调节性T细胞抵抗通过CD44-Mediated Cyclosporine-Induced细胞死亡信号通路

文摘

环孢霉素(CSA)是一种免疫抑制剂,特别是目标T细胞和也增加的百分比pro-tolerogenic CD4 + Foxp3 +调节性T细胞(Treg)通过未知的机制。我们以前报道,CD44,受体细胞外基质粘多糖透明质酸(HA),促进Treg IL-2-low环境中的稳定性。这里,我们问及CD44信号也促进Treg CSA阻力。我们发现CD44交联促进Foxp3表达和Treg可行性治疗CSA的设置。这种效应是独立的但可以抑制使用sc - 355979 - 2, Stat5-phosphorylation的抑制剂。此外,我们发现抑制HA合成损害Treg体内平衡,但这种影响与外生或CD44-cross-linking - 2可以克服。这些数据支持一个模型,CD44交联的HA促进IL-2-independent Foxp3表达和Treg生存面对CSA。

1。介绍

在健康个体,免疫耐受性是由人口的监管维护细胞,包括Foxp3 +调节性T细胞(Treg)。Treg T细胞的一个子集,抑制autoreactive效应T细胞(画眉草)。缺乏或损耗Treg导致多系统自身免疫在老鼠和人类1]。此外,过继转移Treg可以拯救健康的表型(2,3]。

Treg依靠白介素2(2)的抑制功能(4]。2促进Foxp3表达和Treg抑制功能通过信号转换器和激活转录5 (Stat5)信号5- - - - - -10]。然而,Foxp3抑制自分泌生产[- 26),这样Treg依靠其他细胞,特别是画眉草细胞,激活- 2的一个来源。以及影响Treg - 2激活苔麸淋巴细胞,促进其增殖。

除了2之外,其他因素也支持Treg维护在活的有机体内并在2 Treg存在^−−/以及CD25^−−/老鼠,尽管这两个菌株做开发自身免疫(11]。此外,环境- 2水平循环,在外围组织12- - - - - -14)经常Treg需要什么文化的一小部分。最后,虽然Treg文化是无能,在活的有机体内他们的增殖率高15,16]。总之,这些数据表明,额外的因素存在,支持Treg维护体内。

环孢霉素(CSA)是一种免疫抑制剂,可以抑制T细胞增殖抑制合成[- 217]。CSA抑制calcineurin-dependent - 2生产形成一个复杂的还有抑制磷酸酶磷酸酶诱导T细胞活化后(18]。反过来,转录因子核转录因子的激活T细胞(NFAT)仍处于磷酸化状态,随后,不能移植- 2基因表达(19]。

CSA的有效性治疗可能反映出,在某种程度上,改变Treg画眉草细胞的比率(20.]。以前的临床和在活的有机体内研究发现,治疗CSA能促进Foxp3表达Treg [21,22]。在活的有机体内人类的数据同样表明,CSA治疗导致更高水平的循环比健康的捐赠者Treg [23]。这些数据表明,Treg在某些情况下可能有生存优势面对CSA画眉草细胞。然而,背后的机制的相对节约Treg CSA的设置治疗尚不清楚。

已知一个组织因素促进Treg体内平衡low-IL-2环境中透明质酸(HA),一个细胞外基质(ECM)粘多糖。我们和其他人证明高分子量HA (HMW-HA) (> 1×10⁶kDa),治疗的特点,和受伤组织(24)促进Treg的功能和持久性(25- - - - - -27]。这些效应依赖于HA聚合物长度和交联的主要受体,CD44 (28),的表达升高在Treg [25]。根据这些数据,我们建议HMW-HA交叉连接CD44与稳态信号,从而提供Treg受伤和愈合组织(26]。

我们以前报道,CD44交联允许Treg抵制CSA-mediated细胞死亡(28]。然而,潜在的机制仍不清楚,Foxp3和CSA是众所周知的有效抑制生产[- 26,18]。

这里,我们已经评估了假设CD44交联绕过CSA IL-2R信号的关键技术方面的治疗缺乏- 2。我们发现CD44交联促进Foxp3表达IL-2-independent但Stat5-dependent地。此外,我们报告,HA合成抑制损害Treg体内平衡,但这种影响与外生或CD44-cross-linking - 2可以克服。这些数据支持一个模型,CD44交联的HA促进IL-2-independent和Stat5-dependent Foxp3表达和Treg生存面对CSA。

2。材料和方法

2.1。老鼠

Foxp3-GFP C57BL / 6小鼠亚历山大Rudensky博士的礼物。CD25 C57BL / 6 (CD25不足^−−/)老鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,我)。与CD25 Foxp3-GFP老鼠了^−−/小鼠产生Foxp3-GFP.CD25^−−/老鼠在我们机构。所有老鼠都保持在特定的无菌AAALAC-accredited BRI和斯坦福大学动物设施,依照制度准则。

2.2。隔离的白细胞数量

小鼠白细胞数量是独立于腹股沟,轴向和臂淋巴结和脾脏细胞从6 - 8周前老鼠。CD4 + T细胞数量孤立使用CD4 +隔离设备(Miltenyi研究)按照制造商的指示。Foxp3 / GFP + Foxp3 / GFP-T-cells被孤立使用FACS-Vantage流式细胞分析仪细胞分选仪或BD流式细胞仪咏叹调。产生的细胞纯度分数Foxp3 / GFP +可靠> 99.9%。

2.3。试剂和细胞系

透明质酸1.5×10⁶kDa Genzyme提供的分子量(HMW-HA)。环孢霉素A (CSA)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。重组小鼠IL-2Rα抗体(研发系统),2(凯龙星),和中和抗体CD25 (3 c7 BioLegend)。HMW-HA共轭BSA是用于plate-bound HMW-HA活化研究,如前所述[29日]。

2.4。流式细胞术分析

CD44的交联Treg进行如下:1×10⁶细胞/培养在96 -圆底细胞培养板。细胞被对待不同刺激条件下如下:媒体,- 2(100国际单位/毫升),和/或plate-bound anti-mouse CD44 Ab (10μg / mL, IM7 BD)。另外,分析HMW-HA治疗后,1×10⁶细胞/在96孔圆底组织培养板是2.5小时前测定血清饥饿。细胞被resuspended在RPMI 1640(表达载体)补充10%的边后卫(Hyclone,洛根,UT), 100年μg / mL青霉素,链霉素100 U /毫升、50μ米β我,2毫米谷氨酰胺,1毫米丙酮酸钠(表达载体)转移到前板之前涂上了50μg / mL BSA-conjugated HMW-HA。第三天,细胞收获和洗前分析。表示,以下试剂在37°C孵化有限公司吗₂孵化器与细胞前30分钟交联CD44: CSA (50 ng / mL或浓度表示)和中和Ab CD25 (100μg / mL;研发系统,猫ab - 223 na)。

流式细胞仪实验使用以下fluorochrome-labeled抗体:CD3e (145 - 2 - c11), CD4 (RM4-5)、CD25 (PC61.5)和CD44 (IM7)从BD-Biosciences eBioscience。标记细胞resuspended流式细胞仪分析了缓冲在LSRII流式细胞分析仪。分析了使用CELLQuest (BD)和FlowJo (Treestar Inc .、亚什兰或)软件。值得注意的是,所有的流式细胞仪的阴谋和MFI值显示被封闭在活细胞除非另有注明。

2.5。小鼠Treg激活化验

96 -平底组织文化板块与anti-CD3 Ab(0.5预镀μg / mL)和anti-CD44 Ab (1μg / mL)相关的地方。可溶性anti-CD28 Ab为0.5μ克/毫升。涂层与HMW-HA视为第二步。盘子洗了PBS然后100μL 100年μg / mL HMW-HA或100年μL 10% BSA PBS添加在37°C和盘子孵化2小时。盘子是用PBS的前150000年再次CD4 + CD25 + Treg RPMI-10完全培养基。指出,CSA (50 ng / mL)或可溶性IL-2R吗α(5μg / mL)添加了《盗梦空间》的实验。没有添加外源性2除非另有注明。三天后Treg染色和流式细胞仪分析了。

2.6。统计分析

图是准备用JMP软件(SAS研究所、卡里、数控)和GraphPad棱镜(拉霍亚,CA)。使用成对的重要性进行评估t测试或方差分析除非另有注明。

3所示。结果

3.1。CSA增加Treg百分比CD44依赖的方式

评估CSA对Treg可行性和Foxp3表达的影响,我们用过的纸巾孤立与Foxp3的表达绿色荧光蛋白转基因小鼠。我们从这些动物和纯化CD4 + T细胞激活文化72小时。我们的目标是测试CSA是否增加的比例中Foxp3 + Treg总CD4 +细胞在体外据报道在活的有机体内(21,22]。

我们观察到,CSA治疗显著增加的百分比中Foxp3 + Treg总CD4 + T细胞。这种效应在一系列重大CSA浓度但最为明显温和CSA(50的水平μg / mL)(图1(一))。这种效果是由于增加了细胞死亡中GFP / Foxp3−,传统的T细胞分数而不是GFP / Foxp3 + Treg分数(数据没有显示)。

没有这样的GFP / Foxp3分数被认为增加细胞CD44隔绝^−−/老鼠(图1 (b))。我们也观察到,CD44-cross-linking高度的百分比Foxp3 + Treg,即使在高浓度的CSA(图1 (c))。这些数据表明,(1)Treg相对耐CSA,画眉草细胞相比,这种阻力是依赖于CD44(2),和(3)可以放大了CD44交联。

3.2。和CD44交联促进Foxp3表达和Treg持久性尽管CSA - 2治疗

CD44的影响交联Foxp3水平是类似于一个期望看到什么补充- 2。因此我们直接而CD44交联的影响和补充- 2 Treg培养CSA的设置。为此,我们刚分离CD4 + GFP / Foxp3 + Treg GFP / Foxp3转基因小鼠和激活这些三天没有或CSA的存在。

我们发现Foxp3和CD25表达被治疗CSA废除,但CD44交联和补充100国际单位/毫升- 2维护Foxp3的表达。事实上,CD44交联和补充- 2大致相当的能力,促进Treg体内平衡的设置CSA(数字2(一个)和2 (b))。值得注意的是,CD44交联的有益影响Foxp3水平是基于识别信号的同时存在;CD44交联没有aCD3/28没有促进抵抗CSA(数据未显示)。

与我们的观察使用总CD4 + T细胞在图1,CD44交联净化Treg同样支持维护Foxp3表达一系列CSA浓度(图2 (c))。此外,我们看到类似的效果,当我们评估Treg可行性治疗CSA,以7-AAD和膜联蛋白V染色。然而,治疗CSA Treg没有CD44的交联导致生存能力明显降低(图2 (d))。

在一起,这些数据表明,CD44交联并补充2对Treg起到平行作用,允许他们逃避治疗CSA引起的细胞死亡。

3.3。CD44交联促进Foxp3表达IL-2-Independent地

我们以前报道,CD44 HMW-HA提升Treg维护没有交联的外生[- 226,28]。作为这些研究的一部分,我们发现CD44交联允许Treg抵制CSA-mediated细胞死亡(28]。我们已经提出,CD44交联促进生产- 2增加了Treg。

然而,这种解释的数据存在一些问题。首先,Foxp3被有效地抑制生产[- 26]。当我们做检测在Treg文化[- 228),这可能是更好的解释一些GFP的倾向/ Foxp3 + Treg回到被GFP / Foxp3−画眉草细胞能产生[- 230.]。实际上,这些细胞在细胞内染色- 2,我们观察到生产细胞均匀GFP - 2 / Foxp3−(数据没有显示)。第二,CSA也抑制- 2生产Treg和画眉草都在一个有效的方式18]。与此一致的是,我们发现在这些文化- 2的水平通过ELISA, 5 - 20 pg / mL范围,也不足以支持Treg体内平衡。因此,我们寻求更好的确定CD44-mediated Treg体内平衡的确是独立- 2的支持。

我们第一次中和任何可能产生在我们Treg - 2激活文化通过添加重组CD25 (rCD25),高亲和力受体- 2,或针对- 2抗体。然而,这些试剂并没有完全否定Foxp3表达CD44交联的有益作用(图3(一个))。

然后我们获得CD4 + GFP / Foxp3 + Treg从转基因GFP / Foxp3老鼠缺乏CD25、高亲和力受体(GFP - 2 / FoxP3.CD25^−−/老鼠)。我们发现没有CD25 CD44-mediated Foxp3的表达,影响最小的野生型B6小鼠和CD25^−−/Treg细胞几乎等于Foxp3表达水平(图3 (b))。

因为对Treg体内平衡的影响- 2存在剂量依赖的相关性,我们下一个测试是否CD44交联效果与补充- 2添加剂0-20国际单位/毫升(0 - 4000 pg / mL)。我们发现CD44交联对Foxp3持久性的影响最为明显,在低水平,CD44 - 2交联的功能与添加高水平的2(10 - 20个国际单位/毫升,相当于2000 - 4000 pg / mL)这些文化(图3 (c))。

这些数据支持这样的结论:CD44交联增强Foxp3的表达Treg - 2和CD25独立的方式。

3.4。抑制HA合成损害Treg体内平衡和外生或CD44-Cross-Linking - 2这是可以克服的

我们下决定是否在Foxp3表达CD44交联的影响可以通过其自然配体诱导哈和这是否哈旁分泌或自分泌。

为了验证这一点,我们孵化CD4 + / Foxp3 + Treg 72小时的HMW-HA, plate-bound CD44抗体,或- 2,检查Foxp3的表达。我们发现交联通过plate-bound CD44抗体或受体CD44 HMW-HA提升Foxp3表达CD4 + treg的方式类似于(图- 24(一))。

评估HA提升Foxp3表达是否旁分泌和自分泌在自然界中,我们废除从内部产生HA在CD4 + Treg培养他们的存在4-methylumbelliferone (4-MU),一个特定的透明质酸合酶抑制剂(31日]。激活Treg培养与4-MU无法维持Foxp3表达超过72小时(图4 (b))。正如所料,补充- 2可以完全拯救Foxp3的表达。此外,当这些细胞被培养anti-CD44抗体,Foxp3表达水平维持在类似于控制。这些观察结果被证实在多个实验复制(图4 (c))。综上所述,这些研究结果表明,内生和外生公顷可以加强Foxp3表达和HA产量的损失可以通过交联补偿的HA受体CD44。

3.5。Stat5-Dependent CD44-Mediated Foxp3的表达

许多细胞因子已知Treg体内平衡的支持,包括2、通过Stat5信号。因此我们评估是否促进CD44 Foxp3持久性的交联是由Stat5信号介导的。

我们发现CD44的能力交联促进Foxp3表达了在治疗sc - 355979, pStat5的选择性抑制剂(图5(一个))。这种能力的sc - 355979克服CD44-mediated Foxp3表达是剂量依赖性(图5 (b))。最后,而单独使用治疗CSA并不影响Foxp3表达CD44引起的,联合治疗CSA pStat5抑制并损害CD44-mediated Foxp3表达(图5 (c))。

综上所述,这些结果表明,CD44-mediated促进Foxp3表达和CD44的能力交联绕过CSA治疗取决于Stat5激活。

4所示。讨论

环孢霉素(CSA)是一种广泛使用的免疫抑制剂,有选择地目标T细胞,从而防止抗原免疫过程像移植排斥反应32,33]。有数据表明,CSA可能有选择地备用Treg和这可能有助于CSA功效[20.- - - - - -22]。这里,我们已经确定了一个小说,CD44-mediated和2独立Treg如何逃脱CSA抑制的机制。

CD44的角色Treg持久性的CSA将符合其他证据支持CD44在体内平衡的作用。我们以前公布,CD44和HMW-HA促进Treg体内平衡在低环境[- 225- - - - - -27),这是最近报道,CD44和Galectin-9促进稳定和功能的复合体Treg SMAD2/3信号依赖的方式(34]。CD44也有助于Treg函数(25,27,29日)和能力结合HMW-HA Treg的已知最有效的特征子集(25]。值得注意的是,CD44交联并没有拯救GFP / Foxp3−,传统的T细胞从CSA的影响在我们的手中。我们推测,这可能反映了一个事实,这些细胞通常CD44lo。还值得注意的是,这是极不可能的扩张Treg负责这种效果,因为人们普遍认为Treg不扩大在体外在缺乏高剂量和有效的抗原- 2信号。诱导Treg从传统T细胞也极不可能由于缺乏高剂量- 2的情况下,有效的抗原信号,TGFβ(6]。

的组成型表达CD44也可能促进额外的体内平衡T细胞的子集。例如,CD44已经涉及到记忆T细胞的体内平衡,这也(35]。除了总CD44水平,CD44在细胞表面的分布,和CD44变异亚型的化妆也可以影响T细胞内稳态。

这些数据可能理解看似矛盾的相关数据表明CSA不均匀备用Treg(综述(36])。具体地说,有一些报道,CSA抑制Foxp3 mRNA表达(37)和诱发的降级Treg炎性表型(38]。同样的,在活的有机体内研究中,老鼠接受骨髓移植MHC-mismatch证明CSA治疗受损的扩张Treg和降低整体Foxp3表达(39]。最近,这是表明治疗CSA优先抑制抗原Treg [40]。Miroux和他的同事们发现,CSA减少活动和扩散Treg [41]。我们的数据表明,CSA的剂量可能影响Treg抵制CSA的能力。与此一致的是,卡瓦依和他的同事证明了在活的有机体内管理CSA在高剂量抑制Treg的扩散,但不是在低剂量(42]。除此之外,我们的数据也支持角色抗原信号,co-stimulation虽然CD44,因此影响Treg当地炎性环境因素对抑制CSA的易感性。

CD44-mediated的数据支持作用,2独立,促进Treg抵抗CSA和暗示Stat5信号在这种效果4,43]。Stat5信号是必不可少的维护Foxp3的表达和抑制Treg的函数在活的有机体内(44,45]。这是强调通过观察Stat5基因敲除小鼠表现出失去Treg [46]。此外,过度的Stat5 - 2基因敲除小鼠可以恢复在活的有机体内Treg数字(46]。然而,Stat5信号途径不直接涉及2可能对Treg体内平衡很重要。我们当前工作的重点因此决定CD44直接交联磷酸化Stat5或者,或者,这些影响是否间接介导。

5。结论

我们已经识别出一个角色CD44, HA的受体,在促进Treg CSA阻力。这种效应是独立的但可以- 2抑制Stat5磷酸化的抑制。此外,我们发现抑制HA合成损害Treg体内平衡,但这种影响与外生或CD44-cross-linking - 2是可以克服的。这些数据支持一个模型,CD44交联的HA促进IL-2-independent Foxp3表达和Treg生存面对CSA。

缩写

ECM:	细胞外基质
哈:	透明质酸
HMW-HA:	高分子量透明质酸
Treg:	Foxp3 +调节性T细胞。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由美国国立卫生研究院的资助5 T32 AI07290(香农·m·Ruppert);R01 DK096087-01、R01 HL113294-01A1 U01 AI101984(保罗·l·Bollyky)。

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