pg / mL。

雷帕霉素对肿瘤坏死因子的影响生产细菌刺激RAW264.7巨噬细胞
暴露如果巨噬细胞雷帕霉素没有效果。单层的目视检查,低功耗微观检查,排除0.2%台盼蓝染色证实,至少90%的18 - 24小时后巨噬细胞是可行的。因此,雷帕霉素并不影响巨噬细胞在实验期间的可行性。雷帕霉素与细菌刺激巨噬细胞之间的相互作用和剂量反应已被描述。这些我们认为操作前必须建立NMDA-PI3 K-mTOR途径。我们测试了几个型号的刺激,包括《耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(野生型)、漆耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(野生型),Δ-PSM -α-LAC-MRSA失踪PSM -(一种转基因作物α抗原)[9产品以及细菌脂多糖(LPS),革兰氏阴性细菌细胞壁的组成部分,和lipoteichoic酸(LTA),革兰氏阳性细菌细胞壁的一个组成部分。这些测试评估的一致性是必要的雷帕霉素的反应。

巨噬细胞刺激对象(野生型CA-MRSA)的0.1和1 ng / mL TNF的雷帕霉素表现出产量的增加13%和8%,分别在10和100 ng / mL的存在表现出降低TNF生产(11%和4%,分别地。);结果在图2(一个)。相同的两相的浓度反应被认为与虫胶野生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌:14%和5%增加为0.1和1 ng / mL的雷帕霉素,分别减少11%和22%和10 100 ng / mL雷帕霉素(图2 (b))。

Δ-PSM -α-LAC-MRSA刺激也引起了两相的反应:7%和20%增加为0.1和1 ng / mL的雷帕霉素和17%和11%下降10和100 ng / mL的雷帕霉素(图3(一个))。我们还测试了巨噬细胞与LPS刺激的0.1,1、10和100 ng / mL的雷帕霉素,结果是增加9%和3%,减少20%和26%,分别为(图3 (b))。

巨噬细胞刺激与英国网球协会的存在会增加10% 1 ng / mL的雷帕霉素,和减少8%和13% 10和100 ng / mL,分别(图4(一))。因此,我们的数据表明,雷帕霉素修改的TNF分泌细菌刺激巨噬细胞在两相的存在剂量依赖的相关性。

标本的分析可以使用il - 6和il - 12在MRSA-MW2刺激模型显示抑制10 ng / mL 100 ng / mL雷帕霉素剂量:10%和11%的il - 6和il - 12的11%和13%,分别为(两个)。0.1和1的反应在ng / mL雷帕霉素对il - 6和il - 12没有显著不同的控制。抑制与MRSA-LAC刺激也注意到在100 ng / mL雷帕霉素(il - 6, 9%;白介素,11%;)。在这些实验中,控制响应对il - 6pg / mL和il - 12的控制响应131 pg / mL±4.1 pg / mL。

雷帕霉素增加氯胺酮抑制肿瘤坏死因子生产的细菌刺激RAW264.7巨噬细胞。LY294002不会引起额外的效果但使反应与剂量无关。

在这组实验中,巨噬细胞刺激LAC野生型CA-MRSA受到调制的组合氯胺酮和雷帕霉素。控制是TNF产生刺激细胞没有任何接触调节器。克他命没有雷帕霉素抑制TNF生产34% ()。当氯胺酮结合雷帕霉素在0.1和1 ng / mL,我们注意到肿瘤坏死因子的分泌减少22%和18%,分别比未经处理的控制(;图5(一个))。因此,TNF少生产压制在低浓度的雷帕霉素相比,氯胺酮。

氯胺酮和雷帕霉素在10和100 ng / mL,我们注意到减少肿瘤坏死因子生产的43%和47% ()相比,规划——比这更强的抑制达到单独使用氯胺酮。

随后,我们重复暴露在LY294002面前。肿瘤坏死因子抑制变得更加均匀,28%为氯胺酮(),32%为氯胺酮+ LY294002 +雷帕霉素0.1 ng / mL (),37%为氯胺酮+ LY294002 + 1 ng / mL雷帕霉素(),44%为氯胺酮+ LY294002 +雷帕霉素10 ng / mL (),和47%氯胺酮+ LY294002 +雷帕霉素100 ng / mL ()。结果在图5 (b)。

4所示。讨论

氯胺酮抑制TNF分泌通过小鼠巨噬细胞刺激CA-MRSA细菌在抗生素的存在价值几乎三分之一的控制。AP5,另一个门冬氨酸抑制剂,抑制显示了类似的模式。门冬氨酸底物添加到CA-MRSA-stimulated巨噬细胞时,我们观察到肿瘤坏死因子增加10%生产的控制,甚至明显的抑制氯胺酮或AP5。这些发现暗示抗炎NMDA-mediated机制。

ketamine-induced镇压时加剧高剂量(10和100 ng / mL)添加了雷帕霉素,但不是LY294002。LY294002 PI3 K抑制剂,尽管它并没有表现出与氯胺酮累加效应,它抑制TNF生产CA-MRSA巨噬细胞刺激模型中的20%。我们认为这一发现一个共同的途径抑制(PI3 K)氯胺酮和LY294002,这当然不能通过协同作用增强。

雷帕霉素展出一个浓度TNF induction-suppression反应时加入细菌刺激RAW264.7细胞。有大约10%的感应在低浓度的雷帕霉素(0.1和1 ng / mL),大约10%抑制浓度更高(10和100 ng / mL)。这种两相的反应刺激后观察雷帕霉素MRSA-MW2野生型和LAC野生型、Δ-PSM -α虫胶、有限合伙人或本公司。因此,雷帕霉素是一种内在的系统响应。添加氯胺酮(100μM) CA-MRSA单核细胞刺激模型使用雷帕霉素的浓度梯度引起的肿瘤坏死因子抑制20% 0.1和1 ng / mL雷帕霉素和40 - 50%的肿瘤坏死因子抑制在10和100 ng / mL。的;两相的反应是废除当PI3 K / Akt抑制剂LY294002添加数据和抑制成为统一的区别5(一个)和5 (b))。雷帕霉素的浓度反应可能归因于不同的行为不同的mTOR复合物,也就是说,mTORC1 mTORC2。通过真核翻译因子4 e, mTORC1结合蛋白1 (4 ebp1)和核糖体S6激酶(S6 K1)和抑制PI3 K / Akt。雷帕霉素FKBP 12 mTORC1直接结合,抑制4 ebp1 S6KI [49,50]。因此,雷帕霉素可引起PI3 K / Akt通路运行不羁和可能增加肿瘤坏死因子在较低的浓度,当我们观察到。

mTORC2 PI3 K / Akt是一个归纳的一部分。过去,雷帕霉素FKBP 12复杂被认为是无法修改mTORC2,但最近的证据显示了交互时间,细胞,和剂量依赖51,52]。可能在更高浓度雷帕霉素可以抑制PI3 K / Akt,因此抑制TNF生产。因此,如图的响应差异5(一个)和5 (b)可能归因于相互作用的浓度mTORC1和mTORC2抑制增强LY294002 PI3 K / Akt行动。需要做更多的工作来澄清这些差异。

我们的数据表明,一个非常理想的适度的TNF产生CA-MRSA-stimulated RAW264.7巨噬细胞可以实现NMDA和抑制mTOR的组合,可能与“更高的”雷帕霉素剂量,尽管更多的工作来帮助我们理解这些关系是必要的。

5。结论

门冬氨酸抑制剂调节细菌刺激巨噬细胞的抗炎作用。可以增强抗炎反应治疗的细胞与雷帕霉素剂量的10和100 ng / mL。这种抑制作用可能与mTOR1 / mTOR2通路的激活。这些发现可能对脓毒症的免疫治疗产生重大影响。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突,而不是任何直接金融与本文中提到的任何商业实体。

信息披露

部分本文提出了第41届急救护理大会2012年2月,休斯顿,TX:“雷帕霉素对肿瘤坏死因子的影响生产细菌刺激RAW264.7巨噬细胞,”暴击治疗地中海2011;39(12):159和儿科研究的南方社会,新奥尔良,大:“雷帕霉素增强氯胺酮的抗炎效果巨噬细胞反应community-associated耐甲氧西林菌株金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)”,j .投资地中海2012;60 (1):429。

作者的贡献

t . Spentzas大肠餐,f . Savorgnan R.K.H. Shappley导致采集的数据。t . Spentzas大肠餐,b . k .英语导致的概念和设计和解释数据。t . Spentzas促成了统计分析。t . Spentzas大肠餐和b . k .英语给了最后批准。

确认

这项研究是由批准号641001年儿童基金会研究所Le Bonheur儿童医院。作者要感谢Andrea喋喋不休和失读症大肠Spentzas社论援助和马克·s·雷伯恩制药。D。,for medication consults.