IRE1的抑制α衰减的脂肪变性在胃肠外营养相关肝病（PNALD）细胞模型

抽象

宗旨。建立大鼠正常肝细胞肠外营养相关性肝病模型，探讨内质网应激(ERS)相关IRE1的作用αPNALD过程中的信号。方法。用不同浓度的大豆油乳剂(SO)处理BRL细胞，诱导肝细胞脂肪变性。油红O染色和生化指标分析进一步证实了PNALD细胞病模型。接下来,IRE1α通过慢病毒通过特定的shRNA被压制和IRE1的作用α在anticytotoxicity和表达水平ERS相关蛋白IRE1α和p-IRE1α被测量。结果。油红O的结果染色表明PNALD成功建立在BRL细胞和CCK-8的数据显示，其0.6％的是SO进一步施加到由于其更好的感应PNALD和毒性的细胞较少的实验。此外，生物化学参数的值（TBIL，DBIL，ALT，AST和）也升高SO组与NG组相比。IRE1击倒后α中，PNALD也被诱导而细胞更耐左右。在shIRE1观察生化参数的更少正油红O染色和降低的值α组相比时shControl，这两者接受SO治疗。结论。IRE1α在PNALD细胞模型中诱导和抑制IRE1α导致这种细胞疾病模型降低脂肪变性。总之，我们的数据表明IRE1α途径可能参与PNALD的发展。

1.简介

肠外营养（PN）发生了革命性与生长缺陷的新生儿的生活方式引起的肠功能紊乱[1]。新生儿长期静脉营养的第一例报道，在美国上个世纪[2]。由于PN似乎是治疗这些缺陷的最佳有效疗法，依赖PN生存的患者的数量，无论是年轻的还是年老的，每年都在增加[3]。但长期应用PN可发展为严重疾病，如PN相关性肝病(PNALD)，其发病率和死亡率较高[4-6]。据报道，约50％至66％的孩子接受长期PN终于发展成PNALD [7]。虽然一些公认的危险因素，包括早产、PN长期保存、新生儿质量低和脂肪组成[8-10]，已被归因于PNALD，明确和具体的病因和发病机制仍仍然不明朗。

在真核细胞中，内质网（ER）是该进入分泌途径的蛋白质的折叠和运输是必不可少的。ER编排合成，折叠和至少三分之一在真核细胞中的蛋白质的运输。因为在肝细胞中高活性的蛋白质合成活动，要求ER的丰富的副本和精确的调节，以及组织。以往的研究表明ER的那个功能障碍引起的ER应激，可能有助于人类疾病，包括肝脏疾病[11，12]。在内质网受到应激的过程中，内质网内稳态会崩溃，启动一种未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR) [13]。UPR通过三个换能器调节，肌醇需要酶1（IRE1），蛋白激酶 - [R像-ER激酶（PERK），并激活ER网络中转录因子6（ATF6），[14]。常见的是，它们结合到葡萄糖调节蛋白78（GRP-78）上的ER膜，以促进蛋白质折叠和使用三磷酸腺苷（ATP）防止蛋白聚集。之间的ER驻留伴侣，GRP-78是UPR信令的主剂[15]。最近，ER应力报道在非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD），由乙型肝炎病毒，肠衰竭相关的肝疾病（IFALD）肝细胞癌，以及酒精性肝病（ALD）的发病机理[16-19]。Zhang等报道内质网应激与PNALD呈正相关，通过雷帕霉素激活自噬，可以通过抑制ros诱导的内质网应激来对抗PNALD [20]。我们之前的研究也表明，大豆油基脂质乳剂可引起兔原代肝细胞内质网和线粒体的明显损伤，最终导致内质网应激[21，22]。因此，以往的研究表明，内质网应激可能PNALD的发生，发展有关。

本研究采用大豆油基脂乳(SO)对大鼠正常肝细胞进行PNALD模型处理。此外,IRE1α在肝细胞特异性shRNA被抑制在调查内质网应激的PNALD模型中的作用。

2.材料和方法

2.1。大鼠正常肝细胞

大鼠正常肝细胞（BRL）承蒙以下干细胞库，中国院士，中国提供的。进行日常维护时，BRL细胞在DMEM（赛默飞世，USA）在含有10％FBS（GIBCO，美国）培养基和1％青霉素 - 链霉素（赛默飞世，USA）中在37℃在5％CO培养₂孵化器。培养基每天更换，直到需要溢出为止。

2.2。慢病毒生产

该目标的shRNA IRE1α通过GENEWIZ合成和如先前报道退火。然后shRNA的产物连接到骨架载体中。该病毒的包装用psPAX2（Addgen＃12260）和pMD2.G（Addgen＃12260）处理成293NT细胞。超速离心后，病毒被收集并悬浮在培养基中[23]。

2.3。IRE1的建立α-Suppressed BRL细胞系

按照IRE1α蛋白的表达，所述shRNA-＃2被用来转导的细胞BRL。慢病毒感染后，选择具有嘌呤霉素3周细胞。最后，BRL细胞都是GFP阳性和IRE1的表达α几乎没有检测到，这表明IRE1α成功建立了被抑制的BRL细胞株shIRE1α。同时，阴性对照shRNA也被诱导进入BRL细胞，称为shControl。

2.4。PNALD在BRL细胞建模

根据以往的报告[21]，该程序是轻度以下修改。的肝细胞BRL用不同浓度的SO（0.2％，0.4％，0.6％，1％和2％20％在DMEM中稀释SO）处理。用于所有后续实验的0.6％的浓度。所谓由华瑞制药，中国获得的。

2.5。CCK-8法

BRL肝细胞在孔的密度接种到96孔板 如先前所描述，每孔和处理的细胞。细胞s were then cultured for 24 h and CCK-8 analysis was performed on them according to the instruction. The absorbance of the formazan derivative was measured at 450 nm using a microplate reader (DNM-9602; Shengke, Shanghai, China). All measurements were performed in triplicate, and all experiments were repeated three times.

2.6。油红O染色

脂滴的积累油红O染色检测。简言之，将细胞用如此处理后所指示的，将细胞固定在10％（ ）formaldehyde for 10 min and then stained with Oil Red O solution (0.5% in isopropanol, ）for 15 min. Following extensive washes with distilled water, cells were stained with hematoxylin for 10 min. The representative images were taken under a light microscope.

2.7。生化分析

收集来自实验组培养基。各种生化参数，包括总胆红素（TBIL），直接胆红素（DBIL），丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST），从每个样品用自动生化分析仪（LXTM20，美国Beckman公司）进行测定。

2.8。Western印迹

这些细胞被视为表示,然后用PBS洗两次,其次是细胞溶解在电台免疫沉淀反应试验(里帕)缓冲区包含50 mM Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,1%钠脱氧胆酸盐,1% Triton x - 100, 5 nM乙二胺四乙酸,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和完整的蛋白酶抑制剂(罗氏,曼海姆,德国)。冰孵育30 min后，将裂解液进行简单超声处理，4℃离心去除不溶性细胞碎片。蛋白裂解液在95℃下加热10 min，然后在SDS- page凝胶中电泳。蛋白质样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用指示的一抗在4℃下检测12小时，然后在5%脱脂奶粉中被阻断。PVDF膜与适当的二抗结合辣根过氧化物酶在25℃孵育1小时。最后，使用化学发光的辣根过氧化物酶底物与分子成像仪凝胶Doc XR+体系(Bio-Rad)检测蛋白。

2.9。统计分析

所有值都表示为 从重复，学生使用GraphPad Prism软件进行测试（配对）。一个小于0.05的值被认为是统计显著。

3.结果

3.1。PNALD在BRL细胞建模

如图呈现图1（a），when the cells treated with SO for 24 h from 0.1% to 2%, the extension of Oil Red O staining was increased in a dose-dependent manner, indicating that the lipid droplet accumulation was acquired by administration of SO. Next, to get an optimal SO concentration from 24 to 72 h, cell cytotoxicity was also analyzed by the method of CCK-8. As shown in Figures图1（b）-1（d）中，当将细胞与SO的0.6％的浓度下进行处理时，检测到不显着的细胞毒性，而此浓度以上时，BRL细胞表现出严重的毒性。因此，0.6％的SO施加到进一步的实验用于其更大的脂滴积累和小的细胞毒性。

一个fter treated with SO for 24 h, the function of hepatocytes was analyzed by several biochemical parameters, including TBIL, DBIL, ALT, and AST. When the liver damage occurred, it could result in an accumulation of TBIL, DBIL, ALT, and AST. Surprisingly, all the values of these factors were consistently elevated (Figures图2（a）-2 (d))。综上所述，0.6% SO可以诱导BRL细胞发生PANLD，提示BRL-PANLD细胞疾病模型成功建立。

3.2。IRE1的代α-Suppressed BRL细胞

该BRL细胞携带shControl或shIRE1慢病毒转导α。选择后与嘌呤霉素(0.8μ克/毫升）3周，几乎所有的细胞均为阳性GFP（图3(一个))。IRE1的表达α通过Western印迹的方法中，仅shIRE1检查α-2＃获取的目标的有效抑制（图3 (b))。因此，shIRE1α对2号细胞系进行进一步研究。此外，我们还分析了敲除IRE1后so诱导的细胞毒性α和从CCK-8分析得到的数据表明IRE1的沉默α当SO长期（图处理，可以保护细胞免受毒性3 (c))。

3.3。IRE1α抑制减弱脂肪变性的细胞BRL

最后，为了测试是否内质网应激相关IRE1α信号参与PANLD发展在体外，将细胞用SO正如所指出的0.6％处理过的;after staining with Oil Red O, the cell morphology was normal and little lipid droplet accumulation was seen when treated for 0 h. Interestingly, when treated for 24 h, the lipid droplet accumulation was obvious both in the 0.6% SO group and 0.6% SO-shControl group, but less lipid droplets are accumulated in the 0.6% SO-shIRE1α组，表明IRE1的抑制α可以防止PANLD（图图4（a）)。此外，IRE1的表达α治疗后也被确定。当用0.6％SO，IRE1的表达处理α而组shIRE1的中检测到很少的表达显着增加α。当内质网应激是由IRE1的击倒抑制α，IRE1的表达α仅在用SO和SO-shControl组（图处理的细胞积累图4（b）)。此外，为了进一步评估肝细胞，生化参数，包括TBIL，DBIL，ALT，AST和的功能，进行了分析。当与这样处理，与NG组相比，所有的值中的SO分别增加和SO-shControl基。一旦IRE1α被抑制，尽管与SO处理，TBIL，DBIL，ALT，AST和的值也降低与shControl组相比。总之，这些数据表明，IRE1的抑制α能明显减弱PANLD的BRL病的细胞模型的脂肪变性。

4。讨论

本研究采用大豆油脂乳体系成功建立大鼠肝细胞PNALD细胞病模型。并比较两组间反映肝功能的几个生化指标的变化，包括LD的积累和内质网应激相关信号。此外,IRE1α-suppressed BRL细胞系的建立是为了探讨其在PNALD发展中的作用。结果表明，当IRE1α被抑制，PNALD的发展被降低，提示患PNALD当内质网应激途径的堵塞可能会受益于肝功能。我们的数据表明，内质网应激相关信号在PNALD模型，这与以前的报道是一致的[高度激活17，24，25]。既往临床试验也表明，使用脂乳的剂量和时间与PNALD的发生率呈正相关[26]。In our data, when treated with high concentration (above 1%) of SO for long term (48 h or 72 h), the lipid droplet accumulation was much higher than the lower group (under 0.6%), this was consistent with the clinical evidence.

内质网（ER）支配正确折叠和分泌和跨膜蛋白的翻译后修饰。各种生理和病理条件下可引发错误折叠的蛋白质的该细胞器内的积聚。这些，反过来，可诱导ER应激和激活解折叠蛋白应答（UPR）27]。最近，新出现的证据表明IRE1α信令还可以控制UPR无关的细胞途径，影响过程，如肝脏脂肪生成，血管生成，动脉粥样硬化，关节炎和抗肿瘤免疫[28-32]。这是否保守的信号途径参与PNALD的发病机制仍不明朗。在这项研究中，我们首次发现IRE1α在so处理的BRL细胞中高表达。当IRE1α抑制，脂肪变性也被抑制。所有这些数据都表明IRE1α可能与PNALD的发展有关。但其潜在的分子机制仍有待进一步研究。

总的来说，基于油的大豆类脂乳液的应用程序可以进行诱导从而引发ER，导致脂滴积累和ER应激肝细胞PNALD疾病模型。此外，IRE1的抑制α减少了PNALD细胞的脂肪变性，表明IRE1α途径可能参与PNALD的发生和发展。

数据可用性

所有作者都同意并确认了数据的可用性，所有用于支持本研究结果的数据均纳入本文。另外，方法和资料可向通讯作者咨询。

泄露

崔宁勋和崔明玲是共同第一作者。

利益冲突

的利益没有冲突存在。

作者的贡献

Ningxun崔和明利崔进行的实验，数据分析，和手稿的制备。李杰参加了实验。血瓶朱和朱小莉负责指导这项研究的设计和执行ANDN参与数据分析，数据的解读，以及纸张的修改。所有作者阅读并同意最终的纸张。Ningxun崔崔交融同样促成了这份手稿。

致谢

本研究获得国家自然科学基金(NSFC)资助;编号81771626和81971423);江苏省妇幼健康重点人才工程(第二期)。FRC201731);江苏省临床重点疾病诊断与治疗技术项目(第二期)。LCZX201612);与民生科技-关键技术应用研究项目(编号:SS201644)。

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