文摘

最近,小分子核糖核酸被认为是糖尿病肾病(DN)发展的至关重要的监管机构。Epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)阻力指标纤维化,也许可以发挥重要的作用,它是糖尿病肾病进展的一个特点。然而,mir - 98 - 5 - p的函数调制的EMT在DN和肾纤维化仍然几乎没有研究。因此,识别mir - 98 - 5 - p的机制在调节EMT和纤维化具有巨大的意义。在我们目前的研究中,减少mir - 98 - 5 - p是在db / db老鼠和小鼠系膜细胞葡萄糖的高剂量治疗。与此同时,激活EMT的减少和增加纤维化是伴随着mir - 98 - 5 - p在体外和在活的有机体内。此外,进一步发现mir - 98 - 5 - p的角色在DN发展,过度mir - 98 - 5 - p的应用。首先,在活的有机体内调查显示,海拔mir - 98 - 5 - p控制蛋白尿,血清肌酐,包子,EMT过程和纤维化。此外,高葡萄糖能够促进小鼠系膜细胞增殖,EMT过程,诱导肾纤维化,可以防止过度的mir - 98 - 5 - p。此外,高机动组(HMGA2)可以表现出一个重要的角色在不同的生物过程。这里,HMGA2调查的目标目前mir - 98 - 5 - p。荧光素酶记者进行了测定和mir - 98 - 5 - p的相关性和HMGA2验证。此外,它是显示HMGA2显著升高db / db老鼠和小鼠系膜细胞。此外,mir - 98 - 5 - p强烈压抑HMGA2蛋白质和小鼠系膜细胞的信使rna水平。总的来说,这些发现mir - 98 - 5 - p会抑制EMT过程和肾纤维化通过针对HMGA2 DN。

1。介绍

DN是一种常见的糖尿病并发症,可导致全世界ESRD [1,2]。越来越多的证据表明,炎症过程,氧化应激,自噬是负责DN的发展(3- - - - - -5]。频繁的糖尿病并发症,仍不能有效治疗DN,迫切需要开发更有效的方法来抑制其发展(6]。

众所周知,EMT是一种生物,和上皮细胞可以transdifferentiate为间充质细胞在这一过程中。这个过程能够贡献很多病理纤维化和癌症发展(7,8]。报道,EMT的时期,上皮细胞将会下降apical-basal极性和连接,导致间质细胞的表型。间充质细胞迁徙和入侵能力增加,从而导致ECM组件的积累(9]。例如,上皮细胞经历EMT过程参与肾脏纤维化(10]。此外,在人类肾组织,间充质指标正tec相关与调节血清肌酐水平(11]。这些研究揭示了一个重要角色的EMT和肾纤维化DN发病机理。

小分子核糖核酸是小非编码rna参与多个进程(12]。他们可以调节蛋白的表达通过信使rna降解或转化镇压[13- - - - - -15]。在最近的研究中,他们报告说,越来越多的小分子核糖核酸可以调节DN的进展16]。例如,mir - 146 a对DN发病机理的抗炎作用[17]。通过激活miR-27a诱发足细胞损伤β连环蛋白在DN (18]。除了这些,通过针对PTEN和SMAD7 miR-21促进肾纤维化在DN (19]。到目前为止,mir - 98 - 5的生物功能- p DN EMT过程和肾纤维化的进展仍然几乎没有研究。因此,我们集中在mir - 98 - 5 - p的机制在DN发展。

目前,我们假设mir - 98 - 5 - p参与DN通过EMT过程。在我们目前的研究中,发现mir - 98 - 5 - p是一个重要的调制器通过针对HMGA2 EMT在DN和肾脏纤维化。增强mir - 98 - 5 - p减弱小鼠系膜细胞增殖和EMT和肾纤维化的进展。

2。材料和方法

2.1。动物

动物实验是基于美国国立卫生研究院的标准实验动物保健和使用的指令。这项研究是伦理委员会批准,复旦大学附属中山医院青浦的分支。男性db / db小鼠C57BL / Ks背景和控制C57BL / Ks小鼠获得南京大学模式动物研究中心(中国南京)。小鼠在中心12小时光和12小时的黑暗时期,他们提供水和食物,没有限制。Db / Db老鼠分成两组(LV-NC和lv - mir - 98 - 5 - p, 每组)。12周时,老鼠注射lv - mir - 98 - 5 - p或者LV-NC通过尾静脉。随后,麻醉是由腹腔内注射xylazine-ketamine混合物在24周之前所有的老鼠都牺牲了。

2.2。血液和尿液的决心

血糖测试使用葡萄糖LiquiColor测试(美国TX Stanbio实验室,Boerne)。24小时尿液代谢笼获得每四个星期。血清肌酐、包水平和尿肌酐水平AEROSET临床化学系统的检查(美国雅培公司,芝加哥,IL)。使用小鼠尿白蛋白浓度检测白蛋白酶联免疫试剂盒(美国Bethyl实验室、蒙哥马利、TX)。

2.3。细胞培养

小鼠系膜细胞和hek - 293 t细胞从写明ATCC购买(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。DMEM培养基有10%的边后卫(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)、青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / ml)来维持所有的细胞。细胞增长5%二氧化碳气氛37°C。

2.4。CCK8化验

细胞被镀在96孔板整整一个晚上。然后,细胞生存能力测试使用CCK-8方法(CCK8、Dojindo、日本)。

2.5。EdU化验

EdU实验进行了使用Cell-Light EdU DNA细胞增殖工具包(RiboBio、上海、公关,中国)。治疗后50 mM EdU了两个小时,4%多聚甲醛用于修复细胞。然后,细胞染色由阿波罗与核酸染色染料溶液由赫斯特- 33342。观察使用一个奥林巴斯FSX100显微镜图像。

2.6。中存在

总RNA提取试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。RNA是反向转录使用合成第一链cDNA工具包(美国马热科学、沃尔瑟姆)。发现mir - 98 - 5 - p的表达和mRNA的表达钙N-cadherin HMGA2 TGF -β1、COL4A1和qPCR进行了使用SYBR预混料交货Taq II (TaKaRaBio技术,大连,中国)在7900年ht快速实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。引物合成了GenePharma(上海,中国)。表中列出使用的引物1。U6 RNA采用微RNA作为内部控制。GAPDH作为一个内部mRNA控制。褶皱变化是计算使用 。

表1
用于实时PCR引物。
2.7。免疫印迹

细胞被收获,裂解缓冲被用来提取细胞蛋白质。蛋白质提取物也被烹煮过,细胞提取物10% sds - page凝胶分离得到。然后,乐队的蛋白质转移到PVDF膜。主要的钙粘蛋白的抗体,N-cadherin、HMGA2 TGF -β1、COL4A1和GAPDH是孵化与膜整整一个晚上4°C。第二天,二次抗体与合。免疫反应性的乐队受到使用ECL-PLUS /工具包(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。

2.8。双荧光素酶检测

HMGA2之间的结合位点和mir - 98 - 5 - p被TargetScan预测(http://www.targetscan.org/vert_71/)。3ʹ未翻译区(UTR) HMGA2是放大的cDNA hek - 293 t细胞和插入pMIR (WI Promega公司麦迪逊,美国)。pMIR-HMGA2 3ʹutr或pMIR-HMGA2 3ʹutr突变体转染进hek - 293 t细胞使用Lipofectamine 2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。24小时后,荧光素酶的活动Renilla活动被发现使用双荧光素酶报告实验设备(WI Promega,麦迪逊,美国)。

2.9。统计分析

数据表现为均值±SD和分析通过SPSS 19.0软件(IL SPSS, Inc .,芝加哥,美国)。学生的t以及和不同群体之间进行了方差分析。差异与 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。mir - 98 - 5 - p在DN表达下调

首先,调查的角色mir - 98 - 5 - p在DN发展,db / db小鼠C57BL / Ks背景在我们的研究中使用。期间,我们发现血糖和尿ACR在db / db老鼠从12周逐渐增加(数据1(一)和1 (b))。此外,在24周,血清肌酐和包被展出,检查他们在db / db显著调节小鼠(数字1 (c)和1 (d), 为每个组)。此外,如图1 (e)在db / db小鼠的肾组织,mir - 98 - 5 - p是大大降低( 为每个组)。

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图1
mir - 98 db / db - 5 - p是减少老鼠。(a)血糖测定每四周岁以来的12周。(b)尿ACR检测每4周以来12周的时代。(c)血清肌酐检查在24周的时代。(d)面包是24周时决定。mir - 98 (e) - 5 - p的表达在肾皮质衡量实时PCR。 为每个组。三个实验的数据代表。误差线代表均值±SD至少一式三份的实验。 。
3.2。mir - 98 - 5 - p降低db / db老鼠的肾脏功能障碍

然后,发现mir - 98 - 5 - p能否调节肾脏功能障碍的db / db老鼠,mir - 98水平在db / db - 5 - p老鼠被慢病毒系统调制。lv - mir - 98 - 5 - p交付,展出,mir - 98 - 5 - p是有效增加3个月后的肾皮质(图2(一个), 为每个组)。在图2 (b),增加mir - 98 - 5 - p降低高血糖的发展。此外,lv - mir - 98 - 5 - p治疗减少尿蛋白排泄而控制老鼠(图2 (c))。此外,过度mir - 98 - 5 - p压抑的血清肌酐和包级别(数字2 (d)和2 (e), 为每个组)。

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图2
过度的mir - 98 - 5 - p减毒在db / db小鼠肾脏功能障碍。(一)mir - 98 - 5 - p表达在肾皮质使用实时PCR进行了测试。(b)血糖测定每4周。(c)尿ACR检测每4周。(d)血清肌酐检查在24周的时代。(e)面包是24周时决定。 为每个组。三个实验的数据代表。误差线代表均值±SD至少一式三份的实验。 。
3.3。EMT和肾纤维化在db / db小鼠诱导

接下来,EMT生物标志物的表达(钙粘蛋白和N-cadherin)确定使用中存在和免疫印迹检测肾皮质。结果在图3(一个)和3 (b)表明,钙粘蛋白mRNA表达显著降低在db / db的老鼠,虽然N-cadherin增强( 为每个组)。一致的结果在免疫印迹实验观察。数据3 (c)- - - - - -3 (e)展览在db / db EMT显然是引发小鼠( 为每个组)。与此同时,肾纤维化标志物(TGF -β1和COL4A1)测试使用中存在和西方的屁股。结果在图3 (f)和3 (g)表明TGF -β1和COL4A1 mRNA表达明显升高db / db老鼠( 为每个组)。此外,TGF -β1和COL4A1蛋白表达也增加在db / db老鼠(数字3 (h)- - - - - -3 (j), 为每个组)。

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EMT和肾纤维化在db / db小鼠诱导。mRNA的表达钙粘蛋白(a)和N-cadherin (b)。钙粘蛋白的免疫印迹图像和N-cadherin (c),量化钙粘蛋白的免疫印迹图像和N-cadherin (d和e)。mRNA的表达TGF -β1 (f)和COL4A1 (g),免疫印迹图像TGF -β1和COL4A1 (h)。免疫印迹图像的量化TGF -β1 (i)和COL4A1 (j)。 为每个组。三个实验的数据代表。误差线代表均值±SD至少一式三份的实验。 。
3.4。EMT和肾纤维化压抑mir - 98 - 5 - p在db / db老鼠

此外,mir - 98 - 5 - p是极大的过表达,如图4(一)和4 (b)钙粘蛋白mRNA水平明显增加,减少N-cadherin mRNA表达( 为每个组)。除了这些外,免疫印迹分析数据所示4 (c)- - - - - -4 (e)显示,钙粘蛋白是诱导和N-cadherin降低了mir - 98 - 5 - p在db / db upregulation老鼠( 为每个组)。与此同时,肾纤维化标志物(TGF -β1和COL4A1)测试使用中存在和免疫印迹分析。此外,我们发现TGF -β1和COL4A1 mRNA表达明显的过度压抑mir - 98 - 5 - p在活的有机体内(数据4 (f)和4 (g), 为每个组)。一致,TGF -β1和COL4A1蛋白表达被抑制mir - 98 - 5 - p在db / db老鼠(数字4 (h)- - - - - -4 (j), 为每个组)。

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图4
EMT和肾纤维化被过度抑制mir - 98 - 5 - p在db / db老鼠。mRNA的表达钙粘蛋白(a)和N-cadherin (b)。钙粘蛋白免疫印迹图像和N-cadherin (c),量化钙粘蛋白的免疫印迹图像和N-cadherin (d和e)。mRNA的表达TGF -β1 (f)和COL4A1 (g),免疫印迹图像TGF -β1和COL4A1 (h)。免疫印迹图像的量化TGF -β1 (i)和COL4A1 (j)。 为每个组。三个实验的数据代表。误差线代表均值±SD至少一式三份的实验。 。
3.5。mir - 98 - 5 - p抑制小鼠系膜细胞增殖,EMT和肾纤维化

此外,显示在图5(一个),mir - 98 - 5 - p在小鼠系膜细胞中表达调节处理HG(25毫米的葡萄糖)。研究是否mir - 98 - 5 - p调节小鼠系膜细胞增殖,lv - mir - 98 - 5 - p被感染小鼠系膜细胞成功地增加(图5 (b))。CCK-8进行了测定,显示在图5 (c)lv - mir - 98 - 5 - p大大抑制细胞生长。此外,EDU试验(数字5 (d)和5 (e))暗示细胞增殖是由高葡萄糖和mir - 98 - 5 - p逆转这一过程。除了这些,免疫印迹分析数据所示的结果5 (f)- - - - - -5 (h)表明钙粘蛋白是增加,抑制了N-cadherin mir - 98 - 5 - p在体外。此外,在数据5(我)- - - - - -5 (k)免疫印迹数据显示,TGF -β推迟了1和COL4A1蛋白表达mir - 98 - 5 - p。

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图5
超表达mir - 98 - 5 - p缓解高glucose-induced细胞增殖,EMT和肾纤维化培养小鼠系膜细胞。(一)实时qPCR分析显示mir - 98 - 5 - p的表达在高葡萄糖治疗小鼠系膜细胞(HG, 25毫米)与细胞治疗正常葡萄糖相比(NG, 5.6毫米)。(b)实时qPCR分析显示mir - 98 - 5 - p表达小鼠系膜细胞感染lv - mir - 98。(c) CCK-8化验的结果在小鼠系膜细胞。(d和e) EDU化验的结果在小鼠系膜细胞。钙粘蛋白免疫印迹图像和N-cadherin (f)。量化的钙粘蛋白的免疫印迹图像和N-cadherin (g和h)。TGF -的免疫印迹图像β1和COL4A1(我)。免疫印迹图像的量化TGF -β1 (j)和COL4A1 (k)。 为每个组。三个实验的数据代表。误差线代表均值±SD至少一式三份的实验。 。
3.6。mir - 98 - 5 - p HMGA2目标

随后,HMGA2被搜索的目标mir - 98 - 5 - p。荧光素酶报告质粒WT-HMGA2和MUT-HMGA2结合位点被显示在图6(一)。Cotransfection WT-HMGA2 mir - 98 - 5 - p模仿镇压记者活动hek - 293 t细胞(图6 (b))。数据6 (c)和6 (d)表明HMGA2强烈诱导的肾组织db / db老鼠。然后,我们发现HMGA2表达升高小鼠系膜细胞表明高葡萄糖,如图6 (e)和6 (f)。HMGA2强烈抑制了mir - 98 - 5 - p在小鼠系膜细胞过度表达,如图6 (g)和6 (h)。

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图6
HMGA2直接mir - 98 - 5 - p的目标。(一)包含野生型的荧光素酶记者构造(WT-HMGA2)或突变HMGA2 (MUT-HMGA2)序列。(b) WT-HMGA2或MUT-HMGA2 cotransfected进hek - 293 t细胞和mir - 98 - 5 - p模仿或者相应的消极的控制。(c)的mRNA表达HMGA2在db / db老鼠。(d)蛋白表达的HMGA2 db / db老鼠。(e)的mRNA表达HMGA2在小鼠系膜细胞。HMGA2 (f)蛋白表达的小鼠系膜细胞。(g)的mRNA表达HMGA2在小鼠系膜细胞转染与lv - mir - 98 - 5 - p。HMGA2 (h)蛋白表达的小鼠系膜细胞转染与lv - mir - 98 - 5 - p。三个实验的数据代表。 Error bars stand for the mean ± SD of at least triplicate experiments. 。

4所示。讨论

小分子核糖核酸可以参与各种心血管疾病过程,这与许多心血管疾病密切相关,如冠心病、高血压、心肌梗塞(20.]。积累研究表明小分子核糖核酸特异表达在DN发展21- - - - - -23]。在这里,mir - 98 - 5 - p / HMGA2轴被确认为一种新的机制发展的DN。展出,mir - 98 - 5 - p在db / db老鼠和减少小鼠系膜细胞显示高葡萄糖,而HMGA2大大增加。此外,小鼠系膜细胞增殖和EMT过程强烈阻止mir - 98 - 5 - p超表达。

mir - 98是一个高度保守的小RNA的家庭。它作为一个重要的肿瘤抑制肿瘤。例如,mir - 98可以抑制肝癌进展通过EZH2和灭活Wnt /β连环蛋白(24]。通过瞄准ITGB3, mir - 98抑制非小细胞肺癌的进展(25]。另外,另一项研究表明,高葡萄糖浓度可以引发内皮细胞扩散通过调节mir - 98 (26]。在这里,我们研究了mir - 98 - 5 - p在db / db老鼠和减少小鼠系膜细胞,这是处理高葡萄糖。另外,我们观察到的超表达mir - 98 - 5 - p降低高血糖发展和db / db小鼠的肾脏功能障碍。肾脏功能的提高可能是由于高血糖的提高。在未来的研究中,我们想研究这个问题。

EMT在DN的发展中扮演着重要的角色27]。例如,miR-30c可以通过抑制EMT保护DN在活的有机体内(28]。miR-23b可以通过灭活功能作为DN EMT抑制PI3K-AKT途径激活(10]。此外,mir - 130 b可以通过抑制阻力指标纤维化也许可以保护肾EMT在DN (29日]。此外,以往的研究表明,mir - 98可以抑制EMT过程在一些癌症。mir - 98可以镇压捻表达式来预防非小细胞肺癌的进展(30.]。mir - 98阻止入侵能力和EMT的肝细胞癌(31日]。在这里,在我们的研究中,观察到EMT是在很大程度上引发了db / db老鼠和mir - 98 - 5 - p的超表达能抑制EMT过程DN。展出,引起的钙粘蛋白的表达是lv - mir - 98 - 5 - p,而N-cadherin被过度抑制mir - 98 - 5 - p。另外,我们观察到肾纤维化标志物TGF -β1和COL4A1大大诱导在db / db老鼠。mir - 98 - 5 - p的超表达显著抑制TGF -β1和COL4A1在体外和在活的有机体内。

HMGA2已经记录到调节脂肪形成和间充质细胞的分化并促进良性间叶肿瘤(32,33]。最近的研究表明,HMGA2在DN发展发挥关键的作用。Let-7d可以防止EMT过程引发的TGF -β1,通过调节肾纤维发生HMGA2表达式(34]。与此同时,失去HMGA2削弱EMT在管状上皮细胞(35]。HMGA2基因的常见变异可以大大提高2型糖尿病患者肾病(36]。在我们的研究中,这是显示,HMGA2 mir - 98 - 5 - p的目标。我们证明了HMGA2高架在DN模式。Upregulation mir - 98 - 5 - p压抑HMGA2水平小鼠系膜细胞。

5。结论

总之,小说的角色mir - 98 - 5 - p / HMGA2轴在DN隐含在我们的研究进展。mir - 98 - 5 - p可能对DN作为有意义的生物标记。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

YZ和某人导致了研究设计;JX、西城、杰、低频PZ、和TJ进行实验;YZ, JX、西城和TJ收集数据;YZ, JX和JL分析结果;YZ JX起草的手稿;某人修订后的手稿;和所有作者批准最终的证据。

确认

这项工作得到了上海市基金委员会卫生和计划生育(没有。201840254)。