文摘
目前抗糖尿病的治疗不能停止,甚至可能加剧,胰腺β细胞疲劳,2型糖尿病发病机制的一个关键特性;因此,策略,以防止或逆转,β细胞失败应该积极寻求。丝氨酸苏氨酸激酶Akt监管的关键作用β细胞内稳态;Akt调节器中,一个中心所扮演的角色是pleckstrin同源域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶(PHLPP)的家庭。,利用一个慢性暴露于高先进糖葡萄糖的体外模型,我们表明PHLPPs,尤其是第二个家庭成员叫PHLPP2涉及胰腺的能力β细胞处理葡萄糖毒性。我们发现INS-1鼠胰腺β细胞系维持12 - 15章节在高(30毫米)葡萄糖浓度(INS-1 HG)显示增加PHLPP2 PHLPP1在mRNA和蛋白的表达水平比INS-1维持相同数量的段落的正常血糖水平(INS-1 NG)。这些变化是通过减少并行的一种蛋白激酶的磷酸化和增加表达凋亡和自噬的标记。调查如果PHLPPs有休闲的蚀变作用INS-1体内平衡观察慢性暴露在高葡萄糖浓度,我们利用专门击倒PHLPPs shRNA技术。我们获得的概念验证证据证明调制PHLPPs表达可能有助于恢复健康β细胞群,减少表达PHLPP2/1伴随着赞成恢复平衡和凋亡因子的水平。总之,我们的数据提供初步支持未来的研究旨在识别药理治疗胰腺β-细胞的生存障碍PHLPPs调制器。他们还有助于阐明β细胞功能障碍,一个复杂而不能令人满意地现象的特点是中央使役动词在2型糖尿病的发病机制中的作用。
1。介绍
2型糖尿病(T2D)是一种复杂的疾病,所带来的异常的组合在生产和胰腺胰岛素的功能(1]。尽管经典这两个缺陷被认为是独立的实体,在过去的几十年里,它已成为明显的,他们有共同的发病的机制,不仅与胰岛素调节葡萄糖利用率从外围目标组织,而且自己的合成和分泌以及足够的维护β细胞质量(1- - - - - -3]。值得注意的是,虽然受损的胰岛素的行动在外围组织,所谓的“胰岛素抵抗”,仍相当恒定随着病情的发展,β细胞功能恶化随着时间的推移不断在糖尿病患者中,由于持续暴露在有害的因素,比如高葡萄糖浓度(葡萄糖毒性),游离脂肪酸水平增高(lipotoxicity)和促炎细胞因子(慢性炎症)2- - - - - -5]。此外,目前抗糖尿病的治疗不能停止,甚至可能加剧,胰腺β细胞疲惫;因此,尽管有前途的观察与分子属于最近介绍治疗类(6)、策略来防止或逆转,β细胞失败仍应积极寻求。有两个主要组件β细胞功能障碍在T2D:受损的胰岛素分泌和降低β电池质量。在成年人中,新β细胞形成低,实现和维护一个适当的质量主要是在严格监管的凋亡率(7]。丝氨酸苏氨酸激酶Akt,也被称为蛋白激酶B (PKB)监管的关键作用β细胞内稳态。Akt存在于三个亚型在他们的领域被认为是无法区分架构和上游调节但nonredundant表达模式和生物功能(8,9]。具体地说,所有三个亚型已发现在胰腺β肽;研究在淘汰赛小鼠模型表明Akt1调节为主β细胞生存,Akt2需要调节胰岛素分泌的反应,而Akt3损失没有出现明显改变β细胞质量或函数(9]。三个Akt亚型序列磷酸化激活两个关键地点;第一残留的磷酸化,位于一段叫做激活循环(分别在Akt1/2/3苏氨酸308/309/307),触发网站的磷酸化位于羧基末端域,称为疏水磷酸化主题(丝氨酸分别于Akt1/2/3 473/474/472) [8]。我们和其他人已经报道减少Akt激活在接触glucotoxicity lipotoxicity和/或慢性炎症4,9- - - - - -14]。一种蛋白激酶抑制由由两个蛋白质磷酸酶去磷酸化:蛋白磷酸酶2 a作用于苏氨酸残基(15]和pleckstrin同源域富亮氨酸重复蛋白磷酸酶(PHLPP)家庭目标丝氨酸残基(16- - - - - -18]。PHLPP蛋白质似乎无所不在地表达,特别是高水平在大脑中,和他们的表达增加据报道在许多癌症细胞系,包括大脑肿瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和卵巢。PHLPP家族包含两个成员:PHLPP1,进而存在于两个剪接变体,(α和β),PHLPP2(也称为PHLPPL)。三个同功酶共享域结构非常相似,但有一定程度的底物特异性,与PHLPP1优先针对Akt2和3和向Akt1 PHLPP2显示更高的亲和力和3 (18]。几年前,我们展示了PHLPP1表达增加脂肪组织和骨骼肌活检肥胖,胰岛素抵抗主题和假设PHLPPs可能代表一个额外的球员在胰岛素抵抗[14]。在这里,我们调查如果PHLPPs可能与胰腺癌的能力β细胞处理慢性暴露在高葡萄糖浓度在体外模型。我们也旨在获得概念验证证据表明调制PHLPPs表达可能有助于恢复健康β细胞团块。
2。方法
2.1。细胞培养和Adenoviral感染
大鼠胰腺β肽线路维持在37°C公司为5%212 - 15章节的RPMI 1640细胞培养基(Sigma-Aldrich、米兰、意大利),补充了50μ米β巯基乙醇,10%胎牛血清(卷/卷),和1%(卷/期)青霉素和链霉素(19,包含11.1毫米(INS-1 NG)或30毫米(INS-1 HG)葡萄糖。Adenoviral进行感染,如前所述20.]孵化50 - 60% INS-1 HG倾注越来越多的融合1:1的混合物含有Ad-U6-rat-PHLPP1-shRNA和Ad-U6-rat-PHLPP2-shRNA(病毒效价3.7×1010空斑形成单位/毫升,向量生物系统,莫尔文,美国宾夕法尼亚州)或Ad-U6 scrambled-shRNA (mock-infected控制细胞)7小时30分钟。细胞被洗删除病毒和serum-starved或保持新鲜完整的生长介质48小时,这取决于特定的实验需求。
2.2。总RNA提取和实时逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
总RNA提取INS-1 NG和INS-1 HG使用试剂盒(生活技术,马里兰州),反向转录和分析使用权力SYBR RT-qPCR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司,培育城市,CA)。结果归一化β肌动蛋白水平根据Livak方法,如前所述[21- - - - - -23]。引物序列可按照客户要求定制。
2.3。胰岛素刺激和免疫印迹分析
评估刺激蛋白质磷酸化,INS-1 serum-starved 48小时FBS-free介质包含牛血清白蛋白在适当的浓度和葡萄糖;人类胰岛素(10−7米)当时说,当表示,7分钟前细胞溶菌作用在一个缓冲区包含NP-40 1.5%。免疫印迹细胞溶解产物进行了处理和分析,根据先前建立的方法(14,20.]。自制主要抗体生成和验证的研究小组(14)是用来检测PHLPP1水平;anti-PHLPP2抗体来自Abcam(英国剑桥)。以下主要抗体购买从细胞信号技术(美国马丹弗斯):anti-Bad, anti-Bcl-xL, anti-cleaved caspase-3, anti-LC3-II, anti-total磷Akt, anti-total和磷FoxO1 anti-total和磷mTor。证实了平等蛋白质加载reblotting单克隆抗体的膜β肌动蛋白(Sigma-Aldrich;意大利米兰);p-Akt / Akt, p-FoxO1 / FoxO1, pmTor / mTor比率计算分析相对磷酸化水平。光密度分析使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。
2.4。胰岛素分泌试验
INS-1细胞被播种在24-multiwell 10板的密度5细胞/在生长介质包含11.1毫米或30毫米葡萄糖,是合适的。20小时在胰岛素分泌试验之前,细胞变成了包含5毫米葡萄糖的培养基;中被取代glucose-free克雷布斯磷酸盐缓冲2小时。INS-1当时在孵化中葡萄糖浓度增加新鲜柠檬酸缓冲了20分钟。手机媒体被移除和稀释来评估胰岛素浓度与特定的鼠胰岛素Elisa测定(Mercodia,乌普萨拉,瑞典)。
2.5。统计分析
所有计算结果意味着褶皱变化(±SD)合适的控制点。统计学生的差异进行评估t测试或方差分析表示。一个值≤0.05被认为是具有统计学意义。分析与8.2.0 GraphPad棱镜版本软件(美国圣地亚哥,CA)。
3所示。结果
3.1。长期暴露在高葡萄糖浓度结果PHLPP2和PHLPP1表达显著增加
模仿慢性暴露于高葡萄糖水平,我们培养INS-1鼠胰腺β肽在30 mM葡萄糖12 - 15章节(INS-1 HG)。这种葡萄糖浓度,有效地诱导葡萄糖毒性在胰腺β细胞行要求培养基含有11.2毫米葡萄糖的正常生长(24]。相比INS-1细胞维持相同数量的段落在正常葡萄糖浓度(INS-1 NG), INS-1 HG的功能明显受损,降低胰岛素为代表的mRNA水平(图1(一),n= 6, ,INS-1 HG vs INS-1 NG)和分子阻碍胰岛素分泌(图1 (b),n= 4, ,通过双向方差分析的分泌曲线INS-1 HG vs INS-1 HG)。此外,pro -之间的平衡和凋亡Bcl家族蛋白表达改变出现在INS-1 HG(数字1 (c)和1 (d),n= 4, ,INS-1 HG vs INS-1 NG)。凋亡通路的激活INS-1 HG也提出了水平的提高裂解caspase-3(数字1 (c)和1 (d),n= 10, ,INS-1 HG vs INS-1 NG)。此外,我们观察到LC3-II蛋白的双重增加,暗示了一个更高的自噬途径的激活INS-1 HG细胞相比INS-1 NG(数字1 (c)和1 (d),n= 6, ,INS-1 HG vs INS-1 NG)。
(一)
(b)
(c)
(d)
这些功能的变化被显著增加平行PHLPP2表达式在mRNA(图2(一个)+ 320±35%, ,INS-1 HG vs INS-1 NGn=(图5)和蛋白质水平2 (b)+ 245±25%, ,INS-1 HG vs INS-1 NG,n= 4)INS-1 HG相比INS-1 NG。相似,但不明显,变化观察PHLPP1表达式,显示250±22%增加mRNA水平(图2(一个),INS-1 HG vs INS-1 NG,n增加= 5)和132±20%蛋白质水平(图2 (b),INS-1 HG vs INS-1 NG,n= 4)。
(一)
(b)
(c)
一种蛋白激酶激酶(自PHLPP脱去磷酸和灭活16- - - - - -18),我们评估了一种蛋白激酶磷酸化激活循环残渣,Ser473,直接PHLPPs的目标。如图2 (c)、基底和刺激一种蛋白激酶磷酸化对Ser473减少INS-1 HG相比INS-1 NG(上面板,p= 0.049为基底INS-1 HG vs基底INS-1 NG;刺激INS-1 HG vs刺激INS-1 NG,n= 6)。有趣的是,我们观察到轻微的,不重要,减少总Akt的表达式在INS-1 HG(图2 (c)中间面板)。减少刺激一种蛋白激酶磷酸化时显著规范化考虑总Akt水平降低(图2 (c), ,刺激INS-1 HG vs刺激INS-1 NG,n= 6)。
3.2。感染成分结构对PHLPP2/1导致显著降低两个同功酶的表达
调查如果PHLPPs有休闲的蚀变作用INS-1体内平衡观察慢性暴露在高葡萄糖浓度,我们利用shRNA技术特别是混战PHLPPs,雇佣之前验证协议(20.]。我们选择同时表达下调两PHLPP家庭成员,因为的表达都出现在慢性暴露在高葡萄糖浓度增加,特别是减少只有一个同工酶可能诱导补偿超表达的同源蛋白质,混淆数据解释。为此,我们采用包含两个运载体编码的混合成分对PHLPP1或反对PHLPP2 1: 1的比例。我们最初剂量的剂量反应曲线,观察到执行至少4.5×105空斑形成单位被要求不断降低PHLPP2水平;这个剂量加倍,我们得到一个几乎完全PHLPP2降低(图3(一个), ,相比mock-infected INS-1 HG细胞)。然后我们测试如果这两个浓度导致PHLPP1表情抑制和观察PHLPP1水平降低15% 4.5×105空斑形成单位( )和减少了85% 9×105空斑形成单位剂量( )(图3 (b))。更高的病毒剂量导致显著的细胞生存能力和快速减少;所有后续实验从而进行上述数量将被称为低剂量(AV-LD)和高剂量(AV-HD)。
(一)
(b)
3.3。shRNA-Mediated PHLPP2和PHLPP1混战恢复INS-1 HG中的胰岛素信号
接下来,我们评估如果INS-1 HG感染AV-LD或AV-HD PHLPPs表达式的减少导致恢复一种蛋白激酶信号通路的激活胰岛素刺激。我们观察到,刺激一种蛋白激酶磷酸化水平高出1.39和1.45折INS-1 HG AV-LD INS-1 HG AV-HD,分别比mock-infected控制INS-1 HG ( ,对于INS-1 HG AV-LD vs mock-infected INS-1 HG和对于INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 4,图4(一))。增加一种蛋白激酶磷酸化水平反映出显著增加刺激两个一种蛋白激酶的磷酸化底物,建议在具体的规定中起着关键作用β细胞功能:FoxO1转录因子(对于INS-1 HG AV-LD vs mock-infected INS-1 HG和对于INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 3,图4 (b))和mTor激酶(对于INS-1 HG AV-LD vs mock-infected INS-1 HG和对于INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 35(图4 (b))。
(一)
(b)
shRNA-mediated PHLPP2和PHLPP1混战凋亡因子的平衡,减少重新确立自噬途径的激活。
我们因此评估如果PHLPPs水平降低和Akt的恢复激活信号通路导致改善细胞的可行性。为此,我们测量不良和Bcl-xL表达和观察到pro /凋亡因素平衡使恢复原状在INS-1 AV-LD和INS-1 HG AV-HD相比mock-infected INS-1 HG坏:(对于INS-1 HG AV-LD vs mock-infected INS-1 HG和对于INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 4,Bcl-xLINS-1 HG AV-LD和INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 3,图5(一个))。根据这些结果,我们也观察到显著降低INS-1 caspase-3乳沟HG感染AV-LD或AV-HD (对于INS-1 HG AV-LD vs mock-infected INS-1 HG和对于INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 4)。值得注意的是,虽然与AV剂量越高获得的效果是更高的级Bcl蛋白质表达而言,INS-1 HG AV-LD显示半胱天冬酶活性低于细胞感染AV剂量越高;这可能反映了PHLPP-independent效果和有关AV本身(图5 (b))。恢复prosurvival概要文件不是减少LC3-II表达式(INS-1 HG AV-LD和INS-1 HG AV-HD vs mock-infected INS-1汞、n= 5,数据5(一个)和5 (b))。
(一)
(b)
shRNA-mediated PHLPP2和PHLPP1混战是不足以恢复胰岛素mRNA水平或分子生物学胰岛素分泌。
我们评估如果PHLPPs混战也导致恢复INS-1 HG的功能。我们因此测量INS-1 mRNA表达水平实时rt - pcr和细胞中没有观察到显著增加感染既AV剂量相比mock-infected细胞(图6(一),n= 3)。同样,分子生物学胰岛素分泌受损在撞倒了细胞中的胰岛素释放反应增加葡萄糖浓度之间没有不同INS-1 HG AV-LD, INS-1 HG AV-HD, mock-infected INS-1 HG(图6 (b),n= 4)。
(一)
(b)
4所示。结论
在目前的研究中,我们报告改变胰腺癌β细胞内稳态观察慢性暴露于30 mM葡萄糖是平行的,增加PHLPPs的表达式,由此减少了磷酸化水平的主要目标,丝氨酸苏氨酸激酶激酶。有趣的是,推倒PHLPPs,贯穿adenoviral-mediated shRNA交付,我们能够恢复prosurvival概要INS-1 HG细胞长期暴露于高葡萄糖水平。具体来说,坏proapoptotic因素及其之间的比例prosurvival对应Bcl-xL回到价值以健康INS-1 NG细胞。坏的水平被认为是直接由Akt通路(25),事实上,我们观察到显著增加一种蛋白激酶的磷酸化和主要凋亡效应FoxO126在INS-1 HG感染adenoviral构造编码对PHLPP2和PHLPP1特定成分序列。另一个Akt的刺激激活基质mTor也显著改善PHLPPs表达式时被撞倒了。mTor感官营养可用性和调节细胞内稳态,有人建议,其损失损害β肽内稳态以及胰岛素敏感性在外围组织27]。mTor控制的细胞内过程中,自噬作为获得关注可能在胰腺癌的生存β肽与冲突的数据显示,在不同的实验模型,支持或自噬途径的激活增加凋亡的影响(28- - - - - -30.]。在我们的模型中,恢复prosurvival概要文件不是一个自噬LC3-II标志的表达减少,支持假说的负面影响歧化激活自噬通路在细胞的生存。
与恢复细胞生存资料,高效的分子生物学胰岛素分泌和合成被INS-1 HG感染未恢复运载体携带对PHLPP2/1 shRNA序列。据报道,Akt亚型在胰腺有不同的作用β肽,Akt1主要控制细胞生存和Akt2主要参与胰岛素分泌的调节9),它也被建议PHLPP家庭成员拥有选择性偏好向Akt亚型,PHLPP2似乎更喜欢Akt1和PHLPP1支持Akt2,即使这可能取决于(主要表达了衬底对碘氧基苯甲醚17,18]。因为我们获得了一个几乎完全沉默PHLPP2 INS-1细胞感染adenoviral最高浓度(INS-1 HG AV-HD),最大减少PHLPP1达到65%左右时,它可能会假设Akt2函数,因此胰岛素分泌和合成,更有效地恢复。观察,观察无显著差异时比较INS-1 HG AV-HD,表示45%的PHLPP1对mock-infected INS-1 HG,与细胞感染adenoviral效价较低水平PHLPP1 85%左右的观察到在模拟INS-1 HG (INS-1 HG AV-LD),使这个解释很不可能,而是指向葡萄糖毒性可能更深刻的伤害的可能性β细胞功能比β细胞生存,造成损耗的胰岛素存款,可能不会恢复短期改善Akt激活(31日,32]。事实上,我们相信,任何试图恢复β细胞内稳态的在活的有机体内设置不应忽视的机制调节之间的重要区别β这些调节特定细胞质量和β细胞胰岛素合成和分泌等功能。缺乏INS-1 HG AV-LD之间的显著差异和INS-1 HG AV-HD细胞对于大多数功能和分子分析也表明,读出PHLPP2可能发挥关键作用比同源蛋白质,PHLPP1,失调的β细胞的生存。我们的数据从而一小块知识有助于理解PHLPP特定功能的家庭成员和探索机制调节自己的表情越少(18,33]。有趣的是,几年前,我们和其他人显示特定的PHLPP1增加,用一成不变的PHLPP2水平,在脂肪组织和骨骼肌活检的肥胖,胰岛素抵抗个体(14,34];这些数据已经被Behera最近证实等人在高脂肪喂养动物模型35]。在这里,我们报告一个显著增加的同功酶在暴露在高葡萄糖浓度;然而,PHLPP2显示更大更统计的声音变化。shRNA-mediated抑制实验的结果证实了一种卓越的PHLPP2在胰腺的规定β肽体内平衡。
此外,在年长的研究中,我们没有观察到任何直接联系PHLPP1表达和葡萄糖水平,而代理的表情似乎胰岛素水平增加。相比之下在目前的研究中,PHLPPs水平在高葡萄糖浓度增加,即使我们的数据不允许建立如果葡萄糖能够直接促进PHLPP转录或转导或如果PHLPP蛋白质含量的增加是由间接机制(14]。尽管如此我们的结果背后,PHLPPs具有特异性,迄今尚未完全探索在不同的组织,可能不同的监管。澄清这一点是强制性的为了尽可能利用这些磷酸酶药理的目标。
总之,我们的数据提供初步支持未来的研究旨在识别药理治疗胰腺β-细胞的生存障碍PHLPPs调制器。他们还有助于阐明β细胞功能障碍,一个复杂而不能令人满意地现象的特点是中央使役动词在2型糖尿病的发病机制中的作用。
数据可用性
所有数据用来支持这个研究的发现包括在手稿中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。
确认
本研究支持EFSD / NovoNordisk 2005/6格兰特M.L.H.和由意大利大学授予2015 mpesjs_006 9