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GRP

胃肠病学研究与实践

1687-630X 1687 - 6121

Hindawi

10.1155 / 2020/7517540

7517540

研究文章

IRE1的抑制 α衰减的脂肪变性在胃肠外营养相关肝病（PNALD）细胞模型

崔

Ningxun

¹ 崔

混合

¹ 里

杰

https://orcid.org/0000-0002-3502-7655

朱

交给

https://orcid.org/0000-0001-5276-8079

朱

小莉

² Marano

路易吉

新生儿学部门

苏州大学儿童医院

苏州

江苏215025年

中国

sdfey.cn

部门的干预

苏州大学第一附属医院

苏州

江苏215006年

中国

sdfyy.cn

2020

3 2 2020

2020 16 10 2019 01 12 2019 10 12 2019 3 2 2020

2020

这是一篇在知识共享署名许可下发布的开放访问的文章，该许可允许在任何媒介上不受限制地使用、发布和复制，只要原稿被正确引用。

宗旨。建立大鼠正常肝细胞肠外营养相关性肝病模型，探讨内质网应激(ERS)相关IRE1的作用 αPNALD过程中的信号。方法。用不同浓度的大豆油乳剂(SO)处理BRL细胞，诱导肝细胞脂肪变性。油红O染色和生化指标分析进一步证实了PNALD细胞病模型。接下来,IRE1 α通过慢病毒通过特定的shRNA被压制和IRE1的作用 α与ers相关蛋白IRE1的表达水平 α和p-IRE1 α被测量。结果。油红O的结果染色表明PNALD成功建立在BRL细胞和CCK-8的数据显示，其0.6％的是SO进一步施加到由于其更好的感应PNALD和毒性的细胞较少的实验。此外，生物化学参数的值（TBIL，DBIL，ALT，AST和）也升高SO组与NG组相比。IRE1击倒后 α中，PNALD也被诱导而细胞更耐左右。在shIRE1观察生化参数的更少正油红O染色和降低的值 α与shControl相比，两组均接受SO处理。结论。IRE1 α在PNALD细胞模型中诱导和抑制IRE1 α在细胞疾病模型中导致脂肪变性减少。综合起来，我们的数据表明IRE1 α途径可能参与PNALD的发展。

民生科技-关键技术应用研究项目

SS201644

临床重点疾病的诊断和治疗技术项目

LCZX201612

江苏省妇幼健康重点人才工程

FRC201731

国家自然科学基金项目

81971423

81771626

1.介绍</Ťitle> <p>肠外营养(PN)彻底改变了因肠道功能障碍而导致生长缺陷的新生儿的生活方式[<xref ref-type="bibr" rid="B1"> 1</xref>]。上世纪美国报道了第一例新生儿长期肠外营养[<xref ref-type="bibr" rid="B2"> 2</xref>]。由于PN似乎是治疗这些缺陷的最佳有效疗法，依赖PN生存的患者的数量，无论是年轻的还是年老的，每年都在增加[<xref ref-type="bibr" rid="B3"> 3</xref>]。但长期应用PN可发展为严重疾病，如PN相关性肝病(PNALD)等，可导致较高的发病率和死亡率[<xref ref-type="bibr" rid="B4"> 4</xref>-<xref ref-type="bibr" rid="B6"> 6</xref>]。根据报告，大约50%至66%长期接受PN的儿童最终发展为PNALD [<xref ref-type="bibr" rid="B7"> 7</xref>]。虽然一些公认的危险因素，包括早产、PN长期保存、新生儿质量低和脂肪组成[<xref ref-type="bibr" rid="B8"> 8</xref>-<xref ref-type="bibr" rid="B10"> 10</xref>]，被认为是PNALD所致，但确切的具体病因和发病机制仍不清楚。</p> <p>在真核细胞中，内质网（ER）是该进入分泌途径的蛋白质的折叠和运输是必不可少的。ER编排合成，折叠和至少三分之一在真核细胞中的蛋白质的运输。因为在肝细胞中高活性的蛋白质合成活动，要求ER的丰富的副本和精确的调节，以及组织。以往的研究表明ER的那个功能障碍引起的ER应激，可能有助于人类疾病，包括肝脏疾病[<xref ref-type="bibr" rid="B11"> 11</xref>，<xref ref-type="bibr" rid="B12"> 12</xref>]。在内质网受到应激的过程中，内质网内稳态会崩溃，启动一种未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR) [<xref ref-type="bibr" rid="B13"> 13</xref>]。UPR通过三个换能器调节，肌醇需要酶1（IRE1），蛋白激酶 - [R像-ER激酶（PERK），并激活ER网络中转录因子6（ATF6），[<xref ref-type="bibr" rid="B14"> 14</xref>]。常见的是，它们结合到葡萄糖调节蛋白78（GRP-78）上的ER膜，以促进蛋白质折叠和使用三磷酸腺苷（ATP）防止蛋白聚集。之间的ER驻留伴侣，GRP-78是UPR信令的主剂[<xref ref-type="bibr" rid="B15"> 15</xref>]。近年来，ER应激在非酒精性脂肪肝(NAFLD)、乙型肝炎病毒引起的肝细胞癌、肠衰竭相关性肝病(IFALD)、酒精性肝病(ALD)的发病机制中被报道[<xref ref-type="bibr" rid="B16"> 16</xref>-<xref ref-type="bibr" rid="B19"> 19</xref>]。张某等人。报道称，内质网应激与PNALD雷帕正相关，并与自噬激活，可以通过抑制ROS引起的内质网应激防止PNALD [<xref ref-type="bibr" rid="B20"> 20.</xref>]。我们之前的研究也表明，大豆油基脂质乳剂可引起兔原代肝细胞内质网和线粒体的明显损伤，最终导致内质网应激[<xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21</xref>，<xref ref-type="bibr" rid="B22"> 22</xref>]。因此，以往的研究表明，内质网应激可能PNALD的发生，发展有关。</p> <p>本研究采用大豆油基脂乳(SO)对大鼠正常肝细胞进行PNALD模型处理。此外,IRE1<italic> α</italic>通过在肝细胞中特异性shRNA的抑制，探讨内质网应激在PNALD模型中的作用。</p> </sec> <sec id="sec2"> <title>2.材料和方法</Ťitle> <sec id="sec2.1"> <title>2.1。大鼠正常肝细胞</Ťitle> <p>大鼠正常肝细胞（BRL）承蒙以下干细胞库，中国院士，中国提供的。进行日常维护时，BRL细胞在DMEM（赛默飞世，USA）在含有10％FBS（GIBCO，美国）培养基和1％青霉素 - 链霉素（赛默飞世，USA）中在37℃在5％CO培养<sub>2</sub>孵化器。培养基每天更换，直到需要溢出为止。</p> </sec> <sec id="sec2.2"> <title>2.2。慢病毒生产</Ťitle> <p>针对IRE1的shrna<italic> α</italic>经Genewiz合成并退火，如前所述。然后将shRNA产物连接到主载体中。病毒包装用psPAX2 (Addgen #12260)和pMD2处理。G (Addgen #12260)进入293NT细胞。在超速离心后，收集病毒并在培养基中重悬[<xref ref-type="bibr" rid="B23"> 23</xref>]。</p> </sec> <sec id="sec2.3"> <title>2.3。IRE1<italic> </italic>-抑制BRL细胞系的建立</Ťitle> <p>按照IRE1<italic> α</italic>蛋白的表达，所述shRNA-＃2被用来转导的细胞BRL。慢病毒感染后，选择具有嘌呤霉素3周细胞。最后，BRL细胞都是GFP阳性和IRE1的表达<italic> α</italic>几乎检测不到，表明IRE1<italic> α</italic>成功建立-抑制BRL细胞系，命名为shIRE1<italic> α</italic>。同时，阴性对照shRNA也被诱导进入BRL细胞，称为shControl。</p> </sec> <sec id="sec2.4"> <title>2.4。PNALD在BRL细胞建模</Ťitle> <p>根据以往的报告[<xref ref-type="bibr" rid="B21"> 21</xref>，程序作了轻微修改如下。用不同浓度的SO处理BRL肝细胞(用DMEM从20% SO稀释0.2%、0.4%、0.6%、1%和2%)。所有后续实验均采用0.6%的浓度。SO是从中国华瑞制药公司获得的。</p> </sec> <sec id="sec2.5"> <title>2.5。CCK-8法</Ťitle> <p>BRL肝细胞在孔的密度接种到96孔板<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M1"> <mml:mn> 2</mml:mn> <mml:mo> ×</mml:mo> <mml:msup> <mml:mrow> <mml:mn> 10</mml:mn> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mn> 4</mml:mn> </mml:mrow> </mml:msup> </mml:math> </inline-formula>如先前所描述，每孔和处理的细胞。细胞s were then cultured for 24 h and CCK-8 analysis was performed on them according to the instruction. The absorbance of the formazan derivative was measured at 450 nm using a microplate reader (DNM-9602; Shengke, Shanghai, China). All measurements were performed in triplicate, and all experiments were repeated three times.</p> </sec> <sec id="sec2.6"> <title>2.6。油红O染色</Ťitle> <p>脂滴的积累油红O染色检测。简言之，将细胞用如此处理后所指示的，将细胞固定在10％（<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M2"> <mml:mi> v</mml:mi> <mml:mo> /</mml:mo> <mml:mi> v</mml:mi> </mml:math> </inline-formula>)甲醛10分钟，然后用油红O溶液(0.5%异丙醇，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M3"> <mml:mi> w ^</mml:mi> <mml:mo> /</mml:mo> <mml:mi> v</mml:mi> </mml:math> </inline-formula>) for 15 min. Following extensive washes with distilled water, cells were stained with hematoxylin for 10 min. The representative images were taken under a light microscope.</p> </sec> <sec id="sec2.7"> <title>2.7。生物化学分析</Ťitle> <p>收集来自实验组培养基。各种生化参数，包括总胆红素（TBIL），直接胆红素（DBIL），丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST），从每个样品用自动生化分析仪（LXTM20，美国Beckman公司）进行测定。</p> </sec> <sec id="sec2.8"> <title>2.8。西方墨点法</Ťitle> <p>这些细胞被视为表示,然后用PBS洗两次,其次是细胞溶解在电台免疫沉淀反应试验(里帕)缓冲区包含50 mM Tris-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,1%钠脱氧胆酸盐,1% Triton x - 100, 5 nM乙二胺四乙酸,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)和完整的蛋白酶抑制剂(罗氏,曼海姆,德国)。冰孵育30 min后，将裂解液进行简单超声处理，4℃离心去除不溶性细胞碎片。将SDS上样缓冲液中的蛋白裂解液在95℃下加热10 min，然后在SDS- page凝胶中电泳。蛋白质样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用指示的一抗在4℃下检测12小时，然后在5%脱脂奶粉中被阻断。PVDF膜与适当的二抗结合辣根过氧化物酶在25℃孵育1小时。最后，使用化学发光的辣根过氧化物酶底物与分子成像仪凝胶Doc XR+体系(Bio-Rad)检测蛋白。</p> </sec> <sec id="sec2.9"> <title>2.9。统计分析</Ťitle> <p>所有值都表示为<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M4"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>从重复，学生<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M5"> <mml:mi> Ť</mml:mi> </mml:math> </inline-formula>使用GraphPad Prism软件进行配对检验。一个<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M6"> <mml:mi> P</mml:mi> </mml:math> </inline-formula>小于0.05为有统计学意义。</p> </sec> </sec> <sec id="sec3"> <title>3.结果</Ťitle> <sec id="sec3.1"> <title>3.1。PNALD在BRL细胞建模</Ťitle> <p>如图所示<xref rid="fig1a" ref-type="fig"> 图1（a）</xref>，当细胞被SO处理从0.1%到2% 24小时后，油红O染色的扩展量呈剂量依赖性增加，表明经SO处理后获得了脂滴积累。然后用CCK-8方法分析细胞毒性，得到24 ~ 72 h的最佳SO浓度。如图所示<xref rid="fig1b" ref-type="fig"> 图1（b）</xref>-<xref rid="fig1d" ref-type="fig"> 1（d）</xref>当SO处理细胞的浓度为0.6%时，细胞毒性不显著，高于该浓度时，BRL细胞表现出严重的细胞毒性。因此，将0.6% SO用于进一步实验，因为其脂滴积累更大，细胞毒性更小。</p> <fig-group id="fig1"> <label>图1</label> <p>PNALD的细胞模型<italic> 在体外</italic>。(a)用不同浓度的大豆油乳剂(SO)处理大鼠正常肝细胞BRL。油红O染色测定BRL细胞脂肪变性程度。疤痕酒吧:50<italic> μ</italic>用CCK-8法分析经SO处理后的m. (b) BRL细胞活力。NG:未给予(SO未处理BRL细胞)。数据被表示为<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M7"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula> <inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M8"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.001</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。(c)BRL cell viability was analyzed by the method of CCK-8 after treatment with SO for 48 h. NG: not given (BRL cells untreated with SO). The data was presented as<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M9"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M10"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.05</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M11"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.001</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。(d)用CCK-8法分析SO处理72 h后的BRL细胞存活率。NG:未给予(SO未处理BRL细胞)。数据被表示为<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M12"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M13"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.05</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M14"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.001</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</p> <fig id="fig1a"> <label>(一)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.001a"></graphic> </fig> <fig id="fig1b"> <label>(b)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.001b"></graphic> </fig> <fig id="fig1c"> <label>(c)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.001c"></graphic> </fig> <fig id="fig1d"> <label>(d)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.001d"></graphic> </fig> </fig-group> <p>治疗后24 h,肝细胞的功能是由几个生化分析参数,包括治疗、DBIL, ALT, AST。肝损伤发生时,它可能导致治疗的积累,DBIL, ALT, AST。令人惊讶的是,所有这些因素的值持续升高(数字<xref rid="fig2a" ref-type="fig"> 图2（a）</xref>-<xref rid="fig2d" ref-type="fig"> 2 (d)</xref>)。综上所述，0.6% SO可以诱导BRL细胞发生PANLD，提示BRL-PANLD细胞疾病模型成功建立。</p> <fig-group id="fig2"> <label>图2</label> <p>SO处理后BRL细胞的生化指标。(a)细胞培养基中总胆红素(TBIL)含量。细胞培养基中直接胆红素(DBIL)的含量。(c)细胞培养基中丙氨酸转氨酶(ALT)的含量。(d)细胞培养基中天冬氨酸转氨酶(AST)的含量。NG:未给予(SO未处理BRL细胞)。数据被表示为<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M15"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M16"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.01</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M17"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.001</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</p> <fig id="fig2a"> <label>(一)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.002a"></graphic> </fig> <fig id="fig2b"> <label>(b)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.002b"></graphic> </fig> <fig id="fig2c"> <label>(c)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.002c"></graphic> </fig> <fig id="fig2d"> <label>(d)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.002d"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.2"> <title>3.2。<斜体>α</斜体> -Suppressed BRL IRE1的代细胞</Ťitle> <p>BRL细胞被携带shControl或shIRE1的慢病毒转导<italic> α</italic>。选择后与嘌呤霉素(0.8<italic> μ</italic>克/毫升）3周，几乎所有的细胞均为阳性GFP（图<xref rid="fig3a" ref-type="fig"> 3(一个)</xref>)。IRE1的表达式<italic> α</italic>通过Western印迹的方法中，仅shIRE1检查<italic> α</italic>-2＃获取的目标的有效抑制（图<xref rid="fig3b" ref-type="fig"> 3 (b)</xref>)。因此,shIRE1<italic> α</italic>对2号细胞系进行进一步研究。此外，我们还分析了敲除IRE1后so诱导的细胞毒性<italic> α</italic>， CCK-8分析数据提示IRE1沉默<italic> α</italic>当SO长期（图处理，可以保护细胞免受毒性<xref rid="fig3c" ref-type="fig"> 3 (c)</xref>)。</p> <fig-group id="fig3"> <label>图3</label> <p>击倒的IRE1<italic> α</italic>在BRL细胞。(a)转染指示慢病毒的BRL细胞的代表性图像。shControl表示阴性对照shRNA和shIRE1<italic> α</italic>被shRNA所靶向shIRE1<italic> α</italic>。疤痕酒吧:50<italic> μ</italic>m. (b) western blotting检测蛋白表达。装载GAPDH作为内部控制。NC表示未感染任何病毒的BRL细胞。(c) IRE1敲除后，用CCK-8方法分析细胞存活率<italic> α</italic>分别暴露48h和72h。NG:未给予(SO未处理BRL细胞)。数据被表示为<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M18"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M19"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.05</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M20"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.01</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M21"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.001</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</p> <fig id="fig3a"> <label>(一)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.003a"></graphic> </fig> <fig id="fig3b"> <label>(b)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.003b"></graphic> </fig> <fig id="fig3c"> <label>(c)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.003c"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> <sec id="sec3.3"> <title>3.3。IRE1<italic> </italic>抑制可减弱BRL细胞的脂肪变性</Ťitle> <p>最后，测试内质网应激是否与IRE1相关<italic> α</italic>signal参与了PANLD的开发<italic> 在体外</italic>，细胞按0.6%处理;油红O染色后，细胞形态正常，处理0 h后脂滴极少积聚。有趣的是，处理24 h后，0.6% SO组和0.6% SO- shre1对照组的脂滴积累都很明显，但0.6% SO- shire1的脂滴积累较少<italic> α</italic>，表明IRE1的抑制<italic> α</italic>可以防止PANLD（图<xref rid="fig4a" ref-type="fig"> 图4（a）</xref>)。另外，IRE1的表达<italic> α</italic>治疗后也被确定。当用0.6％SO，IRE1的表达处理<italic> α</italic>而组shIRE1的中检测到很少的表达显着增加<italic> α</italic>。当内质网应激是由IRE1的击倒抑制<italic> α</italic>， IRE1的表达式<italic> α</italic>仅在用SO和SO-shControl组（图处理的细胞积累<xref rid="fig4b" ref-type="fig"> 图4（b）</xref>)。此外，为了进一步评估肝细胞，生化参数，包括TBIL，DBIL，ALT，AST和的功能，进行了分析。当与这样处理，与NG组相比，所有的值中的SO分别增加和SO-shControl基。一旦IRE1<italic> α</italic>与shControl组相比，SO组的TBIL、DBIL、ALT和AST值均有所下降。综合来看，这些数据表明IRE1的抑制作用<italic> α</italic>能明显减弱PANLD的BRL病的细胞模型的脂肪变性。</p> <fig-group id="fig4"> <label>图4</label> <p>IRE1<italic> α</italic>抑制抑制了BRL细胞的脂肪变性。(a)不同组BRL细胞油红O染色的代表性图像。疤痕酒吧:50<italic> μ</italic>m. (b) western blotting检测蛋白表达。装载GAPDH作为内部控制。NC表示未感染任何病毒的BRL细胞。（c）中生化参数（TBIL，DBIL，ALT，AST和）BRL细胞在不同组中的所指示的。NG:未给予(SO未处理BRL细胞)。数据被表示为<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M22"> <mml:mtext> 的意思是</mml:mtext> <mml:mo> ±</mml:mo> <mml:mtext> SD</mml:mtext> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M23"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.05</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>，<inline-formula> <mml:math xmlns:mml="http://www.w3.org/1998/Math/MathML" id="M24"> <mml:msup> <mml:mrow></mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> <mml:mrow> <mml:mo> ∗</mml:mo> </mml:mrow> </mml:mrow> </mml:msup> <mml:mi> P</mml:mi> <mml:mo> <</mml:mo> <mml:mn> 0.001</mml:mn> </mml:math> </inline-formula>。</p> <fig id="fig4a"> <label>(一)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.004a"></graphic> </fig> <fig id="fig4b"> <label>(b)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.004b"></graphic> </fig> <fig id="fig4c"> <label>(c)</label> <graphic xlink:href="//www.newsama.com/downloads/journals/grp/2020/7517540.fig.004c"></graphic> </fig> </fig-group> </sec> </sec> <sec id="sec4"> <title>4.讨论</Ťitle> <p>本研究采用大豆油脂乳体系成功建立大鼠肝细胞PNALD细胞病模型。并比较了两组间反映肝功能的几个生化指标的变化，包括LD的积累和内质网应激相关信号。此外,IRE1<italic> α</italic>建立-抑制BRL细胞系，研究其在PNALD发生发展中的作用。结果表明，当IRE1<italic> α</italic>PNALD抑制时，PNALD的发展下降，提示阻断内质网应激通路对PNALD患者的肝功能有好处。我们的数据表明，PNALD模型中内质网应激相关信号高度激活，这与之前的报道一致[<xref ref-type="bibr" rid="B17"> 17</xref>，<xref ref-type="bibr" rid="B24"> 24</xref>，<xref ref-type="bibr" rid="B25"> 25</xref>]。既往临床试验也表明，使用脂乳的剂量和时间与PNALD的发生率呈正相关[<xref ref-type="bibr" rid="B26"> 26</xref>]。In our data, when treated with high concentration (above 1%) of SO for long term (48 h or 72 h), the lipid droplet accumulation was much higher than the lower group (under 0.6%), this was consistent with the clinical evidence.</p> <p>内质网(ER)控制着分泌蛋白和跨膜蛋白的适当折叠和翻译后修饰。不同的生理和病理条件可引起该细胞器内错误折叠蛋白的积累。这些反过来又可以诱导内质网应激，激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR) [<xref ref-type="bibr" rid="B27"> 27</xref>]。最近，新出现的证据表明IRE1<italic> α</italic>信号传导也可以控制不依赖于上调的细胞通路，影响肝脏脂肪生成、血管生成、动脉粥样硬化、关节炎和抗肿瘤免疫等过程[<xref ref-type="bibr" rid="B28"> 28</xref>-<xref ref-type="bibr" rid="B32"> 32</xref>]。这是否保守的信号途径参与PNALD的发病机制仍不明朗。在这项研究中，我们首次发现IRE1<italic> α</italic>在so处理的BRL细胞中高表达。当IRE1<italic> α</italic>抑制，脂肪变性也被抑制。所有这些数据都表明IRE1<italic> α</italic>可能与PNALD的发展有关。但其潜在的分子机制仍有待进一步研究。</p> <p>综上所述，应用大豆油类脂乳可诱发肝细胞PNALD病模型，触发内质网，导致脂滴积累和内质网应激。此外，IRE1的抑制<italic> α</italic>减少了PNALD细胞的脂肪变性，表明IRE1<italic> α</italic>通路可能参与了PNALD的发生发展。</p> </sec> <back> <sec sec-type="data-availability"> <title>数据可用性</Ťitle> <p>所有作者都认可并确认了数据的可用性，所有用于支持本研究结果的数据均纳入本文。另外，方法和资料可向通讯作者咨询。</p> </sec> <sec> <title>信息披露</Ťitle> <p>崔宁勋和崔明玲是共同第一作者。</p> </sec> <sec sec-type="COI-statement"> <title>的利益冲突</Ťitle> <p>不存在利益冲突。</p> </sec> <sec> <title>作者的贡献</Ťitle> <p>崔宁勋和崔明丽进行了实验、数据分析和手稿的准备。李杰参加了实验。朱雪平和朱晓丽监督了研究的设计和执行，并参与了数据分析、数据解释和论文修改。所有作者阅读并通过了最终论文。崔宁勋和崔明灵对这篇手稿同样有贡献。</p> </sec> <ack> <title>致谢</Ťitle> <p>本研究获得国家自然科学基金(NSFC)资助;编号81771626和81971423);江苏省妇幼健康重点人才工程(第二期)。FRC201731);江苏省临床重点疾病诊断与治疗技术项目(第二期)。LCZX201612);与民生科技-关键技术应用研究项目(编号:SS201644)。</p> </ack> <ref-list> <ref id="B1" content-type="article"> <label>1</label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Cahova</surname> <given-names> M.</given-names> </name> <name> <surname> Bratova</surname> <given-names> M.</given-names> </name> <name> <surname> 沃尔</surname> <given-names> P.</given-names> </name> </person-group> <article-title> 肠外营养相关肝病:肠道菌群的作用</article-title> <source> <italic> 营养物质</italic> <year> 2017</year> <volume> 9</volume> <issue> 9</issue> </element-citation> </ref> <ref id="B2" content-type="article"> <label>2</label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> Dudrick</surname> <given-names> S. J.</given-names> </name> <name> <surname> 威玛</surname> <given-names> D. W.</given-names> </name> <name> <surname> var</surname> <given-names> h . M。</given-names> </name> <name> <surname> terry Rhoads</surname> <given-names> j·E。</given-names> </name> </person-group> <article-title> 长期全肠外营养与生长、发育和正氮平衡</article-title> <source> <italic> 手术</italic> <year> 1968</year> <volume> 64</volume> <issue> 1</issue> <fpage> 134</fpage> <lpage> 142</lpage> <pub-id pub-id-type="pmid"> 4968812</pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B3" content-type="article"> <label>3</label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 兰格</surname> <given-names> S. J.</given-names> </name> <name> <surname> 卡尔金斯</surname> <given-names> c . M。</given-names> </name> <name> <surname> 考尔斯</surname> <given-names> R. A.</given-names> </name> <name> <surname> Barnhart</surname> <given-names> D. C.</given-names> </name> <name> <surname> 黄</surname> <given-names> e . Y。</given-names> </name> <name> <surname> 阿卜杜拉</surname> <given-names> F。</given-names> </name> <name> <surname> 阿卡</surname> <given-names> M. J.</given-names> </name> <name> <surname> 分类的</surname> <given-names> d . H。</given-names> </name> </person-group> <article-title> 肠外营养相关胆汁淤积:美国儿科外科协会结果和临床试验委员会系统综述</article-title> <source> <italic> 中华小儿外科杂志</italic> <year> 2012</year> <volume> 47</volume> <issue> 1</issue> <fpage> 225</fpage> <lpage> 240</lpage> <pub-id pub-id-type="doi"> 10.1016 / j.jpedsurg.2011.10.007</pub-id> <pub-id pub-id-type="other"> 2 - s2.0 - 84855845481</pub-id> </element-citation> </ref> <ref id="B4" content-type="article"> <label>4</label> <element-citation publication-type="journal"> <person-group person-group-type="author"> <name> <surname> 威利斯</surname> <given-names> t . 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