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特殊的问题

胰岛素抵抗、肥胖和代谢综合症:常见的炎症通路导致2型糖尿病

把这个特殊的问题

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体积2019年| 文章的ID5219782| https://doi.org/10.1155/2019/5219782

miR-29a消极地影响分子通过Cdc42 /胰岛素分泌和MIN6细胞增殖β连环蛋白信号

京段 ,¹ Xian-Ling钱 ,¹ 小君李 ,¹ Xing-Hua肖,¹ Xiang-Tong陆,² Lin-Chen Lv ,¹ 云黄 ,¹ 温叮,¹ 鸿雁张 ,³ 和Li-Xia熊 ¹

客座编辑: Arcidiacono比亚

收到了 2019年3月25日

接受 2019年6月13日

发表 2019年8月28日

文摘

背景。糖尿病是一种进步的代谢性疾病,其特征是高血糖。胰岛的功能障碍β不同程度的细胞可以发生。这种障碍最初可以补偿由增殖和代谢的变化β细胞。细胞分裂控制蛋白质42 (Cdc42)和微(microRNA) miR-29有重要的作用β细胞增殖和分子生物学胰岛素分泌(GSIS),我们进一步探讨使用鼠标MIN6胰岛瘤细胞系。方法。Upregulation miR-29a和Cdc42差别和对这些实现使用瞬时转染。miR-29a和Cdc42表达被实时聚合酶链反应和免疫印迹检测。MIN6细胞增殖检测使用细胞计数设备试验。GSIS high-glucose下(20.0毫米)或basal-glucose(5.0毫米)的刺激被酶联免疫吸附试验检测。Cdc42 miR-29a结合位点的mRNA 3′未翻译区(UTR)确定使用生物信息学和荧光素酶记者化验。结果。miR-29a过度抑制扩散( )和GSIS high-glucose刺激( )。Cdc42过度推广扩散( )和GSIS high-glucose刺激( )。miR-29a过度降低Cdc42表达式( ),而增加Cdc42差别miR-29a对这些基因的表达( )。结果表明,Cdc42 mRNA 3′utr miR-29a的直接目标在体外。此外,Cdc42逆转miR-29a-mediated抑制增殖和GSIS ( )。此外,miR-29a抑制β连环蛋白表达( ),而Cdc42提升β连环蛋白表达( )。结论。负调节Cdc42和下游分子β连环蛋白,miR-29a抑制MIN6扩散和胰岛素分泌。

1。介绍

糖尿病是一种进步的代谢性疾病,其特征是高血糖,这是全球第三个最常见的慢性疾病,癌症和心血管疾病(后1,2]。糖尿病的发病机理的基础上,它可以分为1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)病人体内(3]。T1DM的特点是autoimmune-induced损失β胰腺细胞,导致胰岛素分泌不足或胰岛素缺乏完整4]。2型糖尿病是由遗传、环境、行为、和其他风险因素,它的特点是高血糖、胰岛素抵抗,胰岛素相对不足(5]。在T1DM和2型糖尿病的发展,胰岛的功能障碍β细胞可以发生不同程度(6]。这种障碍最初可以补偿β细胞增殖和代谢的变化。然而,随着病情的发展,胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌减少持续下降,最终导致不可逆转的故障。因此,研究胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌具有重要意义。

据报道,这两个小岛β血糖升高条件下细胞自我复制和转换的小岛α细胞β细胞可能会增加胰岛的数量β细胞(7- - - - - -9]。在β细胞,葡萄糖可以调节胰岛素分泌过程称为分子胰岛素分泌(GSIS) [10]。GSIS能保持血糖水平在生理范围内,其中包括运输的葡萄糖β通过质膜细胞葡萄糖转运蛋白,其次是转换的葡萄糖glucose-6-phosphate和Ca的后续上涨^{2 +}和代谢耦合因素如ATP,谷氨酸,NADPH, monoacylglycerol从糖酵解或线粒体代谢11,12]。GSIS由两个阶段组成:快速瞬态第一阶段和缓慢而持久的第二阶段。两阶段涉及积极动员的胰岛素分泌颗粒从细胞质到质膜,要求小GTP-binding蛋白质被称为小GTPases-mediated肌动蛋白细胞骨架重塑(12- - - - - -14]。

小分子核糖核酸(microrna)短的长度大约22-nt,非编码rna的转录后基因表达被认为是重要的调控作用[15]。迄今为止,人类基因组编码2000多microrna,参与多种生理和病理过程(16]。microrna充当压抑mRNA翻译或负调控因子导致转录后信使rna降解,所以microrna的表达异常干扰许多生理和病理过程(17]。发现了许多microrna参与糖尿病和胰岛素抵抗的发病机制,影响胰岛的功能β细胞(18,19]。miR-29a是其中一个最丰富的microrna的表达β老鼠和人类胰腺细胞,许多研究表明upregulation miR-29a的糖尿病模型(20.- - - - - -22]。它属于miR-29家族是由三个密切相关的前兆:miR-29a, miR-29b1,和miR-29b2(这是相同的但由两个截然不同的前体干细胞序列编码),和miR-29c23]。成熟的序列miR-29家庭成员是守恒的人类,老鼠,老鼠,和调节基因表达的种子序列通过绑定到目标mrna, AGCACC,也是相同的20.]。miR-29a报道发挥负监管作用在人类和小鼠胰岛胰岛素分泌β细胞,miR-29a过度降低GSIS水平在体外(24]。相反,它也被报道,miR-29a积极调节胰岛素分泌在活的有机体内(20.]。因此,GSIS miR-29a的作用需要进一步研究。

细胞分裂控制蛋白质42 (Cdc42)是一个小gtpase(ρ家族的成员25),它扮演着一个重要的角色在第二阶段GSIS [26,27]。已经证实,Cdc42克隆胰岛中可以找到β细胞,正常小鼠胰岛细胞,和正常人类胰岛细胞,局部胰岛素分泌颗粒(28]。在生理条件下,葡萄糖调节肌动蛋白细胞骨架重排和刺激胰岛素分泌,调节Cdc42-GDP之间的转换(不活跃)和Cdc42-GTP(主动)29日]。Salunkhe等人发现,粘着斑激酶(FAK)的磷酸化,磷酸化Cdc42葡萄糖刺激下,扰乱了f -肌动蛋白屏障,允许在胰岛胰岛素分泌颗粒重新分配β细胞,从而促进胰岛素分泌(30.]。也被报道,Cdc42介导胰岛素分泌颗粒通过PAK1-Raf-1运输和胰岛素分泌/ MEK / ERK通路(31日]。此外,Cdc42-PAK1-Rac1已被证明在胰岛素胞外分泌发挥监管作用,也可能在肌动蛋白重塑中发挥作用和胰岛素颗粒动员(32]。这些研究表明,在GSIS Cdc42有重要的作用。

β连环蛋白是转录因子,主要是被称为一个关键组成部分规范化Wnt信号通路调节细胞增殖(33,34]。激活Wnt信号抑制ubiquitin-mediated蛋白酶体降解β连环蛋白,从而导致β连环蛋白积累。随后,β连环蛋白把细胞核形成一个转录活跃的复杂与t细胞因子(TCF)和淋巴增强因子,促进扩散基因的转录,如原癌基因(35,36]。β连环蛋白还可以调节信息胰腺之间的附着力β细胞通过与钙粘着蛋白形成复合物,这是重要的正确调节胰岛素的释放(37- - - - - -39]。新兴的证据表明upregulationβ连环蛋白蛋白在糖尿病条件下,高血糖可以促进的易位β连环蛋白(40,41]。

在人类非小细胞肺癌的一项研究中,miR-29a过度导致显著抑制Cdc42蛋白表达,而Cdc42 mRNA表达持平(42]。在胃癌,miR-29a抑制Cdc42表达蛋白质和RNA水平(43]。此外,miR-29a抑制神经胶质瘤的入侵目标Cdc42 [44]。此外,在乳腺癌,Cdc42负调节p53,和针对Cdc42和miR-29a积极调节p53,值得注意的是,由负调节Cdc42 miR-29a抑制胰岛素分泌,P85 [45]。Cdc42也被认定为直接目标的miR-29a鼠标使用荧光素酶报告实验(破骨细胞46]。很多研究已经证实β连环蛋白可以调节的下游分子Cdc42 [47- - - - - -49]。因此,在胰岛miR-29a所扮演的角色β细胞增殖和GSIS可能通过与Cdc42 /交互β连环蛋白信号。

当前研究的目的是探讨miR-29a和Cdc42胰岛的影响β细胞增殖和GSIS使用MIN6细胞,识别miR-29a / Cdc42 /的效果β连环蛋白在这些细胞信号级联。结果表明,在GSIS miR-29a扮演一个消极的监管作用,MIN6细胞增殖,而Cdc42起着积极的监管作用。和miR-29a消极地影响GSIS MIN6细胞增殖通过抑制Cdc42 /β连环蛋白信号通路。

2。材料和方法

2.1。细胞系和文化

得到鼠标胰岛瘤细胞系MIN6 BoGu生物技术有限公司(上海,中国)。High-glucose (4500 mg / L)杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)从Hyclone购买(美国UT Logan)。胎牛血清(的边后卫)购买了从生物产业(美国CT克伦威尔)。MIN6细胞保持在high-glucose DMEM补充12%的边后卫,10μl / lβ巯基乙醇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100 U /毫升青霉素,100μg链霉素混合物(Solarbio,北京)37°C的5%股份₂。

2.2。瞬时转染

5.5×10⁵MIN6细胞接种在6-well板和孵化24小时在DMEM培养基。20μ米决赛miR-29a模拟浓度、抑制剂-控制(数控;miR-29a NC),合成Cdc42-pcDNA3.1吉玛有限公司(上海,中国)。核片段(siRNA - 497、siRNA - 569和siRNA - 643)和一个NC-siRNA片段也从杰玛有限公司获得寡核苷酸和质粒进行转染使用Lipofectamine 2000 (Gemma有限公司)。Opti-MEM从Gibco购买公司(美国纽约大岛)。首先,100 pmol siRNA添加到200年μl Opti-MEM轻轻地和混合。其次,200年μl Opti-MEM被用来稀释5μl lip2000试剂。这是混合后在室温下保持5分钟。那时lip2000试剂稀释剂添加到siRNA稀释剂在室温20分钟siRNA-lip2000复杂形式。取而代之的是无血清培养基中,加入一定量siRNA-lip2000复杂孔隙含有细胞和介质。荧光和细胞状态6小时后观察。血清中提取和介质是补充道。寡核苷酸的序列如表所示1。转染24 - 48 h后,MIN6细胞用于以下实验。

2.3。实时聚合酶链反应(rt - pcr)

当细胞confluency达到75%,miR-29a模仿,miR-29a抑制剂,和miR-29a-NC NC-siRNA sirna - 497, sirna - 569和sirna - 643分别是暂时性的转染到MIN6细胞。36小时后,总RNA提取MIN6细胞总RNA分离试剂使用(美国GAω,Norcross)根据制造商的指示。2μl PrimeScript缓冲区,0.5μ0.5 l随机6事情μl低聚糖dT底漆,0.5μl 1×PrimeScript RT酶混合,0.5μl gene-specific底漆,10μ自由ddH l核糖核酸酶₂啊,500 ng总RNA被添加为反转录系统做准备。然后,逆转录在37°C进行了15分钟,5秒后在85°C,这台机器是维持在4°C(使用gene-specific引物时,第一步逆转录反应条件改变了42°C 15分钟)。rt - PCR进行与ABI StepOnePlus实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。0.4μ0.4 l的底漆,μl(反向引物,10μ0.4 l的结核病绿色预混料Taq交货μl 50×火箭参考染料,2μ6.8 l的模板,μl (ddH₂20 O被添加到表单μl总反应的系统。混合后,18μl总反应系统和2μl cDNA被添加到每个毛孔。反应混合物在95°C孵化了30年代紧随其后40周期的5 s在95°C和30年代60°C。2^−ΔΔCT方法被用来计算相对基因表达的差异。

2.4。免疫印迹分析

瞬时转染MIN6细胞confluency达到75%时,执行和蛋白质提取后进行了40个小时。Cdc42-pcDNA3.1、Cdc42-siRNAs miR-29a模仿,miR-29a抑制剂,miR-29a-NC暂时性的转染到细胞。蛋白质在电泳SDS-polyacrylamide叠加凝胶凝胶组成的5%和12%的分离胶(Solarbio)。首先,15μg蛋白添加到每个插槽。蛋白质分离后,他们被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国默克密理博,Billerica的)在200毫安1小时15分钟。接下来,5%脱脂牛奶(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)被用于2 h阻塞。然后,孕育了PVDF膜在一夜之间在4°C稀释(1:1000)主要抗体(美国Cdc42抗体,Abcam、剑桥、马;β连环蛋白,亲和力生物制剂,上海,中国;和β肌动蛋白,Zhongshanjinqiao公司,北京)。随后,细胞膜是孵化为1.5 h与稀释在室温下(1:5000)二级抗体(HPR-labeled anti-rabbit免疫球蛋白的山羊,HPR-labeled anti-rat山羊免疫球蛋白;两人都从Zhongshanjinqiao公司购买)。最后,蛋白质被发现使用一个EasySee免疫印迹工具包(TransGen生物技术,北京),凝胶成像系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.5。细胞增殖实验

进行细胞增殖试验使用细胞计数工具包(CCK;Cdc42-pcDNA3.1 TransGen)后,cdc42 -核- 643,miR-29a抑制剂+ cdc42 -核- 643,miR-29a模仿+ Cdc42-pcDNA3.1暂时分别转染成MIN6细胞。96 -孔板MIN6细胞孵化24 h。接下来,10μ和90 l CCK的解决方案μl high-glucose (4500 mg / l) DMEM被添加到细胞。细胞被放置在一个孵化器在37°C 1 h前评估。光密度在450 nm (OD_450年)24、48和72 h测量使用SpectraMax范式酶标签装置(分子设备有限责任公司,桑尼维尔,美国),和相应的细胞生长曲线绘制。

2.6。胰岛素分泌试验

40 h的转染后,每组中移除,细胞被分成两个子组。接下来,1毫升Krebs-Ringer碳酸氢盐玫瑰(KRBH PanEra,广州,中国)缓冲区添加到每个好,混合物是孵化1 h。此后,KRBH缓冲区被包含5.0或20.0毫米和1毫升KRBH葡萄糖(Solarbio)添加到子组分别为1 h。胰岛素的水平被检测到酶联免疫吸附试验(ELISA)使用胰岛素的酶联免疫试剂盒(Cloud-Clone Corp .)、武汉、中国)根据制造商的指示。

2.7。荧光素酶报告分析

miR-29a绑定网站Cdc42 mRNA 3′utr被确定在一个生物信息学分析(Gemma有限公司)和荧光素酶记者分析。首先,整个不变异3′未翻译区(UTR) Cdc42基因克隆到一个pGL3-Basic向量(Gemma有限公司)网站立即荧光素酶基因的下游。第二,Cdc42 3′utr与诱变突变工具包(美国WI Promega,麦迪逊)和类似克隆成pGL3-Basic向量。1×10⁵MIN6细胞被播种到6-well盘子和培养24小时。接下来,这些细胞被cotransfected 2.5μ克的pGL3-Basic向量,和2.5μ克miR-29a或miR-29a-NC使用Lipofectamine 2000 (Gemma有限公司)。在转染后48小时,细胞溶解产物是准备使用荧光素酶检测缓冲区二世和荧光素酶活性测定使用荧光素酶检测系统(Promega)。实验进行了一式三份。

2.8。统计分析

统计分析了使用棱镜6(美国GraphPad软件,圣地亚哥,CA)或SPSS 17.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。所有数据提出了均值±标准差(SD)。单向方差分析(方差分析)和学生的t以及被用来评估群体之间的差异。和被认为是统计学意义和高度统计学意义,分别。

3所示。结果

3.1。miR-29a对MIN6细胞的影响

3.1.1。转染效率miR-29a模仿和抑制剂

为了确保后续miR-29a-related实验的有效性,我们确定的转染效率miR-29a模仿和抑制剂。miR-29a mRNA转录水平显著增加miR-29a模仿组相比miR-29a-NC集团( )并显著降低miR-29a抑制剂组( )(图1(一))。这些结果表明成功的转染。

(一)

(b)

(c)

(d)

图1

miR-29a对MIN6细胞的影响。(一)miR-29a模仿和抑制剂miR-29a信使rna的影响。rt - pcr检测miR-29a mRNA表达与miR-29a瞬时转染后模仿和抑制剂(n= 3)。 ,与miR-29a NC组相比,评估学生的配对t以及。(b) miR-29a对MIN6细胞增殖的影响。CCK化验检测转染后增殖与miR-29a模仿和抑制剂(n= 3)。 ,与miR-29a NC组相比,由单向方差分析评估,紧随其后的是费舍尔最显著差异测试。(c和d)通过MIN6细胞miR-29a对胰岛素分泌的影响。ELISA检测胰岛素分泌水平MIN6细胞瞬时转染后miR-29a模仿和抑制剂basal-glucose(5.0毫米)和high-glucose(20.0毫米)刺激(n= 3)。 ,与5.0毫米葡萄糖组相比,和 ,与miR-29a-NC组相比,评估学生的配对t以及。数据显示为平均数±标准差。NC:消极的控制。

3.1.2。miR-29a MIN6细胞增殖产生负面影响

确定miR-29a在MIN6细胞增殖的影响,我们增加和减少miR-29a表达式使用miR-29a模仿和抑制剂,分别检测增殖率在24,48和72 h。CCK结果表明没有明显差异之间的增殖率miR-29a NC组和miR-29a模仿和抑制剂组24 h后。相比之下,miR-29a模拟组织的增殖率显著下降后48 h ( )和72 h ( ),和增殖率miR-29a抑制剂组显著增加后48 h ( )和72 h ( )(图1 (b))。这些结果表明,miR-29a MIN6细胞增殖产生负面影响。

3.1.3。由MIN6细胞胰岛素分泌miR-29a负面影响

识别由MIN6细胞miR-29a对胰岛素分泌的影响,我们增加和减少miR-29a表达式使用miR-29a模仿和抑制剂,分别检测胰岛素分泌水平葡萄糖刺激后5.0和20.0毫米。ELISA结果显示miR-29a过度抑制胰岛素分泌high-glucose刺激下( )(图1 (c)促进胰岛素分泌差别),miR-29a对这些high-glucose刺激下( )(图1 (d))。无论miR-29a上涨或下调,没有对胰岛素分泌的影响下basal-glucose刺激(数字1 (c)和1 (d))。这些结果表明,在GSIS miR-29a扮演一个消极监管的作用,但不是在胰岛素分泌生理血糖水平。

3.2。Cdc42对MIN6细胞的影响

3.2.1之上。转染效率Cdc42-pcDNA3.1

为了确保后续Cdc42-related实验的有效性,Cdc42-pcDNA3.1瞬变转染进MIN6细胞,当细胞confluency达到75%,40小时后和蛋白质进行提取。免疫印迹结果表明Cdc42表达增加与Cdc42-pcDNA3.1转染后与表达式pcDNA3.1组( )(图2(一个))。这个结果表明成功的转染。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

图2

Cdc42对MIN6细胞的影响。(一)在MIN6细胞Cdc42-pcDNA3.1对Cdc42表达的影响。免疫印迹检测Cdc42蛋白表达与Cdc42-pcDNA3.1转染后(n= 3)。 ,与pcDNA3.1组相比,评估学生的配对t以及。(b和c)筛选Cdc42-siRNA碎片。(b) rt - pcr检测Cdc42 mRNA表达与不同的核碎片(瞬时转染后n= 3)。和 ,与siRNA-NC组相比,评估学生的配对t以及。(c)免疫印迹检测Cdc42蛋白表达与不同的核碎片(瞬时转染后n= 3)。 ,与siRNA-NC组相比,评估学生的配对t以及。(d) Cdc42对MIN6细胞增殖的影响。CCK化验检测MIN6细胞增殖与Cdc42-siRNA转染后和Cdc42-pcDNA3.1 (n= 3)。 ,与siRNA-NC组相比, ,与pcDNA3.1组相比,由单向方差分析评估,紧随其后的是费舍尔最显著差异测试。(e和f)通过MIN6细胞Cdc42对胰岛素分泌的影响。ELISA检测胰岛素分泌水平MIN6细胞瞬时转染后Cdc42-pcDNA3.1和Cdc42-siRNA basal-glucose(5.0毫米)和high-glucose(20.0毫米)刺激(n= 3)。 ,与pcDNA3.1组相比, ,与siRNA-NC组相比,和 ,与5.0毫米葡萄糖组相比,评估学生的配对t以及。数据显示为平均数±标准差。NC:消极的控制。

3.2.2。筛选Cdc42小核RNA)碎片

有效地减少Cdc42表达式,我们筛选三核碎片(siRNA - 497、siRNA - 569和siRNA - 643)来确定哪一个是最有效的。当细胞confluency达到75%,NC-siRNA sirna - 497, sirna - 569, sirna - 643是暂时性的转染到MIN6细胞。在每组,36小时后提取的总RNA。rt - pcr结果显示,Cdc42 mRNA表达显著降低转染后sirna - 497 ( )和核- 643 ( )相比之下,siRNA-NC组中表达。在四个组,sirna - 643组最低Cdc42 mRNA表达(图2 (b))。结果表明,核小干扰rna - 643 - 497和能更有效地减少Cdc42 mRNA表达比sirna - 569和sirna - 643可能的最佳干扰效果。

确定小干扰rna片段siRNA - 643是否最优,当细胞confluency达到75%,siRNAs瞬变转染到MIN6细胞,和蛋白质提取后进行了40个小时。免疫印迹结果表明Cdc42蛋白表达sirna - 569和sirna - 643组显著减少( )相比之下,siRNA-NC组中表达。在四个组,sirna - 643组最低(图Cdc42蛋白表达2 (c))。基于Cdc42 mRNA和蛋白表达水平,我们选择sirna - 643作为Cdc42-siRNA片段在后续的实验中使用。

3.2.3。Cdc42积极MIN6细胞增殖的影响

识别的影响Cdc42 MIN6细胞增殖,450海里的吸光度测量在24日,瞬时转染48和72 h后MIN6细胞Cdc42-pcDNA3.1和Cdc42 -核- 643,和相应的细胞生长曲线绘制。CCK结果显示没有明显的差异之间的增殖率Cdc42-pcDNA3.1和pcDNA3.1组,或cdc42 -核- 643和siRNA-NC组,24小时之后。相比之下,增殖率cdc42 -核- 643组显著减少后48 h ( )和72 h ( ),和增殖率Cdc42-pcDNA3.1组显著增加后48 h ( )和72 h ( )(图2 (d))。这些结果表明,Cdc42积极MIN6细胞增殖率的影响。

3.2.4。Cdc42积极影响通过MIN6细胞胰岛素分泌

识别由MIN6细胞Cdc42对胰岛素分泌的影响,我们使用的增加和减少Cdc42表达式Cdc42-pcDNA3.1 Cdc42 -核- 643,分别检测胰岛素分泌水平在5.0和20.0毫米通过测量葡萄糖刺激胰岛素分泌的数量在上层清液。ELISA结果显示Cdc42超表达促进胰岛素分泌high-glucose刺激下( )(图2 (e)抑制胰岛素的分泌在high-glucose差别),Cdc42对这些刺激( )(图2 (f))。无论Cdc42上涨或下调,没有对胰岛素分泌的影响下basal-glucose刺激(数字2 (e)和2 (f))。这些结果表明,在GSIS Cdc42扮演一个积极的监管作用,但不是在胰岛素分泌生理血糖水平。

3.3。影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞

3.3.1。miR-29a负面影响Cdc42蛋白表达

许多研究表明,Cdc42 mRNA的直接目标miR-29a在癌症恶化42- - - - - -46]。因此,我们假设miR-29a可以影响Cdc42在糖尿病进展的表达。识别的影响miR-29a Cdc42蛋白表达,我们是暂时性的转染miR-29a模仿,miR-29a抑制剂,和miR-29a-NC MIN6细胞,当细胞confluency达到75%,并提取蛋白质后每组40小时。免疫印迹结果表明,相比于Cdc42蛋白表达miR-29a NC组表达miR-29a模仿组显著减少( ),而表达式miR-29a抑制剂组显著增加( )(图3(一个))。这些结果表明miR-29a Cdc42蛋白表达有负面影响。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

图3

影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞。(一)miR-29a对Cdc42蛋白表达的影响。免疫印迹检测Cdc42蛋白表达与miR-29a转染后模仿和抑制剂(n= 3)。 ,与miR-29a NC组相比,评估学生的配对t以及。(b)的生物信息学分析miR-29a结合位点Cdc42 mRNA 3′utr。(c)荧光素酶记者化验表明,miR-29a结合Cdc42 mRNA在MIN6细胞。 ,相比之下,不变异Cdc42 3′UTR + miR-29a-NC集团作为评估学生的配对t以及。(d) miR-29a / Cdc42对MIN6细胞增殖的影响。CCK化验检测MIN6细胞增殖后同时过度miR-29a Cdc42,和后同步干扰miR-29a Cdc42表达式(n= 3)。 ,与miR-29a模仿组相比,和 ,与miR-29a抑制剂组相比,由单向方差分析评估,紧随其后的是费舍尔最显著差异测试。(e)的影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞胰岛素分泌。由MIN6细胞ELISA检测胰岛素分泌与miR-29a瞬时转染后模仿+ Cdc42-pcDNA3.1 miR-29a抑制剂+ Cdc42-siRNA high-glucose下(20.0毫米)刺激(n= 3)。 ,与miR-29a抑制剂组相比,和 ,与miR-29a模仿组相比,评估学生的配对t以及。数据显示为平均数±标准差。NC:负控制;mmu:鼠狐猴;3 p: mmu-miR-29a产生的3′末端的手臂miR-29a的双链;傻瓜:突变。

3.3.2。miR-29a结合位点Cdc42 mRNA 3′utr

基于miR-29a的负面影响Cdc42蛋白表达,为了证实Cdc42 mRNA的目标miR-29a, miR-29a绑定网站Cdc42 mRNA 3′utr识别在生物信息学分析和荧光素酶记者执行分析(数据3 (b)和3 (c))。生物信息学分析表明,Cdc42 mRNA 3′utr再次遭到miR-29a的互补序列(图3 (b))。荧光素酶记者化验表明,miR-29a模仿显著降低MIN6细胞的荧光素酶活性表达不变异Cdc42 mRNA 3′utr,但是它没有影响MIN6细胞的荧光素酶活性表达突变Cdc42 mRNA 3′utr(图3 (c))。这些结果表明,Cdc42 miR-29a信使rna是一种潜在的下游分子,和miR-29a / Cdc42轴可能参与糖尿病。

3.3.3。miR-29a / Cdc42对MIN6细胞增殖的影响

识别的影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞增殖,我们转染miR-29a抑制剂+ Cdc42 -核- 643和miR-29a模仿+ Cdc42-pcDNA3.1成MIN6细胞。450纳米的吸光度测量在24日,48岁和72 h瞬时转染后,相应的细胞生长曲线绘制。CCK结果表明48和72 h后,同时过度miR-29a和Cdc42逆转miR-29a模仿的效果MIN6细胞增殖抑制( )。同时干扰miR-29a和Cdc42表达逆转miR-29a抑制剂的影响关于MIN6细胞增殖推广( )(图3 (d))。这些结果进一步说明Cdc42 mRNA的下游分子miR-29a,表示miR-29a可以抑制MIN6细胞增殖的表达下调Cdc42表达式。

3.3.4。影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞胰岛素分泌

识别的影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞胰岛素分泌,我们是暂时性的转染miR-29a抑制剂+ Cdc42 -核- 643和miR-29a模仿+ Cdc42-pcDNA3.1 MIN6细胞,然后刺激他们KRBH包含20.0毫米葡萄糖1 h。上层清液的分泌胰岛素量是衡量ELISA。结果表明,同时过度miR-29a和Cdc42逆转miR-29a模仿对于胰岛素分泌抑制的影响( ),同时干扰miR-29a和Cdc42表达逆转miR-29a抑制剂的影响对促进胰岛素分泌high-glucose刺激下( )(图3 (e))。这些结果进一步表明,miR-29a可以抑制胰岛素分泌MIN6细胞high-glucose刺激下表达下调Cdc42表达式。

3.4。miR-29a Cdc42 /β连环蛋白是一个潜在的信号级联MIN6细胞

许多研究已经证明,β连环蛋白表达可以由Cdc42 [47- - - - - -49]。因此,我们假设β连环蛋白的下游分子miR-29a / Cdc42和miR-29a / Cdc42 /β连环蛋白是一个潜在的信号级联MIN6细胞。我们转染miR-29a模仿,miR-29a抑制剂,Cdc42-pcDNA3.1, cdc42 -核- 643成MIN6细胞。免疫印迹结果表明,相比之下β连环蛋白表达在miR-29a模仿和抑制剂数控,显著增加差别miR-29a对这些β连环蛋白表达( ),而miR-29a超表达显著下降β连环蛋白表达( )(图4(一))。相反,Cdc42超表达显著增加β连环蛋白表达( ),显著差别而Cdc42对这些基因的减少β连环蛋白表达( )(图4 (b))。这些结果表明,miR-29a可以抑制但Cdc42可以促进β连环蛋白在MIN6细胞蛋白表达。

(一)

(b)

图4

miR-29a和Cdc42的影响β连环蛋白表达。miR-29a (a)的影响β连环蛋白表达。免疫印迹检测β连环蛋白表达与miR-29a转染后模仿和抑制剂(n= 3)。 ,而miR-29a模拟数控 ,与数控miR-29a抑制剂相比,评估学生的配对t以及。Cdc42 (b)的影响β连环蛋白表达。免疫印迹检测β连环蛋白表达与Cdc42-pcDNA3.1转染后,sirna - 643 (n= 3)。 ,与pcDNA3.1相比,和 ,与siRNA-NC相比,评估学生的配对t以及。数据显示为平均数±标准差。NC:消极的控制。

4所示。讨论

除了死亡的主要原因之一,在世界范围内,在糖尿病患者高血糖危害微脉管在不同靶器官;例如,大脑、心脏、肾脏和眼睛50]。扩散障碍的β细胞是T1DM和GSIS障碍的主要原因β细胞是二型糖尿病的主要原因1,31日,51]。因此,重要的是要理解影响的扩散和GSIS的潜在机制β为了提高细胞治疗糖尿病药物的发展。在大多数情况下,microrna充当消极的监管机构和影响蛋白质编码基因;因此,异常microrna的表达影响多种生理和病理生理过程,包括胰岛素分泌。许多研究表明Cdc42 GSIS的重要调节基因(25短暂快速脉冲刺激导致蛋白激酶21),通过激活其下游效应器Pak1;对丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)在GSIS的第二阶段(52- - - - - -54]。Cdc42定位在胰岛素分泌颗粒,它参与胞外分泌的胰岛素囊泡通过调节f -肌动蛋白及其相关通路(55]。

在这项研究中,MIN6细胞行被选中来研究细胞增殖和胰岛素分泌在体外有以下四个原因:(a) MIN6细胞行成立转基因非肥胖糖尿病小鼠的胰腺肿瘤,和MIN6细胞的胰岛素分泌功能非常类似于胰腺;(b)胰岛β细胞是最丰富的细胞在胰岛细胞,约占总数的70%;(c) MIN6细胞的胰岛素分泌功能非常类似于胰腺;和(d)的大部分相关研究文献中使用这个细胞系研究胰岛素分泌和相关信号通路,所以文学的身体MIN6细胞相对丰富。T1DM和2型糖尿病是胰岛素缺乏,T1DM也涉及到的损失β细胞,所以研究miR-29a / Cdc42 /的角色β连环蛋白MIN6细胞增殖和GSIS将有助于探索T1DM的分子机制和2型糖尿病。实验首先探讨影响miR-29a Cdc42, miR-29a / Cdc42 /机制β连环蛋白通路MIN6细胞增殖和GSIS high-glucose条件下。

CCK和ELISA结果显示miR-29a抑制MIN6细胞增殖和胰岛素分泌high-glucose刺激,但是basal-glucose刺激下没有明显差异。这个结果与体外研究的结果是一致的,Bagge et al。24)INS-1E细胞系,但冲突的体内研究的结论Dooley et al。20.),miR-29a / b - 1淘汰,因为它是不可能只有miR-29a击倒。因此,这些相互矛盾的结果可能是由于击出miR-29b-1或之间的差异在体外和在活的有机体内方法。

Cdc42蛋白表达的抑制用sirna - 569似乎那么有效,使用sirna - 643。与siRNA-NC组相比,抑制Cdc42蛋白mRNA表达用sirna - 569也有效,但无统计学差异。可能的原因是,我们的实验只进行了三次。和核- 643显示最好的抑制作用Cdc42蛋白mRNA和蛋白表达筛选siRNA碎片;因此,sirna - 643用于后续实验。CCK和ELISA结果显示Cdc42促进MIN6细胞增殖和胰岛素分泌high-glucose刺激,但是basal-glucose刺激下没有显著差异。这个实验的结果是一致的与当前主流思维。目前研究者普遍认为在GSIS Cdc42扮演一个积极的监管作用,干扰其表达减少胰岛素分泌(25]。Cdc42可以影响胰岛素分泌的胰岛素调节囊泡融合,胞外分泌,细胞骨架重排(56),但具体途径参与这个过程需要进一步研究。

此外,我们调查是否miR-29a影响MIN6细胞增殖和胰岛素分泌通过干扰Cdc42表达式。免疫印迹结果表明miR-29a负监管作用有关Cdc42 MIN6细胞中表达,这是类似于发现nonsmall-cell癌等癌症,胃癌,乳腺癌[42,43,57]。此外,生物信息学分析和荧光素酶记者分析表明,有一个miR-29a结合位点Cdc42 mRNA 3′utr,因此miR-29a可以影响Cdc42和下游分子的表达,最终发挥生物效应。和Cdc42可以反向的影响miR-29a MIN6细胞增殖和GSIS high-glucose条件下。值得一提的是,无论miR-29a或Cdc42上涨或下调,basal-glucose刺激下对GSIS没有影响;因此,影响miR-29a / Cdc42 MIN6细胞GSIS basal-glucose刺激下研究似乎不太必要。这些结果表明,Cdc42 miR-29a的直接效应在体外,miR-29a可以抑制MIN6细胞增殖并通过负调节GSIS Cdc42表达式。

许多研究已经证明,β连环蛋白可以有效地监管Cdc42 [47- - - - - -49),我们假设miR-29a / Cdc42 /β连环蛋白是一个潜在的信号级联参与糖尿病进展。集体,miR-29a可以影响Cdc42和下游分子的表达β连环蛋白,因此,抑制f -肌动蛋白重组,胰岛素颗粒动员、和细胞间的相互作用,最终抑制GSIS MIN6细胞(39,58]。此外,低β连环蛋白蛋白表达可能抑制β连环蛋白核易位和细胞周期蛋白D1, D2,和原癌基因的基因表达,所以miR-29a MIN6细胞的增殖率(有负面的影响59]。因此,upregulation miR-29a与Cdc42 /抑制有关β连环蛋白信号可能MIN6细胞增殖和GSIS抑制潜在因素。

5。结论

总之,目前的研究报告的作用miR-29a MIN6细胞增殖和GSIS涉及调节Cdc42和β连环蛋白表达。结果表明,miR-29a抑制MIN6细胞增殖和GSIS负调节Cdc42表达式。相比之下,Cdc42 /β连环蛋白是一个miR-29a促进MIN6细胞增殖和GSIS下游信号通路。总而言之,miR-29a GSIS,会造成负面的影响并通过Cdc42 / MIN6细胞增殖β连环蛋白信号。miR-29a Cdc42 /β连环蛋白可能参与糖尿病进展。然而,进一步的动物实验和临床的研究样本病人需要验证miR-29a / Cdc42 /的功能β连环蛋白和其他microrna是否和下游分子在糖尿病发展起着至关重要的作用还需要进一步的研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

静段Xian-Ling钱和小君李同样这项工作。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(31660287号)和南昌大学的研究生创新专项资金项目(nos YC2017-S080和CX2018165)。

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