透明质酸合酶:启动机制减少一端和一个钟摆模型细胞外多糖易位

文摘

透明质酸(HA)生物合成研究了六年了,但我们的生化细节了解哈合酶(已经)组装HA仍然是不完整的。类我家庭成员包括哺乳动物和链球菌哈斯,这次审查的重点,添加新年底的减少细胞内sugar-UDPs hyaluronyl-UDP链增长。HA-producing细胞通常创建细胞外HA外套(胶囊),还会分泌公顷到周围空间。已经包含多个跨膜域和lipid-dependent以来,我们在1999年提出,它创建一个intraprotein HAS-lipid毛孔越来越HA-UDP通过链转移不断在细胞膜表面。我们审查的证据合成酶pore-mediated多糖易位过程和描述一个可能机制(钟摆模型)和潜在的能源来驱动这ATP-independent过程。也HA合成酶合成几丁质寡糖,是由小说oligo-chitosyl-UDP产品的乳沟。chitin-UDP的合成寡聚物年底已经证实了减少的机制糖除了在HA大会由链球菌和哺乳动物类酶。这些新发现表明HA生物合成的可能性是由的能力必须使用chitin-UDP self-primers寡聚物。

1。HA生物合成的介绍和概述

脱细胞生物合成的HA在1959年证明使用链球菌膜(1]。酶、透明质酸合酶(),是一种膜蛋白,只需要毫克^{+ 2}和两个sugar-UDP基质(GlcUA-UDP和GlcNAc-UDP)聚合HA链。(在使用标准的约定一致显示减少的多糖或糖类,我们不使用正常nucleotide-sugars公约(如UDP-GlcNAc);相反HA-UDP GlcNAc-UDP, GlcUA-UDP缩写展示他们减少结束。)没有人能够识别任何链球菌或真核HA合成酶基因直到1993年哈萨基因被发现和克隆,链球菌有蛋白表达(2- - - - - -4]。识别的哈萨基因和生化示范,只有合成HA(所需的蛋白质是5然后识别了哈萨基因在美国equisimilis(6),美国uberis(7)和脊椎动物同系物这些基因在许多物种8- - - - - -10]。第一个活动是纯化重组酶从A组(去)和C组(SeHAS)链球菌是在大肠杆菌确定细胞(11]。

哺乳动物的基因组有三个不同的基因(HAS1、HAS2 HAS3)表达在特定的时间和特定的组织在开发期间,老化,伤口愈合,在正常或病理条件下或在癌症等疾病12,13]。哈,这只存在于一些原核生物,但普遍无处不在的细胞外基质成分在脊椎动物14,15),是一个线性杂多糖重复二糖的组成:(3)-β- - - - - - -N乙酰氨基葡萄糖,β(4)-D-glucuronic酸-β(1 -)。这unsulfated粘多糖是一个主要的组件在软骨和皮肤,滑液和玻璃液体。HA中扮演一个重要的角色在受精,胚胎发生,发展,分化16,17),还参与许多不同的细胞功能和行为,如细胞迁移、吞噬作用,蛋白多糖大会(18]。此外,HA扮演重要的角色在伤口愈合和作为药物运载工具,化妆品原料,镇痛设备(19- - - - - -21]。

所有已知的哈斯,除了一个,结构相关,显示身份或序列相似性高,multi-membrane-domain相似组织(6 - 8膜域),预测拓扑,和前进的机制,并构成一个大家庭,类我哈斯(10,22]。唯一已知II级,巴斯德菌multocida,不同于类我HASs膜附件(有一个膜域),基因和蛋白质序列,域组织和分配(nonprocessive)机制。本文主要关注HASs类我链球菌和哺乳动物的特征。

链球菌和哺乳动物-哈斯膜(23- - - - - -26)或纯化酶(27]拉长HA在减少,不需要一个外生开始HA合成的引物。仅使用两个sugar-UDP启动生物合成基质,虽然我们现在知道这种酶使self-primer只用GlcNAc-UDP(在下面描述)。是一个不寻常的酶,它使用四种基质(即。,two sugar-nucleotides and two types of HA-UDP chains, with either GlcUA or GlcNAc at the reducing end) and two glycosyltransferase activities within the same protein. DNA and RNA polymerases utilize template molecules to direct synthesis of products with only one type of bond between monomers. Heteropolysaccharide synthases, such as HAS (which makes a [GlcNAc(β1、4)GlcUA (β1、3)_nudp聚合物),创建新创两种不同的配糖体的联系以一种交流的方式。HA产品每次糖添加后就变成了一个衬底为下一个糖。HASs的外生前兆,膜结合使用至少7绑定或催化功能(图1)合成二糖单位减少的HA-UDP链增长。类我有酶是前进的;他们不重新绑定和扩展HA链一旦被释放。

去,只有一级的拓扑结构已经确定实验(28),有N -糖基,大多数去蛋白质细胞内(图2)。StrepHASs有六个膜域(MDs),四是通过蛋白质的膜给两个小的循环暴露在细胞外的一面。另外两个MDs,一个在中央大催化域和一个在c端三分之一的蛋白质,与膜的两性分子的螺旋或可重入循环但不要出现跨越膜。两个MDs的存在有两亲的,不穿过膜是有趣的,因为这些可能会特别适合intraprotein孔隙的形成。脊椎动物HASs包含一个额外的~ 130 - 160 c端区域的用两个trans-MDs aa。较大的真核的氨基~ 75%家庭成员是同源去预测领域相同的组织,所以我HASs的所有类的整体拓扑组织预计是相似的(10]。

2。活动是由其脂质环境

辐射失活研究[29日)表明,“积极单位”的质量SeHAS或去~ 23 kDa单体,但小于一个二聚体。额外的23 kDa被确认为磷脂(CL)。活跃的链球菌酶是蛋白质单体在复杂14 - 18 CL或其他磷脂分子。同样,活跃XlHAS1单体与额外的~ 20 ~ 69 kDa kDa的未知组件(30.),可能磷脂虽然这还没有得到确认。动力学表征纯化StrepHASs [31日]和人类HAS2 [32)证实,这些酶的活性受,或依赖,脂质。纯化StrepHASs活性很低,而且没有脂质和由外生CL(激活~ 10倍11,33),具有高特异性为特定脂酰链(34]。SeHAS高度激活油酰(C18:1) CL,但几乎完全不活跃的十四烷基(C14:0) CL。净化人类HAS2重组的活动极大地影响胆固醇和脂质体可用的脂质(32)和操纵质膜胆固醇含量在不同细胞类型使他们少使HA (35,36]。因此,类我HASs lipid-dependent或由他们的血脂和胆固醇微环境。强烈积极的调制,胆固醇也可能有助于减少细胞内HA合成,这可能是有害的,如果超过许多细胞通路和功能。

3所示。哺乳动物的活动是由前体可用性、翻译后修饰、蛋白质相互作用

在链球菌(37),枯草芽孢杆菌(38),或哺乳动物39]细胞表达,使哈,两个前体sugar-UDPs的消费是非常高的细胞相比没有哈。启用HA合成细胞必须有更大的生物合成的酶的表达水平和更大的前体代谢途径的通量率;这往往导致更高的稳态前体的浓度,但一个更重要的因素是,前体合成的速度支持高速率的前兆。在哺乳动物细胞调节比细菌更复杂和几组已经确定了一系列不同的机制,包括转录和转译后的控制(40,41]。哺乳动物HAS2研究最和被磷酸化调节转译后的42)、O-GlcNAcylation GlcNAc-UDP水平(43,44),通过泛素化和二聚45]。现在还不知道如果这些监管机制改变单糖装配活动或HA易位活动,但是,由于这两个函数耦合,改变一个活动有望改变。

4所示。透明质酸合成酶HA减少一端拉长

Stoolmiller和多尔夫曼47)报道,去添加新糖nonreducing结束,但其他研究与链球菌膜(24真核细胞]或[23,26)表明,HA合成发生在减少。纯化SeHAS和去27原油膜[]或去25)同时添加sugar-UDP单位减少。多糖生物合成的机理是不同的链增长是否减少或nonreducing结束。当添加糖的糖核苷酸(使其成为捐赠者)nonreducing多糖(受体),结束的核苷酸(例如,UDP)释放。然而,对于减少伸长,聚合物链增长总是连着UDP。反应(1)显示了哈二糖的反应组装(D =二糖单位)。在HA合成,在每个发布的UDP传输步骤来自HA-UDP中间由以前的糖。在每个周期的单糖,UDP是来源于发布最后单糖补充道: 捐献者HA-UDP hyaluronyl——(HA)链转移到新的sugar-UDP(受体)没有乳沟的高能UDP连接;UDP释放来自HA-UDP捐献者。这种情况类似于蛋白质和脂肪酸合成(48]。

糖基转移酶活动IUBMB命名法(EC 2.4.1.212)相比是不同的,对于典型的糖基转移酶(图1)。一种酶,利用GlcNAc-UDP添加nonreducing GlcUA年底将创建一个GlcNAc (β1,4)GlcUA链接,而转移酶活性增加GlcNAc-UDP减少端创建GlcUA (β1、3)GlcNAc联系。转移酶活动指定的系统命名捐赠:受体、组转移。因此,添加GlcUA残留的GlcNAc减少增长的HA链由活动增加了催化hyaluronyl链HA-GlcNAc-UDP GlcUA-UDP。这是一个HA-GlcNAc ()UDP: GlcUA (UDP,β(1、4)hyaluronyltransferase。同样,一个活动添加GlcNAc-UDP HA-GlcUA-UDP链是HA-GlcUA ()UDP: GlcNAc (UDP,β(1、3)hyaluronyltransferase。

5。HA易位到细胞表面的蛋白质本身

活跃的网站已经和sugar-UDP基质细胞内(28),那么大怎么HA产品(例如,> 40000糖长;> 8 MDa)到达表面或细胞外空间?只有外源性蛋白质(基因)和足够GlcNAc-UDP和GlcUA-UDP HA生物合成和分泌所需不同的细胞通常不能让哈,包括粪大肠(3),枯草芽孢杆菌(38),d .腹(49]。基于这些发现的拓扑和脂质依赖,我们提出,必须有能力把不断增长的HA链穿过细胞膜进入细胞外空间(11]。另一个建议是,ABC交通系统需要细胞外的样子哈(50,51),对许多细菌多糖(52];已经将合成细胞内哈,虽然还在组装,将出口附近的膜结合ABC交通系统。

似乎不太可能ABC交通系统参与了HA易位有几个原因:(i)是意想不到的,ABC转运蛋白多糖粪大肠,枯草芽孢杆菌,和果蝇会如此低特异性的正常基质,他们将有效地运输公顷。(2)因为不需要多个MDs HA合成(例如,类iip . multocida已经包含一个膜锚,HASs类我不同,可以表示为一个活跃的可溶性截短蛋白(53]),拓扑组织酶,含有6 - 8膜领域,更符合易位函数(54]。(iii)活动lipid-dependent或调制的脂质环境,符合一个固有的亲密组织内的双层膜,作为HA易位的预期功能,但不是独立的ABC运输模型。(iv) sugar-UDP绑定网站的链锁状球菌和哺乳动物-哈斯内膜表面(46],它更适合的模型HA-UDP链延长膜内或附近,转移酶外(图2)。(v)类HASs我前进的酶,这意味着他们不释放HA-UDP链在合成;从已经不发生离解的哈5,55]。这个特征强烈支持一个孔隙模型。HA-UDP所绑定的弱哈哈相互作用将被释放,移动,和酶内不断拉长,而仍然被保留在孔隙的拓扑约束。在ABC模型中,哈哈相互作用是可逆的,至于nonprocessive PmHAS,然后重新绑定公顷每次分离糖之外(53]。

强大的生化逻辑支持孔隙易位模型证实了多种研究表明,ABC转运体模型HA易位是不正确的。托马斯和布朗(56)发现,ABC转运蛋白不参与哈易位乳腺癌细胞和麦地那et al。57)表明,纯化SeHAS介导细胞腔的染料流出增加脂质体时,展示一个intraprotein孔隙的存在。哈伯德et al。58发现SeHAS,纳入脂质体,直接提供HA内部腔,证明具有预测公顷易位函数。

Misra et al。59)表明,ABC转运体凋亡表达式是由pericellular HA涂层的变化。协调调控ABC转运蛋白的表达,并提供了一个替代的解释研究HA转移暗示转运蛋白的作用。两个独立的细胞保护机制(由pericellular公顷外套和ABC耐多药转运蛋白)可能协同进化在脊椎动物协调调控以复杂的方式,以应对环境因素;这就能解释为什么和细胞外HA含量较低的细胞治疗耐多药转运体功能的抑制剂(50]。HA易位的另一种解释为抑制ABC转运蛋白抑制剂是这些抑制剂改变尿苷吸收或救助途径和改变尿苷核苷酸池,这抑制了(例如,控制不预制确认衬底sugar-UDP水平并未减少或有效的抑制剂UDP没有增加)。

最后,发现细菌纤维素合酶创建一个intraprotein毛孔,产品纤维素合成和转移(60),证实了我们在1999年提出的原则(11),HA等糖基转移酶和纤维素合成酶可以调解多糖合成和易位。

6。合成甲壳素和Chitosyl-UDP寡糖吗

SeHAS综合几丁质寡聚物,(GlcNAc -β1、4)_n(61年],作为XlHAS1报道[62年]和MmHAS1 [63年]。更重要的是,然而,最后一致减少糖之外,我们发现SeHAS也使小说几丁质寡聚物附着-GlcNAc ()UDP在减少61年]。SeHAS孵化只有GlcNAc-UDP使一系列(GlcNAc -β1、4)_n-GlcNAc (UDP寡聚物()对应于(GlcNAc)₂通过udp (GlcNAc)₇udp的产品。SeHAS膜没有孵化基质或只有GlcUA-UDP显示没有信号在这一地区。产品标识经MS-MS碎片和消化与杰克beanβ- - - - - -N-acetylglucosaminidase(例如,所有物种最终取得了GlcNAc-UDP)。例如,三,tetraoligomers被证实含有β1,4-linked GlcNAc残留物附着GlcNAc-UDP因为治疗与杰克bean己糖胺酶转换几乎所有最初的寡聚物GlcNAc-UDP或(GlcNAc)₂udp(图3)。因此,综合(GlcNAc -β1、4)_{1 - 7}-GlcNAc (UDP寡聚物。这些不寻常的糖核苷酸物种,激活附件UDP,不稳定且容易裂解产生几丁质寡聚物,解释类我HASs甲壳素的能力。

虽然已经不需要一个外生底漆公顷,这些小说白手起家的(GlcNAc)_nudp产品可能作为内生引物,使启动HA链组装。在这个提议场景(图4),nonreducing保留所有HA链这个初始的几丁质低聚物底漆,和所有HA分子有小说non-HA结构(几丁质寡糖cap) nonreducing结束。正在进行的研究支持这一假设[64年),包括有依赖型m / z信号指示GlcNAc等混合chitin-HA物种₆(GlcUA-GlcNAc)₂在绵羊的睾丸hyaluronidase-digested样品(图5 (b))。空载体膜没有(图5(一个))或SeHAS膜没有孵化基质(图中未显示)在这个地区没有信号。混合chitin-HA消化碎片可以亲和纯化,分离通过TLC或页面,并显示包含多个nonreducing GlcNAc残留物可发布的治疗与杰克bean己糖胺酶,如图3。因为我们研究chitin-UDP低聚物产品在体外条件下,(例如,接触一个sugar-UDP)细胞内通常不可能遇到的,还有待证明如果这些有趣的产品也做了在活的有机体内。研究正在进行中,以确定如果HA分子由链球菌和哺乳动物的类我HASs包含nonreducing结束几丁质寡糖帽。甲壳素帽的存在会对HA链的极性和重要的生理影响的潜在能力chitin-like结合蛋白在东方biomatrix或细胞表面,对齐,并组织个人HA聚合物包;例如,电缆或纤维(65年]。

7所示。类我有执行多个绑定和催化功能以合成HA

我们上面所提到的七个功能,所有类我有酶具有为了促进GlcNAC稳态大会(β1、3)GlcUA (β在HA合成1,4)双糖。HASs最近发现,也能使oligo-chitosyl-UDP物种,这些可以作为后续self-primers HA组装意味着这种酶家族也拥有比以前认为的结合部位和催化功能。总结了这些函数在盒子里1使用标准的转移酶命名法,列出的顺序使用HA的起始和组装。chitin-UDP物种需要三个结合位点的合成具有不同结构特异性和两个转移酶活动(盒子1(一)、函数1 - 5)。HA合成的启动需要做第一个使用non-HA衬底二糖,所以一个受体网站GlcUA添加和一个独特的转移酶活动(只用于每公顷分子合成)(需要盒子1(B)、功能6和7)。随后稳态公顷二糖合成需要七个功能,使用两个结合位点在(A)和(B)(功能2和6),另外两个结合位点hyaluronyl-UDP物种,和两个附加相应的转移酶活动(盒子1第8 - 11 (C)、函数)。最后一个函数是易位的活动,它以连续的方式在HA链伸长但单独列出强调其小说和独立的性质,作为一个“空间”,而不是化学催化过程(盒子1(D)、功能12)。因此,惊人的12个离散函数是由类HASs我为了这些酶发起、组装、oligo-chitosyl-HA-UDP多糖和转移到细胞外;尚不清楚如果发布HA链仍附在UDP在减少结束或者链被释放,因为这个群体已经丢失,因此伸长停止,导致释放哈。

8。多糖的钟摆模型易位

我们在2004年提出了一个新颖的机制(37)由一个单一的膜结合·脂质复杂可能同时延长聚合物链的减少,挤出增长链通过膜(数字6和7),过程中不需要其他蛋白质或ATP。该模型也适用于其他膜多糖合成酶,使用两个转移酶网站让异性——或者homopolysaccharides(如纤维素)。模型包括连续“摆动”运动由酶域(pendulum-like)和变化(三个表中已经说明1),这取决于催化机理利用独立glycosyl-UDP结合位点(如变体1和2)或一个站点与交替的特异性(例如,变体3)。二糖议会变体1或2顺序或同时,分别,而大会一定会一次一个糖变体3机制。下面摆模型的关键特性是描述摆模型变体1,但类似的中央点和注意事项适用于变种2。

(我)已经有两个功能域作为“武器”。每个部门一个活跃的网站包含一个糖基转移酶的功能,一个受体的结合位点sugar-UDPs,和一个结合位点的捐赠者HA-UDP物种(图6(一))。右手臂(粉红色)包含GlcNAc-UDP受体结合位点,HA-GlcNAc-UDP捐赠结合位点,(1,4)hyaluronyltransferase活动使GlcNAc -β(4)-GlcUA联系。一些残留参与交互(例如,绑定)所需的每个函数可能在手臂或在其他领域中没有显示数据6和7。

(2)只有一个手臂是活动的时间和他们的活动是相互的。当一只胳膊活动转移酶,其他作为受体结合位点。每个部门可以“摇摆”三个功能不同的位置(图之一6 (b)),对应于构象的活动绑定供体和转移酶,不活跃,积极作为受体结合位点。例如,正确的(粉红色)手臂活动作为HA-GlcNAc-UDP绑定供体和(β1,4)转移酶(图6 (b)(图左),无所作为6 (b)、中心)或活动作为GlcNAc-UDP受体结合位点(图6 (b),对吧)。在相同的相对位置,左臂也同样活跃作为GlcUA-UDP受体结合位点(图6 (b)(图左),无所作为6 (b)、中心)或活动的(β1、3)转移酶和绑定供体HA-GlcUA-UDP(图6 (b),对吧)。武器的关系在一个中立的活性构象(图6 (b),中心)创建失调glycosyl-UDP受体和捐赠者的网站不适合糖基绑定或转让。相比之下,当武器要么搬到左边或右边位置,glycosyl-UDP供体和受体的定位有利于各自的转移酶活动的功能。在两个功能位置,转移酶活动添加sugar-UDP HA-UDP链增长,只有一个适当的活动安排的所有绑定和催化网站(图6 (c))。即使绑定替代受体和捐赠者可能发生,活跃的网站不会对功能糖转移(图保持一致6 (c)(左)。

(3)HA-UDP易位是糖添加耦合。因为每个手臂从一边移动到另一个通过糖添加循环,HA链挤压通过酶和脂质双分子层(每一行图7)一个糖(一次或两个如果共同二糖合成发生)。随着每一个新的sugar-UDP,绑定HA-UDP链是通过从一个部门到另一(例如,像一个人拉了一根绳子,顺着)手臂摆动,绑定的nonreducing结束HA-UDP是同时离开细胞内活跃的网站。同步的手臂运动提供了所需的力移动绑定ha链通过孔隙的蛋白质和细胞膜的细胞外。绑定ha链并不使分离已经在不断延伸,因为它总是绑定到一只胳膊或其他的周期在两臂之间,总是HAS-lipid孔隙内的拓扑约束的。

(iv)的其他变体摆模型。总体方案的其他变体摆模型相比略有不同变体1(表1)。变种2三个glycosyl-UDP结合位点可能在一只胳膊,但HA-binding转移酶网站和网站的移动链可以在其他部门或双臂。glycosyl-UDP结合位点可能在两臂变体3,同时二糖组装可能发生摆动从一个位置到另一个。释放UDP产品可能发生当手臂摆动到另一位置,转移(把)HA-UDP链,新一轮的“重新加载”二糖组装。交替特异性机制(3)变体涉及较少的网站,其glycosyl-UDP绑定两个物种之间的特异性周期(例如,HA-GlcNAc-UDP和HA-GlcUA-UDP),本质上是更复杂的,因此可能不太可能,特别是考虑到大量的潜在glycosyl-UDP结合位点在班上我有家庭(图2和部分10下文)。

共同的关键机械特性考虑添加二糖单位HA-UDP同时通过添加UDP-sugars是只会使用两种HA-UDP捐助者之一,HA-GlcUA-UDP或HA-GlcNAc-UDP,从而使只有一个两个可能的哈二糖单位(即。HA-GlcUA (β1、3)GlcNAc-UDP与HA-GlcNAc (β1、4)GlcUA-UDP职责)。虽然目前没有数据支持一个机制,甲壳素的帽nonreducing一端定义第一个哈二糖(框1)作为GlcNAc (β1,4)GlcUA并使它可能后续协调二糖大会将利用三个绑定基质表示反应(2),所以,捐赠者HA-GlcUA-UDP将GlcNAc-UDP共价连接,因为它反过来与GlcUA-UDP顺序耦合反应基本上是同步:

9。HA易位的生物能学

任何的HA易位机制必须考虑几个潜在的生物能量学障碍:(i)与转移相关的能量势垒的亲水性HA链疏水膜脂质双分子层,(ii)所需要的能量移动HA分子可能会变得越来越大,因为它拉长大质量和流体力学体积(66年)和(iii)的能量导致构象变化和运动领域内的酶,这种酶可以在物理上负责快速跨膜没有释放链链运动。MDa的角度来看,一个8公顷链按比例扩大到人类规模相当于一个1毫米宽线> 30米长。

(我)如何克服疏水膜屏障?膜转运蛋白,如lac通透酶12 MDs [67年),调节糖转移通过intraprotein孔隙由许多MDs之间的交互。哈斯似乎弥补没有足够的MDs形成这样一个intraprotein孔隙与磷脂的交互(11,32]。·脂质相互作用可以使酶来创建一个更大的pore-like通道内的酶,通过不断增长的HA链可以通过(11,57,68年]。·脂质复合物会出现表面疏水相互作用与脂酰团体在双分子层,而迷人的HA内部孔隙表面亲水相互作用;因此,HA链移动通过·脂质孔隙可以有效地绕过疏水膜屏障。

(2)怎么能有移动HA链质量逐步得到更大的吗?直观地说,也许有人会认为,克服惯性,所需要的能量和移动,HA-UDP链(例如,4 MDa)要大得多比移动短哈oligosaccharyl-UDP链所需要的能量(例如,4 kDa)。然而,两个因素可能会使这个明显的“分子举重”没有看起来那么困难。(一)HA分割。离散部分的分段,半独立运动(约长100糖)的HA链(69年- - - - - -71年)可以创建一个上限的“明显”的质量哈,需要“移动”可能促使一个离散的部分。如果段短暂的~ 100糖半独立的行为(例如,毫秒),期间易位是青睐,那么明显的质量哈,有需要生成一个易位力只会~ 20 kDa。链发起和拉长,可能最初把它迅速,然后逐渐缓慢,直到临近节段的长度,然后一个稳态易位率。观察到的动态概要HA质量如何在合成开始迅速增加,然后变得慢(55]。(b)增加释放力量。布朗运动所产生的合力可能倾向于把HA链的酶,从而促进易位的作用。可能链释放机制,事实上,可能是布朗和其他之间的平衡力释放HA和HA-binding部队由网站内的酶作用保留哈(66年]。相反,细胞pericellular HA涂层可以有效地稳定和停止HA合成,因为附近HAS-HA复合物的存在可以增强和提高部队支持保留。HA链在细胞表面密度增加,网络互动的链条会减少Brownian-generated力释放的影响哈,因此导致一个稳定的凝胶状细胞表面涂层仍然锚定到多个分子。这个场景中,极端的HA合成将放缓或停止随着HA涂层网络产生的力增加,最后提供太多的阻力可能促使哈。

(3)哈易位的能量来源是什么?至少有三个可能的能源为HA易位机制(图8),如下估计:glycosyl-UDP水解(4 - 8焦每摩尔),H-bond形成(12 - 24焦每摩尔)和离子对反应和电化学梯度的势能(4 - 8焦每摩尔)。如果这些能源促进HA易位机制,一个保守的估计的总自由能变化哈易位~ 30焦每摩尔~ 7千卡每摩尔(1千卡= 4.18 kJ)哈二糖单位穿过细胞膜。这相当于1 ATP和将是一个有利的生物能量学的情况,解释一个ATP-independent易位过程是可行的。(一)UDP-Sugar水解。Glc-UDP水解的自由能是7.3 - -7.6千卡/摩尔和Glc-UDP水解和葡萄糖苷键形成的区别是-1.0 ~ 0.6千卡/摩尔(72年]。值GlcNAc-UDP水解和GlcUA-UDP不可用,但可能有点大,由于不稳定的排斥和空间因素。自由能之间的差异为GlcNAc sugar-UDP水解和糖苷键的形成和GlcUA可能类似于相关,-1.0 ~ 0.6千卡每摩尔。因此,可用“超额”自由能执行额外的工作之外创建两个糖苷键可以~ 1 - 2千卡每摩尔(哈~ 4 - 8焦每摩尔)二糖单位(图8,# 1)。(b)电化学梯度或外部离子反应可以提供额外的能量。HA易位到细胞外一定会被关联到一个或多个电化学梯度易位过程可以提供额外的能量。有可能只认识一个≥4可能UDP-GlcUA物种正确的底物在催化,这取决于羧基的状态。羧基可以分离和自由(即。阴离子)或中性和绑定到H⁺,Na⁺,或者K⁺(毫克^{+ 2}也有可能)。在大多数情况下,良好的精力充沛的情况下会发生当新增GlcUA转移到外部:质子化了的羧基组将游离释放H⁺带负电荷的羧基团体将绑定到细胞外阳离子(例如,Na⁺),K⁺离子交换和Na⁺离子,超过。这种离子对反应将产生能量(这是很难估计的)和增加(拉)的平衡易位的方式类似于切除反应产物。绑定K的情况⁺可能是特别有利,因为哈易位也被耦合到细胞K⁺离子梯度(细胞内低外高),提供额外的能源总体HA合成和易位(73年]。考虑到细胞内大量的K⁺离子组成和pH值,K⁺-GlcUA-UDP物种是GlcUA-UDP可能最丰富的形式,因此,可能是正常的衬底。与此一致的是,纯化SeHAS更活跃在K的存在⁺比娜⁺离子(33]。如果一个K可用的能源⁺每二糖转移到细胞外环境~ 1 - 2千卡每摩尔(4 - 8焦每摩尔)的HA双糖(图8,# 2)。这个值,如上所述,可能被低估,因为它缺乏离子对反应相关联的的贡献。(c)H-Bond形成。实验和建模研究[69年,71年,74年,75年]表明,HA形成多个链内的H-bonds,通过创建两个H-bonds相邻糖(类似于H-bonds氨基酸形成蛋白质之间螺旋线)。额外的能量可以捕获链易位如果有情侣的形成几个新的H-bonds与HA链运动和旋转备用新添加的糖发生内部或外部的孔隙(图8,# 3)。假设平均价值~ 6焦每摩尔(~ 1.5千卡每摩尔)intra-HA H-bonds,然后易位可以产生高达12 - 24焦每摩尔(3 - 6千卡每摩尔)与2 - 4 H-bonds每摩尔公顷二糖的形成。

10。类我HASs包含多个潜在Glycosyl-UDP结合位点

哈斯只包含一个守恒“DXD”主题(DSD)^161年在SeHAS;图2),通常发现在活动网站的许多糖基转移酶和羧基组与Mg相协调^{+ 2}和磷酰nucleotide-sugar(组76年]。然而,同样的“DXD”功能可以由本质上任何集群的两三个连续的残留物是Asp或Glu [77年]。StrepHASs还包含第二个爸爸^153年主题,这是守恒的家庭,除了鸡肉HAS2和小球藻(Asp^153年在所有的哈斯)是守恒的。一个DAE^79年主题在SeHAS和去,但不是在亚斯,存在于10 13真核哈斯。有关“XDD”主题也存在于所有哈斯在多个位置:例如,SeHAS GDD^260年;艾德^77年(在小球藻);艾德^116年(DE守恒的定位为EE, EXE或EXD)。五个“XDD”主题守恒(即按位置StrepHASs是守恒的。,within ≤6 residues) in all HASs, with the exception of XlHAS1 (in which 3 of the 5 motifs are conserved, but five others are also present). Thus, all Class I HASs except XlHAS1 contain at least six conserved DXD or XDD motifs and, therefore, all HASs potentially have enough glycosyl-UDP binding sites to assemble a disaccharide unit in either a coordinated or simultaneous manner (Table1)。

11。作为糖基转移酶家族成员和顺向结构预测

属于GT2的家庭(78年- - - - - -80年]在CAZy数据库(http://www.cazy.org/(即)和催化一个倒置的机制。,创建一个β相关的配糖体联系的前身)。这些家庭成员需要一个二价金属离子和包含至少一个DXD主题和GT-A褶皱(罗斯曼相关褶皱),seven-stranded组成的β表的陪同下螺旋线。GT-2蛋白质的活性部位是由大型的协会β表和一个小β表。可能出现在> 5000蛋白质,基本GT-A褶皱提供了一个通用的“平台”来创建各种催化的情况。

已经是一个例外GT2的家庭成员因其多个MDs,这可能创建相同的内在拓扑约束的地区GT-A折叠(使建模基本上是不可能的)。基于大量的序列相似性通过~ 260 aa MD2和MD4(图之间的地区2),催化域可能采用一个整体折叠类似于其他GT2的家庭成员,包括纤维素合酶(81年]。相似性HA和纤维素合成酶包括氨基端核苷酸结合图案、一个假定的催化基础,QxxRW图案与持续合成,蛋白质为他们创建一个intraprotein毛孔产品(58,60]。GT2的家庭模型预测,氨基端子域名绑定sugar-UDP捐赠者和受体c端子域名绑定。等酶,增加减少了供体和受体结合位点的正常指示可能切换。因此,在有一个氨基端子域名绑定网站sugar-UDP可能是受体的网站。或者,如果这是守恒的施主能级,然后它将容纳一个HA-UDP衬底。终极答案的许多分子和机械问题的结构可能只会显示当有足够的原子分辨率是最终决定。

12。结论

自1993年第一个基因被克隆,该领域的进展和回答重要问题HA合成的分子基础。特别是,有越来越多的人一致认为,膜结合类我有酶是lipid-dependent和活跃蛋白单体或多聚体与特定的脂质(胆固醇)和喉炎和哺乳动物-哈斯组装HA在减少。现在解决,利用细胞内的前兆和夫妇与HA HA合成细胞表面或biomatrix易位。说明这个多功能过程肯定会透露更多的惊喜和意想不到的复杂分子过程的复杂编排受雇于一个酶蛋白质组装,同时把最大的单个生物分子在动物或微生物王国。未来结构的研究将揭示钟摆模型的一般原则是否能够解释的机制与易位夫妇HA合成。了解这些酶的合成工作,把哈可能提供机会识别疗法,并更好地了解哈斯参与正常的人类健康和在肿瘤发生、转移、炎症性疾病,如关节炎。

缩写

肤色线:	心磷脂
GlcNAc-UDP:	减少的nucleotide-sugar在正确的结束
GlcUA-UDP:	减少的nucleotide-sugar在正确的结束
哈:	透明质酸、透明质酸和透明质酸
HA -:	hyaluronyl组
HA-UDP:	hyaluronyl组与与UDP在减少
有:	哈合酶
MD:	膜域
SeHAS:	链球菌equisimilis有
去:	酿脓链球菌有
StrepHAS:	链球菌HA合成酶
亚斯:	链球菌uberis有
XlHAS:	非洲爪蟾蜍光滑的。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者的实验室的研究得到了美国国立卫生研究院的资助GM35978综合医学科学研究所。作者还感谢Christopher西博士非常有用的讨论和输入。

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