矩阵杯子蛋白质与纤连蛋白结合和增强细胞纤连蛋白附件和传播

文摘

背景。矩阵杯子蛋白质(MGP)是维生素K-dependent,细胞外基质蛋白。MGP动脉钙化抑制剂和软骨。然而MGP合成在许多组织和胚胎组织中尤其丰富和癌细胞。MGP这些实例的存在并不相关的钙化的抑制作用。本研究探讨了潜在机制MGP绑定到矩阵蛋白质和改变细胞矩阵交互。方法。MGP是否影响细胞行为通过与纤连蛋白的相互作用,我们研究了MGP纤连蛋白结合,影响MGP纤连蛋白介导细胞附着和传播immunolocalized MGP和纤连蛋白。结果。首先,MGP与纤连蛋白结合。MGP的结合位点是在一个特定的纤连蛋白片段,称为III1-C或anastellin。纤连蛋白的结合位点是在MGP c端肽氨基酸组成61 - 77。第二,MGP增强细胞连接和细胞纤连蛋白上蔓延。MGP并不能促进细胞粘附。第三,MGP fibronectin-rich地区存在的组织部分。结论。MGP纤连蛋白结合。MGP cell-fibronectin增加相互作用的存在。

1。介绍

矩阵杯子蛋白(MGP)是一个重要的钙化抑制剂。然而,MGP可能涉及到其生物作用的其他属性。合成在各种各样的组织在胚胎生命(1- - - - - -5]。MGP在胚胎肾小管和MGP合成蛋白质和vitronectin colocalize焦地点(6]。MGP高度表达的眼睛(7,8]。MGP合成增加眼内压增加(9,10]。MGP对于分支形态发生在肺是必要的11]。MGP卵巢癌症中高度表达,睾丸,肾、前列腺癌、恶性胶质瘤,但其功能在肿瘤细胞是未知的12- - - - - -15]。MGP为胶质母细胞瘤是一种migration-promoting蛋白,这表明它可以促进癌细胞扩散16]。MGP异种移植促进血管生成和增长的胶质母细胞瘤(17]。

MGP和MGP肽氨基酸包含61 - 77绑定vitronectin [6]。Vitronectin绑定建议锚MGP机制在细胞外基质可以绑定到每个位置和/或钙,防止钙化。MGP至少有2个功能域,vitronectin细胞外基质绑定域c端和钙化抑制域的氨基端一半的蛋白质。MGP抑制软组织钙化。MGP不足导致矿化的缺陷。MGP-null转基因小鼠受矿化动脉和软骨。突变在人类MGP防止合成功能性MGP遭受Keutel综合症,过度钙化的软骨和肺动脉狭窄(5,18,19]。过度钙化发生如果MGP缺席,但抑制钙化的机制是未知的。假设机制抑制钙化的调节骨形成protein-2 (BMP-2),一个细胞因子/成形素转化生长因子β总科(10,20.- - - - - -23]。在运输磷酸钙复合物也被建议,因为MGP结合磷酸钙晶体和形成血清复杂fetuin-A和磷酸钙(24,25]。钙化抑制由MGP连接到杯子中残留的氨基端一半的MGP BMP-2参与绑定,羟磷灰石,fetuin-A磷酸钙复合物(22,24- - - - - -26]。杯子域包括维生素K-dependent gamma-carboxyglutamic酸(GLA),所有3磷酸丝氨酸(2,27,28]。杯子,杯子的功能作用域是由钙化发生的缺陷与华法林治疗后,杯子形成的抑制剂(29日,30.]。

目前的研究表明MGP纤连蛋白结合,并增加纤连蛋白的细胞粘附和传播。MGP定位与纤连蛋白在许多胚胎组织,可能增加细胞矩阵互动发展。MGP函数的一个方面是由绑定纤连蛋白和增加细胞与纤连蛋白的相互作用。

2。材料和方法

2.1。材料

矩阵杯子蛋白质纯化从牛骨描述,最后一步是反相净化在C18柱(31日]。在高效液相色谱纯化,纯化后MGP迁移作为一个乐队在sds - page。MGP是一个相对不溶性蛋白质的近似水溶性10μg / mL;纯化MGP一直−20°C大约40%乙腈溶液和0.06%三氟乙酸在水里。一个典型的净化包含峰值0.2到0.4毫克/毫升。的最终浓度MGP是通过稀释10点到水的缓冲μg / mL或更低。MGP估计浓度的吸光度在280 nM,使用1.0毫克/毫升的消光系数= 1.0吸光度单位。兔牛MGP和纯化抗体免疫球蛋白部分生产使用所述皮尔斯Immunopure列(6,31日]。相对应的MGP肽氨基酸蛋白质分泌人类NH 61 - 77₂-ERYAMVYGYNAAYNRYF-COOH分子合成的田纳西大学的资源中心,HSC。牛血清白蛋白、人血浆纤连蛋白和蛋白水解片段,包括III1-C多肽(anastellin)豚鼠肝组织转谷氨酰胺酶(tTG),人体纤维蛋白原,明胶,汇集正常兔血清,买来σ。Vitronectin购买从费雪(BD生物科学)。353915猎鹰96 - elisa板用于细胞附件化验。Lab-Tek II 4-chamber玻片买来Nalge Nunc。实验室试剂的免疫组织化学是向量。可约交联化学Dithiobis (succinimidyl proprionate) (DSP)和Immunopure免疫球蛋白净化装备从皮尔斯被购买。电泳和吸水物质来自Bio-Rad实验室,除非另有指示。各种化学成分的缓冲区分析试剂级或更好。

2.2。固相测定蛋白质绑定

蛋白结合能力评估的过滤器固定目标蛋白质结合碘化MGP覆盖缓冲区。纯化MGP作为示踪剂碘化(如前所述31日]。硝基评估MGP绑定的方法转移蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS - page)和electroblotting前面描述的6,31日- - - - - -33]。简单,运行在一个蛋白质sds - page然后转移到Shleicher Schuell BAS-NC强化硝化纤维膜通过electroblotting Hoefer electroblot装置(6]。在一些实验中蛋白质被转移到膜通过dot-blotting Bio-Rad Bio-dot装置中描述(6]。膜在1%牛血清白蛋白(BSA)、磷酸10毫米,140毫米氯化钠,pH值7.4 (BSA-PBS)一夜之间在4°C。过滤器执行覆盖BSA-PBS 0.1%渐变20缓冲区包含放射性标记的MGP在环境温度为4个小时,然后洗孵化缓冲区。膜暴露在柯达柯达电影女士以下以下Transcreen-HE加剧屏幕和开发人员开发一个自动电影。AlphaImager 2000文档,与数码相机获取的图像分析系统。

2.3。交联的MGP蛋白质

纤连蛋白(FN)、纤维蛋白原(FG),和vitronectin (VN)混合组织转谷氨酰胺酶(tTG)和碘化MGP,分别在缓冲区包含0.05米三,钙2.5毫米,1毫米二硫苏糖醇(TCD缓冲区)在37度。这是孵化2小时。最终浓度为0.18毫克/毫升FN, 0.18毫克/毫升FG,或0.18毫克/毫升VN孵化了0.0125毫克/毫升tTG和微量的^125年I-MGP包含30000 dpm (2.5 ng / mL)。确定MGP抗体的影响,31日μg / mL兔子anti-MGP免疫球蛋白是包括在孵化(见图2 (c))。孵化后,样本处理立即SDS页面示例缓冲区包含2% SDS和2% 2-mercaptoethanol治疗100度为2分钟。控制孵化项目省略tTG或只包含MGP。电泳凝胶处理包装在塑料薄膜和接触柯达以下电影女士与他在−提高适当的时候屏幕80°C。曝光后,电影是如上所述。凝胶是coomassie蓝色彩色胶片曝光后可视化蛋白质。

DSP交联遵循制造商的指示。0.5毫克/毫升纤连蛋白III1-C多肽,0.5毫克/毫升FN, 0.5毫克/毫升VN,或0.5毫克/毫升卵白蛋白和微量的孵化^125年-I-MGP (30000 2.5 ng / mL, dpm)环境温度2小时5毫米磷酸,75毫米氯化钠,EDTA 2.5毫米和0.05毫克/毫升明胶pH值7.4。2小时后,1毫克/毫升DSP或同等体积的DMSO控件被添加在环境温度为30分钟。反应就熄了在环境温度为15分钟与三羟甲基氨基甲烷反应pH值8液自由DSP冻结在−20度SDS凝胶电泳和凝胶过滤色谱法。SDS - page,样品被稀释2% SDS样品缓冲pH值6.8 2-mercaptoethanol有或没有2%,煮2分钟。凝胶过滤色谱法,样品稀释4 M盐酸胍,0.1米三,渐变20 0.1%,0.5毫克/毫升明胶pH值8.0。一些样品减少2% 2-mercaptoethanol在环境温度为10分钟打破DSP交联前稀释缓冲。凝胶过滤色谱法进行AP (Pharmacia-LKB) Sephacryl人力资源售价用Bio-Rad列(厘米)胍平衡有4米,0.1米三,和0.1%的渐变20,pH值8.0。恒定体积分数(30滴/分数)收集和统计Packard Auto-gamma计数器确定放射性MGP洗脱的位置。与DSP控制MGP和卵白蛋白孵化,MGP,交联蛋白没有孵化DSP, DSP处理与巯基乙醇样品减少,减少和破坏交联。

2.4。细胞连接

确定MGP影响细胞对纤连蛋白,海拉细胞被用作衍生出来的一个不朽的癌症细胞系细胞受欢迎的作为一个模型的行为如附件,传播,整合素作用[34- - - - - -37]。海拉细胞表达整合蛋白结合纤连蛋白和vitronectin。初步研究证明他们有剂量依赖性细胞连接反应增加浓度矩阵的蛋白质。短期内附件研究细胞释放后1小时内支线板块进行。短细胞附件时间最小化的分泌蛋白质和MGP希拉派生的依恋。海拉细胞生长在Liebovitz l - 15中补充10%胎牛血清(的边后卫)与庆大霉素和两性霉素B在推荐添加浓度。80 - 95%汇合的细胞收获通过释放5毫米EDTA在calcium-free PBS pH值7.4,用10%的边后卫l - 15和resuspended - 250000细胞在无血清l - 15 /毫升。细胞悬液立即用于细胞下面附件化验。

在一个典型的细胞连接试验,96 -孔板涂以纤连蛋白的浓度表示50 mM碳酸氢钠缓冲pH值9.6(外套缓冲区)。为控制没有纤连蛋白涂层处理缓冲区。孵化后一夜之间在4°C保鲜膜覆盖以防止蒸发,纤连蛋白的解决方案被删除,取而代之的是表示数量的MGP仅在外套缓冲区或外套缓冲区控制。孵化后37°C在湿润的气氛中为3小时,第二次MGP或控制解决方案拆除,代之以阻止与1% BSA在PBS溶液pH值7.4已热灭活30分钟的65°C。1.5小时后37°C在湿润的气氛中,井清空和25000年海拉细胞无血清培养系统中添加0.1毫升的l - 15中使用一个8-well多井吸管。Vitronectin介导细胞附件相同的实验进行过程中,除了Vitronectin代替板中纤连蛋白涂层。附件在37°C在湿润的气氛中1小时。媒介是轻轻删除。井立即洗两次与血清l - 15中,然后用96%乙醇固定的10分钟,然后沾0.1%结晶紫染料在蒸馏水在环境温度为30分钟。染料被移除和水井洗轻轻地0.375毫升蒸馏水的3倍。 After wells have dried completely, 0.1 mL/well of 0.2% triton X100 is added and incubated at ambient temperature overnight covered with parafilm to prevent evaporation. The plates are read at 595 nm on a Molecular Devices SpectraMax 2500 multiwell plate reader. Data is entered as replicates (usually 6 but a minimum of 4 replicates for each data point) into Prism 2.0 for analysis, nonlinear regression plotting, and statistical analysis. In some experiments the first fibronectin coat is replaced by a first MGP coat and then followed by a second coat of fibronectin to ascertain the effect of switching the order of addition of fibronectin and MGP. In some experiments after an initial coat of fibronectin the remaining nonspecific protein binding sites on the plate are blocked with BSA-PBS before addition of MGP to see if MGP effects required nonspecific protein binding sites on wells. In other experiments the effect of rabbit anti-MGP antibody on MGP enhancement of fibronectin-cell binding was assessed by adding 31 μ克/毫升(0.0312_280年/毫升)的anti-MGP免疫球蛋白在第二涂层包含MGP一步。添加同等浓度的非特异性的兔免疫球蛋白作为控制。

2.5。细胞扩散

海拉细胞在种植和收获nonenzymatically如上所述,洗后一旦与l - 15补充10%的边后卫,细胞在无血清l - 15 resuspended介质15000细胞/毫升。9000年海拉细胞/ 0.6 mL被添加到每个商会Lab-Tek 4室玻璃幻灯片。Lab-Tek室幻灯片是先前涂有0.0,0.2,0.4μg / mL纤连蛋白的外套缓冲一夜之间在4°C,然后第二个层3μg / mL MGP 3小时37°C,然后用热灭活阻塞BSA-PBS 1.5 h在37°C如上所述。细胞连接了2小时,然后与血清l - 15中轻轻冲洗两次。新添加了1%多聚甲醛在PBS修复细胞在环境温度为10分钟,洗PBS 10分钟,然后用0.1% triton x - 100治疗在PBS 5分钟permeabilize细胞。热灭活BSA-PBS添加10分钟。然后换成BSA-PBS 1: 40稀释Phalloidin Alexafluor488热灭活BSA-PBS 20分钟。后一个洗热灭活BSA-PBS室与PBS洗两次。幻灯片培养皿放置在一个10厘米,沉浸在PBS然后使用10 x或40 x水浸目标成像在蔡司Axiophot荧光显微镜配备了数码相机。16个随机微观领域是每个条件的成像。

细胞传播评估使用NIH形象公开可用的软件。14 - 16随机微观领域10 x上拍摄的图像目标进行了分析,用最少的100个细胞为每个条件进行了分析。结果给出了平均细胞面积和标准误差。程序在NIH图像如下:介绍和教程被用来确定细胞区域。简单,低功率的图像细胞用10倍目标被修改autocontrast和灰度转换在Photoshop中。这些照片是在国家卫生研究院的形象,按比例缩小的以适应窗口,和修改鲁茨工具将细胞红然后下分析,分析粒子。考试后手动删除集群分布/附着细胞分析,结果复制到excel区域/细胞。数据传输棱镜进行绘图和统计分析。细胞扩散分析类似于之前的出版物中使用测量元件附件和传播在钛表面(38]。

2.6。Immunolocalization

福尔马林固定石蜡包埋部分19天胚胎获得如前所述[4,6]。的部分和二甲苯deparaffinized,水化,煮2分钟的0.01柠檬酸钠,pH值6抗原检索如前所述[6]。Immunoperoxidase染色后Vectastain ABC精英装备指令(向量实验室)。部分被封锁和缓冲区包含正常的马血清20 1.5%然后用兔子anti-MGP孵化μg / mL或鼠标antifibronectin单克隆抗体(克隆IST-3σ)1:5000稀释。一夜4°C孵化和洗涤后,生物素化的马antiuniversal免疫球蛋白(向量)补充道。洗后,绑定探测器由Vectastain ABC过氧化物酶试剂民建联本地化。甲基绿被用作计数器污渍。在同一浓度控制特异性的兔免疫球蛋白或没有主要的抗体。照片被收集的蔡司Axiophot显微镜配备电脑和6.3倍和40倍的目标。

3所示。结果

3.1。MGP纤连蛋白结合第三和第一类纤连蛋白的领域

见图1(一)与放射性叠加dot-blotted蛋白质MGP表明MGP结合纤连蛋白、纤粘连蛋白片段III1-C (Anastellin)。MGP没有绑定卵白蛋白或其他的碎片纤连蛋白除了110 kilodalton纤连蛋白片段MGP弱结合。MGP结合纤连蛋白sds - page乐队的III1-C(图1 (b))。我们以前报道,MGP vitronectin和纤连蛋白结合但不是层粘连蛋白,II型胶原蛋白,骨钙素、组织转谷氨酰胺酶,硫酸软骨素粘多糖,实验,β-酪蛋白,卵白蛋白、牛血清白蛋白(6]。

3.2。纤连蛋白结合一个MGP c端肽的氨基酸组成的61年到77年

我们曾表明MGP_{61 - 77}肽结合vitronectin [6]。图1 (c)表明MGP_{61 - 77}第一种三世纤连蛋白结合域。

3.3。MGP纳入转谷氨酰胺酶交联纤连蛋白

组织转谷氨酰胺酶(tTG)交联纤连蛋白和纤维蛋白原形成多聚体。MGP纳入这些蛋白质交联的多聚体。tTG在混合物的孵化^125年I-MGP与纤连蛋白、纤维蛋白原、vitronectin分别。分析了产品运行在sds - page鉴定样品的放射能照像放射性MGP(图的变化2(一个))。Radioiodinated MGP被纳入高纤连蛋白(FN)和纤维蛋白原(FG)乐队。没有MGP纳入高分子量乐队MGP孵化与FN或成品测试的缺失。组织转谷氨酰胺酶没有形成高分子量乐队MGP和vitronectin。转谷氨酰胺酶少量MGP转向高分子量但却程度大小或发现纤连蛋白和纤维蛋白原。乐队在图的底部2(一个)是免费radioiodinated MGP。图2 (b)显示了coomassie蓝染色凝胶暴露在电影在图2(一个)。tTG转换只有一小部分的纤连蛋白(FN)多聚体在车道几乎没有变化,没有测试。tTG是更有效地交联纤维蛋白原(FG)多聚体可以作为额外的乐队当tTG存在但不是在样品没有测试(图2 (b))。注意coomassie蓝染色乐队在所有车道BSA,缓冲区用于分离的组件radioiodinated MGP在非公司碘碘化(6]。BSA作为保护碘化MGP自由基清除剂。在tTG MGP交联纤连蛋白巷comigrated叠加凝胶表面或顶部的凝胶。的存在anti-MGP多克隆抗体阻止组织转谷氨酰胺酶的能力将MGP成纤连蛋白多聚体(图2 (c))。增加tTG MGP转移的数量增加的浓度与纤连蛋白分子量较高。转谷氨酰胺酶可以MGP合并到更大的纤连蛋白复合物但不是vitronectin,卵白蛋白、牛血清白蛋白。

3.4。MGP成为纤连蛋白交联III1-C

图1表明MGP和纤连蛋白III1-C绑定过滤器覆盖化验。化学交联可以确认MGP III1-C也接近于解决方案。^125年I-MGP和III1-C vitronectin或卵清蛋白与DSP关联条件下孵化之后的反应,一个包含homobifunctional二硫化交联剂。蛋白质相互作用的预测将成为共价交联的交联剂。如果添加到DSP纤连蛋白的混合物III1-C和^125年I-MGP,分子量高交联物种观察放射能照像在sds - page(图3(一个)IIIC−2我,+ DSP车道)。如果样品减少,2-mercaptoethanol (2), DSP交联减少和更大的乐队(图消失3(一个)IIIC + 2, + DSP车道)。没有额外的高分子量IIIC乐队存在的缺乏DSP的交联剂(IIIC−2我,−DSP车道)。缺乏高分子量的物种是由于破坏蛋白质相互作用在2% SDS缓冲加热到100°C。MGP和vitronectin或纤连蛋白是由DSP虽然不是相同的交联程度与III1-C看到(图3(一个)VN FN,−2我,+ DSP车道)。交联的增加可能III1-C和MGP结果必然复杂,增加交联聚合的效率。卵白蛋白是一个负控制绑定;由DSP MGP和卵白蛋白交联。

如果DSP交联的产品^125年III1-C I-MGP、纤粘连蛋白在4 M胍变性含有缓冲然后分析Sephacryl售价凝胶过滤,与MGP洗脱图转移到附近的一个高峰排除体积,结果(图3 (b),满圈)。如果样品交联减少与巯基乙醇列加载之前,洗脱图类似于控制,例如,^125年独自I-MGP(图3 (b),打开圆圈)。的^125年我MGP高峰通常洗提分数37与未成年人达到分数28(图3 (b)、开放的三角形)。控制反应^125年I-MGP DSP,^125年I-MGP + III1-C没有DSP在凝胶过滤相同洗脱图与MGP单独或降低交联(开放的钻石或广场、职责)。4倍减少数量的III1-C混合物中标记MGP和DSP导致较小的售价列峰(数据没有显示)。数据显示,III1-C和交联剂是必要的生产转变MGP峰值和符合纤连蛋白之间的密切互动III1-C MGP。

3.5。MGP增强细胞对纤连蛋白

细胞附着在纤连蛋白以剂量依赖的方式。图4(一)表明细胞附件纤连蛋白的增加而增加,直到达到最大纤连蛋白涂层浓度在0.8和3.2之间μ克/毫升与封闭的圈子(实线)。MGP增强细胞对纤连蛋白(带虚线的圆圈,图4(一))。等量的纤连蛋白的细胞附件曲线转移到左边如果MGP添加3μ克/毫升。结果类似于增加等量的明显的亲和力的细胞纤连蛋白(图4(一))。最大细胞结合发生在0.8附近μ克/毫升纤连蛋白。MGP独自没有调解细胞附件。此外,MGP没有增加细胞附件之外的最大观测纤连蛋白。缺乏固有细胞附件活动与缺乏细胞MGP在协议绑定活动之前报道(39]。结果证明MGP增强细胞对纤连蛋白。

MGP增加细胞对纤连蛋白相比,MGP vitronectin没有增加附件的细胞。图4 (d)表明MGP抑制细胞vitronectin附件。有一个小的抑制作用MGP vitronectin细胞结合,但在某些实验中没有显著的影响。在同等条件下和细胞系,MGP不断增强细胞纤连蛋白而不是vitronectin附件。

抗体MGP抑制MGP增强细胞的能力附件(图4 (b))。Anti-MGP兔免疫球蛋白废除MGP的能力来增强细胞对纤连蛋白(MGP MGP + antiMGP相比,),但等量的特异性的兔免疫球蛋白g没有。存在的免疫球蛋白浓度使用并不影响细胞对纤连蛋白,因为anti-MGP免疫球蛋白或控制添加免疫球蛋白缺乏MGP相同的单独控制纤连蛋白(控制图4 (b))。

越来越多的MGP剂量依赖性增强细胞对纤连蛋白(图4 (c))。MGP影响细胞纤连蛋白没有明显关联的最大约束力。剂量反应曲线增加MGP(0.0, 0.8, 3.0和6.0μg / mL)显示明显的变化关联绑定的增加转变曲线左边指示细胞附着在每个纤连蛋白的浓度增加。再一次,最大细胞纤连蛋白结合(图未受到影响4 (c))。没有内在MGP细胞附件活动,因为细胞没有附加即使在最高的MGP (6.0μ如果没有纤连蛋白g / mL)。

3.6。细胞纤连蛋白是由MGP增强扩散

细胞连接和传播在整合蛋白纤连蛋白和其他病灶粘连细胞粘附蛋白形式连接到肌动蛋白细胞骨架。MGP是否影响细胞传播纤连蛋白,细胞的平均面积与纤连蛋白单独或纤连蛋白+ MGP决心通过计算平均细胞面积从100细胞中描述实验过程。MGP诱导显著更大的细胞蔓延在每个纤连蛋白浓度(图5(一个),FN与FN + MGP,由星号表示)。有太少的细胞连接仅MGP井测量传播(MGP没有细胞粘附活动本身)。

选择的微观领域的出现的细胞附着在0.4μg / mL纤连蛋白涂层表面显示的数据5 (b)和5 (c)。选择的微观领域的出现的细胞在同一浓度的纤连蛋白+ MGP数据所示5 (d)和5 (e)。增强扩散的细胞纤连蛋白和MGP是可见的。

3.7。MGP在胚胎组织在同一地区是纤连蛋白

之前显示MGP大鼠胚胎肾脏定位在发展中输尿管和肾收集6]。纤连蛋白是广泛分布于大鼠胚胎肾、输尿管和收集管包括(数字6(一),6 (b),6 (c))。本地化的MGP连续切片显示,纤连蛋白存在于一些相同的收集管和输尿管上皮MGP(数字6 (d),6 (e),6 (f))。箭头在图6 (b),6 (c),6 (e),6 (f)显示类似的结构与纤连蛋白和MGP串行部分。纤连蛋白广泛分布在发展中肾、存在与很少或没有MGP其他小管,结缔组织地区,形成肾小球(数字6(一)- - - - - -6 (c))。现阶段发展中肾小球很少或没有MGP开发(图6 (d))。

4所示。讨论

MGP纤连蛋白结合。这证实了先前的结果公布,显示MGP纤连蛋白结合,vitronectin,和纤维蛋白原,但不是组织转谷氨酰胺酶II型胶原蛋白,fibromodulin,骨钙蛋白、骨粘连蛋白、肝素、decorin,酪蛋白,或卵清蛋白(6]。

当前的研究表明,MGP绑定到一个地区的纤连蛋白由第III型重复称为III1-C或anastellin [40]。MGP没有绑定30、45 kilodalton纤连蛋白的片段,不包含一个类型III重复(40,41]。MGP显示出一些纤连蛋白的亲和力110 kilodalton片段,由许多类型III重复(40,41]。

MGP区域组成的氨基酸61 - 77提出了作为细胞外基质结合地区(6]。当前的研究表明肽纤连蛋白以及纤连蛋白结合III1-C片段。所有MGPs隔绝矿化组织糖已被截断。例如,人类MGP最初长84氨基酸,但7氨基酸从糖基,这样成熟的蛋白质是长77氨基酸以肽序列完全相同肽用于这项研究[42]。而牛MGP在这项研究中,使用结果表明,人类MGP将绑定到细胞外基质蛋白通过羧基末端序列。的蛋白水解处理MGP c端删除氨基酸78 - 84可能与激活蛋白质交互网站(42]。

纤连蛋白交联的组织转谷氨酰胺酶的底物(43]。交联的独处纤连蛋白形成的孵化与tTG类似于不溶性矩阵纤连蛋白存在于许多组织。建议MGP MGP、纤粘连蛋白的密切关联可能会纳入纤连蛋白交联的多聚体。事实上,期间除了MGP纤连蛋白的交联tTG导致其合并成一个更大的纤连蛋白多聚体的形式。的^125年沸腾后我MGP保持纤连蛋白多聚体2% SDS水解MGP和纤连蛋白的相互作用。因此MGP比与纤连蛋白与交联纤连蛋白密切相关。有可能转谷氨酰胺酶交联MGP纤连蛋白,尽管进一步的研究是必要的证明交联发生和确定哪些MGP、纤粘连蛋白的氨基酸。

少量的转变MGP更高分子量的tTG暗示它可能成为自身交联或测试,但我们无法直接建立MGP衬底的测试。证明MGP衬底对tTG我们试图整合放射性标记的腐胺(描述44]。结果是不确定的,以最小的整合radiolabel MGP。之前我们已经表明,MGP不绑定tTG [6]。MGP可能需要coreactant纤连蛋白和纤维蛋白原变成有效交联。与交联协会MGP纤连蛋白证实与纤连蛋白MGP的密切联系。MGP也变得纳入tTG交联纤维蛋白原。MGP以前显示绑定到纤维蛋白原(6]。虽然MGP结合vitronectin, tTG没有MGP合并到高分子量与vitronectin组件。结果表明MGP可能会交联体内纤连蛋白和纤维蛋白原的一个组成部分。

纤连蛋白的III1-C MGP域是一个结合位点。这已经建立了覆盖化验和DSP交联的MGP纤连蛋白III1-C多肽。叠加分析表明,61 - 77 c端MGP氨基酸肽可以绑定到纤连蛋白和III1-C多肽。MGP用于这些研究从钙化的骨分离,伽马羧酸盐。一种noncarboxylated MGP (ucMGP或Glu-MGP)积累在钙化动脉粥样硬化斑块22,30.]。进一步的研究将是必要的,以确定是否Glu-MGP纤连蛋白和MGP共享绑定和III1-C域。

MGP增强细胞对纤连蛋白。这不仅仅是提供更多的胶蛋白的累加效应,因为MGP本身没有活动的粘合剂。目前的结果支持报告缺乏MGP胶粘剂函数(39]。缺乏内在的细胞粘附活性表明MGP行为通过改变细胞纤连蛋白结合的能力。MGP绑定的纤连蛋白似乎是关键,因为增强细胞依附在BSA-coated表面MGP-fibronectin绑定的增强可能发生的唯一方式。MGP绑定的蛋白质本身并不足以提高细胞附件。MGP增强细胞纤连蛋白而不是vitronectin附件,另一种细胞外基质蛋白受MGP [6]。MGP也增强扩散的细胞纤连蛋白。

这些研究探索MGP绑定机制纤连蛋白和外源性细胞纤连蛋白和MGP依恋的影响和传播。海拉细胞细胞系特征,是一种流行的细胞模型附件。海拉细胞表达的整合蛋白纤连蛋白和vitronectin绑定(34- - - - - -37]。MGP的目标是描述影响纤连蛋白绑定和cell-fibronectin交互在短,1小时时期细胞纤连蛋白的合成和分泌,MGP和其他附件蛋白质可以最小化。

文献表明,MGP可能依赖于肿瘤类型的影响。有正相关MGP表达与肿瘤进展和预后不良的神经胶质瘤(15,16,45),但一个负相关MGP表达在肾和前列腺癌肿瘤进展和转移(13)和减少MGP被发现在结肠癌癌(46]。MGP增强神经胶质瘤细胞迁移(16]。MGP异种移植促进血管生成和增长的胶质母细胞瘤(17]。未来的研究应该确定MGP多种正常和肿瘤细胞类型的影响。其他研究确定影响迁移和入侵检测的MGP海拉与其他癌症细胞类型相比,但长期的研究需要考虑细胞合成纤连蛋白的能力,MGP,整合蛋白或金属蛋白酶影响迁移和入侵。

MGP mRNA的表达非常高的胚胎大鼠肾脏(1,4]。我们也证明MGP蛋白质合成在这段时间里,MGP mRNA的本地化是最强的发展中输尿管和收集胚胎19天的小管4]。MGP蛋白质局部鼠胚胎肾肾输尿管和发展收集6]。

Immunolocalization研究显示,胚胎输尿管MGP本地化和收集小管也包含丰富的纤连蛋白。然而,纤连蛋白也含有很少或根本没有MGP丰富的地区。因此MGP没有存入所有纤连蛋白包含矩阵。本地化支持MGP与纤连蛋白相互作用的可能性。然而,还需要进一步的研究来证明体内发生的交互。

钙化抑制和BMP-2绑定需要转译后的羧化作用在维生素K-dependent一步(生产杯子22,26,29日]。3的磷酸化丝氨酸残基的氨基末端MGP年底是必要的为其分泌抑制羟磷灰石沉积的细胞外基质(2,47]。氨基酸的氨基末端1-54 MGP含有磷酸丝氨酸和杯子钙化所必需的抑制,而c端肽之前的研究已经证实,绑定vitronectin和在当前研究结合纤连蛋白(6,26]。

目前尚不清楚是否绑定纤连蛋白或调节细胞纤连蛋白反应MGP的钙化抑制活动有关。更有可能的是,这个MGP财产migration-promoting有关活动,为胶质母细胞瘤细胞(16]。MGP可能是一种多功能蛋白,可以采取行动修改cell-matrix交互也在癌症细胞和胚胎生活或钙化抑制剂在成人组织选择。这可能有助于解释为什么很多组织包含MGP合成细胞不成为MGP基因敲除动物和钙化Keutel综合症,一种人类疾病,其特征是MGP损失函数。

5。结论

MGP纤连蛋白结合。MGP结合61 - 77年通过氨基酸序列出席了生理糖基。纤连蛋白结合MGP通过第III型域称为anastellin或III1-C。MGP可以成为转谷氨酰胺酶交联的纤连蛋白多聚体的一部分,表明它可能是纤连蛋白矩阵的一个组成部分。在纤连蛋白和细胞连接和传播更好MGP比单独纤连蛋白涂层表面,即使MGP本身没有细胞附件活动。在组织,MGP定位附近纤连蛋白,这表明蛋白质之间的相互作用是可能的体内。MGP改变细胞的能力与纤连蛋白的相互作用是一个潜在的肿瘤细胞和某些原因过度表现MGP胚胎细胞。

缩写

MGP:	矩阵杯子蛋白质
SDS:	十二烷基硫酸钠
页面:	聚丙烯酰胺凝胶电泳
kDA:	Kilodaltons。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Satoru肯Nishimoto构思和设计研究和参与其执行。宫古岛Nishimoto immunolocalization进行研究和细胞传播分析和成像,蛋白结合研究,参与细胞依恋的研究。作者阅读和批准最终的论文。组织收集使用协议批准IACUC田纳西州大学健康科学中心。

确认

这项研究由美国心脏协会支持部分东南补助金995771 v和国防部BCRP格兰特DAMD 17-01-1-0639。

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