药理机制的描述延迟钙放松管制与美沙酮SH-SY5Y细胞受到挑战

文摘

以前,我们已经表明,SH-SY5Y细胞暴露于高浓度的美沙酮死于necrotic-like细胞死亡机制相关延迟钙管制(论证)。在这项研究中,我们表明,在Ca^{2 +}对0.5毫米美沙酮的反应,SH-SY5Y细胞可以汇集成四个不同的基团。在一个广泛的药理调查中,不同的相关性^{2 +}相关机制methadone-induced以便调查包括细胞外钙、l型^{2 +}渠道,阿片受体线粒体内膜的潜力,线粒体ATP合成、线粒体钙^{2 +}/ 2 na⁺换热器、活性氧和线粒体渗透性转换。只有那些寡霉素等化合物针对线粒体FCCP,本金保证产品37157年,环孢霉素能够修改methadone-induced Ca^{2 +}dyshomeostasis表明美沙酮诱发以便通过调节线粒体钙处理的能力^{2 +}。一致,线粒体成为显著短和圆润的美沙酮。此外,耗氧量的分析分离大鼠肝线粒体建议美沙酮影响线粒体Ca^{2 +}吸收呼吸substrate-dependent。我们认为美沙酮引起细胞内钙的失败^{2 +}体内平衡,这种效应与线粒体形态和功能的变化。有可能的是,这种机制导致退行性与美沙酮治疗相关副作用。

1。介绍

盐酸美沙酮(D, L-methadone)是经常使用在不同的疗法包括阿片类药物成瘾1),长效止痛剂在癌症和神经性疼痛综合征(1- - - - - -3]。然而,很多报告显示对人类认知产生负面影响,长期暴露在阿片类药物。病人接受美沙酮维持程序显示认知能力受损等方面的精神运动性能,信息处理,注意,解决问题,内存、决策、反应时间、和情绪面部表情识别(4- - - - - -10]。

胞质([Ca free-calcium浓度的变化^{2 +}]_cyt)参与控制大量细胞和生理过程,包括神经元兴奋性突触可塑性,和基因转录11,12]。然而,生理Ca^{2 +}信号可以切换到一个死亡信号时(Ca^{2 +}]_cyt大幅增加。例如,excitotoxic高谷氨酸浓度增加导致初始瞬态(Ca^{2 +}]_cyt其次是延迟,不可逆(Ca^{2 +}]_cyt被称为延迟钙管制(论证)。虽然前面几个步骤以便仍有待澄清,有证据表明,DCD计划是一个序列的不可逆转的终点包括线粒体Ca^{2 +}重载。以便决定之前和可靠地预测培养神经元的坏死死亡13]。

线粒体是重要的细胞Ca^{2 +}体内平衡。他们在Ca缓冲区的变化^{2 +}浓度通过Ca^{2 +}何时何地(Ca^{2 +}]_cyt水平是通过一个门槛的线粒体Ca^{2 +}uniporter被激活,慢慢地释放^{2 +}回(Ca时胞质^{2 +}]_cyt低于这个点(14]。线粒体钙^{2 +}过载,如果足够大而持续,可能导致线粒体渗透性转换孔注射(MPTP药物)的形成,最终导致细胞死亡(11,15]。因为,线粒体可能积累大量的Ca^{2 +}在神经毒素暴露,一个可能性是,以便决定可能代表线粒体Ca的最终结果^{2 +}过载。MPTP是一个大型的、蛋白质的Ca^{2 +}激活,质子和ADP-inhibited压敏电阻器孔隙。它跨越了内在和外在线粒体膜允许通过离子和基质小于1.5 kDa。典型,注射的MPTP药物抑制了环孢菌素(16,17]。

SH-SY5Y细胞被认为是一个合适的模型来调查opioid-mediated反应神经元。这些细胞表达- - -阿片受体(18]。在先前的研究中,我们表明,SH-SY5Y细胞暴露于高浓度的美沙酮(0.5毫米)死亡通过necrotic-like细胞死亡机制和可能发生的变化,美沙酮(Ca^{2 +}]_cyt(19,20.]。然而,底层机制造成的改变(Ca^{2 +}]_cytSH-SY5Y细胞在美沙酮的存在仍然未知。因此,本研究的目的是调查这些机制。清楚地了解调解这一现象的因素可能有助于解决机制,促进神经细胞死亡在methadone-induced认知损伤。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

镀SH-SY5Y细胞(写明ATCC)的密度为5.3×10⁴细胞/厘米²在菜35毫米高IbiTreat (Martinsried ibidi GmbH,慕尼黑,德国)如前所报道(21]。

2.2。钙的测量

(Ca的变化^{2 +}]_cytSH-SY5Y细胞被加载测量细胞的钙探针Fura2 / AM和使用一个倒置荧光显微镜(尼康Eclipse TE2000-S)所描述的其他地方22]。细胞灌注生理盐水中包含140毫米,5毫米氯化钾,1毫米MgCl₂,2.5毫米CaCl₂10毫米玫瑰,11毫米葡萄糖,pH值7.35。比率荧光发射的兴奋在340和380海里捕捉每5秒(22]。美沙酮或其他化合物是从1000 x股票的解决方案添加到适当的最终浓度。所选化合物的影响(Ca上测试过^{2 +}]_cyt在没有和0.5毫米美沙酮在不同的细胞中。细胞池根据上涨的动力(Ca^{2 +}]。

2.3。线粒体形态

直接可视化完整细胞线粒体形态变化overexpressing pDsRed2-mito质粒(Clontech实验室公司山景、钙、美国)莱卡SP2共焦显微镜(63×1.4 NA客观)使用。对细胞的转染试剂使用Lipofectamine(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) [23]。

2.4。线粒体隔离

要看更多有关憩苑鼠肝线粒体被孤立在要看更多有关憩苑/ EDTA和媒体包含210毫米甘露醇,70毫米蔗糖,5毫米消息灵通的,有或没有1毫米EDTA, pH值7.4,根据标准程序(通过差速离心24]。线粒体蛋白质浓度测定使用微BCA试剂盒。线粒体悬浮液被保存在冰和立即用于测量摄氧率。

2.5。线粒体耗氧量

分离大鼠肝线粒体的摄氧率测定在37°C water-thermostatized孵化室与计算机控制的Clark-type O₂电极(英国Hansatech Oxygraph) 0.5毫升孵化缓冲区(30毫米145毫米氯化钾,玫瑰,KH 5毫米₂阿宝₄3毫米MgCl₂,0.1毫米EGTA, 0.1%脱脂BSA, pH值7.4)。呼吸底物使用复杂的I -或复杂的II-linked,谷氨酸/苹果酸2.5毫米或2.5毫米5毫米琥珀酸的2米鱼藤酮。添加以下应用:250ADP, 200M CaCl₂,0.4M FCCP, 0.5毫米美沙酮。估算线粒体钙^{2 +}在孤立的线粒体钙吸收^{2 +}指数计算,这表示摄氧率的比率由200年M Ca^{2 +}前摄氧率。

3所示。结果与讨论

在这项研究中,我们调查了methadone-induced上涨的机制(Ca^{2 +}]_cyt在SH-SY5Y细胞。符合从我们实验室以前的观测19)和其他数据(25),美沙酮诱导上升(Ca^{2 +}]_cyt在大多数SH-SY5Y细胞。然而,美沙酮在细胞明显不同的影响。(Ca的动态分析^{2 +}]_cyt没有录音,美沙酮的存在表明,四种不同的钙录音中可以观察到SH-SY5Y细胞。图1(一)显示记录的典型例子。第一组的细胞没有上升(Ca^{2 +}]_cyt观察整个期间(30分钟)的测量(1型)。第二组的细胞无法调节(Ca吗^{2 +}]_cyt体内平衡后不久的美沙酮(2型)和(Ca^{2 +}]_cyt不断增加。第三组显示Ca^{2 +}]_cyt放松管制的延迟15 - 20分钟(类型3)。最后,第四组能够控制(Ca^{2 +}]_cyt在最初增加(4)型。组1和4代表,分别停止响应的细胞和细胞与瞬态响应(Ca^{2 +}]_cyt和数量20.82和31.38%的细胞。然而,类型2和3显示短或延迟持续上涨(Ca^{2 +}]_cyt这可能被视为提前或延迟^{2 +}根据文献[放松管制26- - - - - -29日]。大量的细胞显示管制(2型和3型)达14.92%和32.83,分别占总数的。

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图1

^{2 + 2 +} _cyt ^{2 +} _cyt ^{2 +} _cyt ^{2 +} _cyt ^{2 +} _cyt ^{2 + + 2 +} t 美沙酮诱发Cadyshomeostasis。0.5毫米(a)的影响美沙酮(Ca]在SH-SY5Y细胞。代表录音的四个不同类型的反应包括没有(Ca]增加(1型),早期(Ca]持续增加(2型),延迟(Ca]增加(类型3),瞬态(Ca]增加(4)类型。(b) - (c)的相对丰度(%)SH-SY5Y细胞显示2型3型(b)或(c)录音没有与美沙酮治疗(控制)和(阿明费)。也显示在上述几种治疗方法的影响相对丰度。治疗方法包括细胞外钙(0 Ca), l型通道阻滞剂硝苯地平(2米);阿片受体拮抗剂纳洛酮(50米),线粒体解偶联剂FCCP (1米);ATP合酶抑制剂寡霉素(10g / ml),线粒体Na/Ca换热器CGP37157 (25米);超氧化物歧化酶模拟TEMPOL (0.2米)注射或MPTP药物拮抗物环孢霉素A (1米,CsA)。所有的治疗方法都执行5分钟前增加0.5毫米美沙酮。数据代表结果至少在三个独立的实验。;学生的以及与基底条件,(阿明费)。

我们已经分析了相对丰富的上述四种类型的录音没有(控制)和0.5毫米美沙酮的存在(美沙酮)。获得的结果数据所示1 (b)和1 (c)。显然,美沙酮减少类型4(瞬态响应细胞)和增加类型2和3(管制细胞)。这些结果表明,美沙酮可能诱发短或延迟Ca^{2 +}在SH-SY5Y细胞放松管制。

观察到的定量变化的机制类型的Ca^{2 +}响应由美沙酮是未知的。因此,我们进行了全面的药理研究调查的可能贡献不同的Ca^{2 +}相关的机制来对美沙酮的反应。如图1 (b)和1 (c)下面讨论,5分钟预处理SH-SY5Y细胞与不同条件和药物影响methadone-induced (Ca^{2 +}]_cyt反应,监测不同类型的改变频率的响应。我们发现在细胞外钙(0 Ca)缺席的情况下没有观察到的改变对美沙酮的反应(细胞)。这些结果表明,Ca^{2 +}条目并不能促进报道(Ca的变化^{2 +}]_cyt。确认细胞外钙^{2 +}没有参与这些反应我们测试的影响美沙酮在硝苯地平的存在,一个特定的异丙基l型钙^{2 +}通道阻断剂。硝苯地平(2米)不修改(Ca美沙酮的影响^{2 +}]_cyt在SH-SY5Y细胞(细胞)。所以,我们排除了这个压敏电阻器通道家族参与methadone-induced (Ca^{2 +}]_cyt变化。然后我们问是否细胞内Ca^{2 +}商店可能导致对美沙酮的反应。细胞治疗thapsigargin (1 - 100米),细胞内钙耗尽^{2 +}商店在美沙酮治疗。正如所料,thapsigargin诱导显著释放Ca^{2 +}从内质网,导致临时增加(Ca^{2 +}]_我未能在10分钟内回到基础水平。的详细观察美沙酮诱导(Ca^{2 +}]_我表明细胞反应部分受此影响治疗,表明钙的增长部分是由于从thapsigargin-sensitive释放,细胞内Ca^{2 +}商店(细胞)。我们发现在未经处理的细胞中添加thapsigargin感应瞬态增加(Ca^{2 +})被归因于Ca的泄漏^{2 +}从内质网。这种影响仅thapsigargin干扰类型2和3的解释反应后美沙酮(数据未显示)。

另一个可能的机制是内源性阿片受体的激活。测试这种可能性,我们把细胞与50米纳洛酮)的竞争对手阿片受体。我们发现这种治疗没有修改的相对丰度的四个类型的细胞群(细胞,实验4)。这一结果表明,[Ca的变化^{2 +}]_cyt美沙酮引起的,以便在SH-SY5Y类鸦片受体细胞是独立的。同意的缺乏阿片受体参与在这里找到,据报道,methadone-toxic途径并非由受体(19,30.- - - - - -32]。

测试线粒体的可能贡献我们使用了线粒体解偶联剂羰基氰化物p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP;1米)Ca^{2 +}吸收由线粒体强烈依赖于线粒体潜力( )。完善,FCCP潜在崩溃的线粒体,并破坏线粒体的Ca^{2 +}。我们发现,在未经处理的细胞,添加FCCP感应瞬态增加(Ca^{2 +})被归因于Ca泄漏^{2 +}从线粒体去极化的。我们发现FCCP诱导2型细胞的出现下降了44%而增加细胞显示3型反应的相对丰度的2.7倍FCCP(数字1 (b)- - - - - -1 (c))。FCCP废除1型细胞的存在。

上述结果表明,线粒体可能参与对美沙酮的反应。然而,它必须考虑的简单用法protonophores不允许明确研究线粒体钙的作用^{2 +}运输时也可能导致ATP / ADP比率的降低,从而影响ATP-dependent Ca^{2 +}泵(14]。之前的方法,利用调查synaptosomal Ca中线粒体的作用^{2 +}体内平衡是抑制线粒体ATP合成寡霉素和糖酵解的应用ATP和独立操作的来源 与特定的呼吸链抑制剂(33,34]。ATP合酶的抑制寡霉素阻止线粒体氧化磷酸化,但与protonophore,它不会引起水解cytoplasmically ATP生成。据报道,在Ca DCD计划可能会导致失败^{2 +}挤压引起的胞质ATP耗竭(26]。因此,我们测试了一个简短的影响,5分钟,孵化与10g / ml寡霉素在Ca^{2 +}响应。在这种情况下,寡霉素单独不修改(Ca^{2 +}]_cyt30分钟记录期间的反应。然而,寡霉素并改变(Ca^{2 +}]_cyt对美沙酮的反应。具体来说,大量的SH-SY5Y细胞显示2型反应池增加而细胞显示DCD-related 3型响应丢失。此外,寡霉素诱导细胞增加3.3倍显示类型4反应。进一步测试线粒体的贡献我们调查的可能作用线粒体Ca^{2 +}/ 2 na⁺换热器。线粒体钙^{2 +}流出通常主要由Ca^{2 +}/ 2 na⁺换热器。阻止线粒体钙^{2 +}退出我们使用CGP37157 (50米),Ca的抑制剂^{2 +}/ 2 na⁺换热器。5分钟接触细胞CGP37157显著增加细胞的比例没有上升(Ca^{2 +}]_cyt为了应对美沙酮在整个Ca^{2 +}]_cyt测量周期(1型)(数据未显示)因为CGP37157导致人口急剧减少的细胞显示2型(74%)或3型(85%)的反应。此外,细胞的相对丰度显示1型响应返回值获得的未经处理的细胞。这些结果支持数据表明线粒体的相关性methadone-induced DCD计划(数据1 (b)- - - - - -1 (c))。

测试的贡献我们使用cell-permeable活性氧物种,小分子化合物TEMPOL (6-tetramethylpiperidinyloxy 4-hydroxy-2 2 6日)模拟超氧化物歧化酶活性。在TEMPOL (0.2M;细胞),以不同的方式应对美沙酮。具体来说,TEMPOL减少细胞的数量显示2型反应70%,而大量的细胞显示3型反应主要是增加(3.5折)。类型1和4是几乎不存在。与我们的结果一致,尼科尔斯et al。28建议增强活性氧是论证的结果,而非原因。在他们的研究中,他们使用一种新的方法来监测原位线粒体的生物能量学的地位在培养神经元谷氨酸会引起的典范。同意这个,一般无效的抗氧化剂减少以便在谷氨酸的存在已被观察到35]。最后,我们测试了线粒体渗透性转换注射(MPTP药物)的贡献。额外的线粒体Ca流出^{2 +}可以通过注射诱导MPTP药物形成发生,依赖于线粒体基质Ca是哪一个^{2 +}可以抑制浓度和环孢霉素(16,17]。注射对MPTP药物参与我们管理CsA (1米)。CsA响应类型的发生减少2 36% (细胞)细胞培养的挑战与0.5毫米美沙酮。此外,符合假设论证的毛孔的作用,CsA诱导细胞显示类型4反应增加2倍。然而,这些结果的解释是困难的,因为CsA也可能抑制线粒体钙^{2 +}uniporter在某些情况下。

综上所述,我们的数据表明,只有药物影响线粒体钙的处理^{2 +}寡霉素等FCCP本金保证产品37157和环孢霉素A,能够调节methadone-induced延迟钙在SH-SY5Y细胞放松管制。因此,我们得出这样的结论:methadone-induced dyshomeostasis是由不当引起的运转机制,直接控制线粒体活动而不是质膜钙的参与^{2 +}渠道和阿片受体。

接下来,美沙酮对线粒体形态的影响进行了研究与pDsRed2-mito SH-SY5Y细胞转染。在未经处理的文化中,线粒体呈现一个漫长而管状形态(图2(一个)),这成为显著短又圆美沙酮治疗(数据三个小时2 (b)- - - - - -2 (d))。细胞计数的不同线粒体形态(丝状、混合和分散)表示,美沙酮,在剂量依赖性的方式,诱导线粒体碎片(图2 (d))。这种效应似乎矛盾我们先前的观察,美沙酮未能诱导线粒体肿胀在孤立的鼠肝线粒体19]。也许,美沙酮在线粒体的分裂效应是由钙。事实上,我们的数据支持这一假设,并指出methadone-induced毒性作用的。同意这个,据报道,注射的MPTP药物打开pseudopathological条件下较高的Ca^{2 +}和低ATP浓度(15)一样在我们先前的实验与SH-SY5Y细胞(19]。线粒体膜的破裂引起的^{2 +}过载减少了“健康”线粒体的数量,这将影响神经功能包括突触传递和轴突运输至关重要。

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图2

t 美沙酮改变线粒体形态。methadone-treated细胞形态学研究了共焦成像与pDsRed2-mito SH-SY5Y细胞转染的向量。转染24小时后,细胞培养3 h没有孵化或0.25或0.5毫米美沙酮的存在。显示图像摘要代表线粒体形态的细胞(控制,(a))或细胞与美沙酮治疗((b), 0.25毫米;(c), 0.5毫米)。比例尺显示10m。(d),细胞丝状的分数,中级或更加深中测定线粒体模式至少6个独立的文化。(;;学生的以及与基底条件表示)。

最后,美沙酮对线粒体钙的影响^{2 +}研究了吸收(图3)。我们使用克拉克电极和应用不同的呼吸基质,即琥珀酸和谷氨酸/苹果酸。呼吸链较少依赖的存在琥珀酸比谷氨酸/苹果酸。美沙酮是导致解偶联19]。因此,作为一个控制,0.4使用M FCCP因为这FCCP导致浓度增加摄氧率可比的吸收速率计算0.5毫米美沙酮(图3(一个))。的计算值4 U(非耦合状态)状态(静息状态)比率(U / 4比率)如下:琥珀酸(+ FCCP)(+美沙酮)和谷氨酸/苹果酸(+ FCCP)(+美沙酮)。然后,我们检查了FCCP和美沙酮对Ca的影响^{2 +}由线粒体摄取(数字3 (b)和3 (c))。为此一个Ca^{2 +}指数计算,这表示摄氧率的比率增加引发了200M Ca^{2 +}前摄氧率。Ca的值^{2 +}指数如下:琥珀酸(控制),(+ FCCP),(+美沙酮)和谷氨酸/苹果酸(控制),(+ FCCP),(+美沙酮)。因此,在Ca FCCP和美沙酮的影响^{2 +}吸收具有可比性,尽管存在谷氨酸/苹果酸效果似乎更加明显。这可能是由一个强大的解偶联美沙酮对谷氨酸的影响/苹果酸访问Ca的连续呼吸链和一个额外的障碍^{2 +}吸收。因此,美沙酮的影响^{2 +}由线粒体摄取可能会依赖于呼吸基质。另一方面,当U / 4的值比计算没有和Ca的存在^{2 +}吸收比较(数字3(一个)和3 (c)),一种独特的减少在跟踪观察记录在Ca的存在^{2 +}吸收(图3 (c))。U / 4的计算值比减少如下:供琥珀酸来(+ FCCP)来(+美沙酮)和谷氨酸/苹果酸来(+ FCCP)来(+美沙酮)。这可以减少造成的组件的protomotive力的Ca^{2 +}吸收,导致减少的解偶联能力FCCP和美沙酮。

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图3

^{2 + 2 + 2 +} ₂ ^{−1 −1} 美沙酮影响线粒体钙吸收呼吸substrate-dependent。耗氧量的孤立肝线粒体克拉克决定使用一个电极的琥珀酸5毫米2.5毫米或2.5毫米谷氨酸/苹果酸为基质。(一)解偶联FCCP和美沙酮的能力。(b)的影响FCCP和美沙酮在Ca吸收。(c)的影响吸收的解偶联能力FCCP和美沙酮。补充:250ADP, 200M CaCl,0.4M FCCP, 0.5毫米美沙酮。显示痕迹的方法从四个独立获得线粒体准备。数字痕迹表明呼吸率在nmol氧气37°C·毫克的蛋白质·敏。

提供的数据表明,美沙酮诱发以便SH-SY5Y细胞通过改变线粒体钙处理的能力,和与不同的线粒体形态的变化。反过来,这些形态变化可以与线粒体损伤和细胞死亡有关。有趣的是,线粒体肿胀曾被观察到在神经退行性疾病(36,37]。线粒体钙失衡^{2 +}体内平衡可能是重要的早期和晚期阶段观察到的副作用,可能占的一些观察临床症状,例如,记忆障碍。

缩写

确认

这项工作是支持格兰特saf2008 - 05143从CICYT c03 - 1: Investigacion尤其drogodependencias。Ministerio de Sanidad y Consumo(04005 - 00)和PI2007/55 Consejeria de Sanidad来自军政府de Comunidades de恰拉(j .约旦),由“CCM Obra为社会y Cultural-FISCAM”和“Incorporacion de降太“FIS卡洛斯三世(m . Galindo)。r . Melero-Fernandez FPU同胞。美国Perez-Alvarez从西班牙的Ministerio de Sanidad y Consumo。

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