的miR-7-5p通过靶向成纤维细胞生长因子受体4促进肝星状细胞活化

摘要

目标。成纤维细胞生长因子受体4 (FGFR4)是保护肝脏免受慢性损伤的关键介质。MicroRNA-7 (miR-7)是一种肿瘤抑制因子，与肝脏的脂质稳态相关。本研究旨在研究miR-7-5p/FGFR4轴在肝纤维化发生中的作用。方法。TargetScan被用来预测靶向FGFR4在3上的microRNAs -非翻译区（3 -UTR)。使用qRT-PCR和免疫印迹法测定病理肝组织和LX-2细胞中miR-7-5p和FGFR4的表达。进行了双荧光素酶检测以验证目标预测。采用细胞计数lit8法检测LX-2细胞的增殖能力。用羟脯氨酸法测定LX-2细胞中羟脯氨酸含量。采用qRT-PCR和免疫印迹法检测肝星状细胞(HSC)激活标记的表达。结果。FGFR4是miR-7-5p可能的靶点。在LX-2细胞中，miR-7-5p通过与3结合靶向FGFR4 -UTR。FGFR4下调，但随着肝纤维化程度的上升，肝脏样本中的miR-7-5p显著增强。miR-7-5p与肝组织中的FGFR4表达呈负相关。miR-7-5p抑制剂阻断了脂多糖诱导的LX-2细胞的增殖和激活，FGFR4过表达抑制了miR-7-5p引发的LX-2细胞的增殖和激活。结论。miR-7-5p通过下调FGFR4促进星状细胞增殖和激活。

1.介绍

大多数类型的慢性肝病导致细胞外基质蛋白，例如胶原蛋白的积累，这是肝纤维化的病因[1]。肝星状细胞(HSCs)的活化是肝纤维化的一个步骤。在正常肝脏中，造血干细胞处于静止状态;然而，在受损的肝脏中，它们被激活并转分化为肌成纤维细胞造血干细胞，被认为是主要的胶原生成细胞[2]。成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）是成纤维细胞生长因子（FGF）受体由内分泌的FGFs激活。在肝细胞中，FGFR4活化FGF19抑制了糖异生和糖原刺激和蛋白质[合成3.]。在临床试验中，在酒精性脂肪性肝炎患者肝纤维化是由FGF19类似物处理减弱[4- - - - - -6]。最近的证据表明在肝脏是FGFR4功能动态平衡的重要介质[7]。与小配偶相比，FGFR4和Fgf15 (FGF19的小鼠同源物)的缺失导致显著的肝纤维化[8]，这表明FGFR4 / FGF19轴具有抗纤维化性质。

微RNA（miRNA）可以结合到mRNA的3 -非翻译区（3 -(UTR)参与转录后基因调控[9]。越来越多的证据表明，miRNAs在各种人类疾病中发挥重要作用，包括肝病[10]。据记载，miRNA能够调节细胞存活和增殖，炎症和葡萄糖和脂质在肝脏中代谢[11]。越来越多的证据表明，mirna的失调参与了肝纤维化和星状细胞活化的过程[12,13，如miR-29家族[14， miR-199, miR-200 [15，以及miR-34 [16]。因为miRNAs可以很容易地在各种体液中被量化[17- - - - - -19]，他们有很大的潜力作为生物标志物和治疗剂用于人类疾病。

在本研究中，我们的目的是描述的miRNA调控FGFR4 / FGF19信号来了解肝纤维化的分子机制。我们的研究结果在FGFR4 / FGF19信令的调制指示为的miR-7-5p中的新作用。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染

LX-2细胞由中国科学院类型培养库(中国上海)提供。在含有1%青霉素-链霉素溶液(Solarbio，北京，中国)和10%胎牛血清(胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Invitrogen公司)置于含5% CO的37℃湿化培养箱中₂。阴性对照和miR-7-5p模拟和抑制剂从吉玛公司（上海，中国）获得。有关FGFR4，加扰的miR控制（NC）的表达研究的miR-7-5p的效果，的miR-7-5p模拟物，或miR-7-5p抑制剂转染到使用Lipofectamine 2000（LX-2细胞Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA）。为了评价FGFR4对行为的作用的miR-7-5p过表达LX-2细胞，用与miR-7-5p模拟物处理的细胞用空白的pcDNA3.1（+）载体（载体，Addgene公司，沃特敦转,MA, USA) or a pcDNA3.1-FGFR4 expression vector (oeFGFR4) using Lipofectamine 2000. After 48 h cell transfection, gene expression on mRNA and protein levels was detected. The cells were treated with lipopolysaccharides (LPS) (Desite, Chengdu, China) at 0, 50, 100, or 200 ng/ml for the indicated time as shown in figures. The same volume of solvent was used as a vehicle control.

2.2。肝脏标本

本研究纳入15例轻度肝纤维化(F1)、15例重度肝纤维化(F2-F3)、15例肝硬化(F4-F5)患者。根据METAVIR系统对患者的肝活检组织进行纤维化评分[20]。从患者身上取下肝脏样本，并在-80℃评分后使用。本研究经上海医科大学附属周浦医院伦理委员会批准，并获得所有患者的书面知情同意。

2.3。目标预测

使用TargetScan 7.1预测可能靶向FGFR4的miRNAs (http://www.targetscan.org/）21]。

2.4。RNA提取和实时定量PCR (qRT-PCR)

使用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad，美国加利福尼亚州)提取LX-2细胞总RNA。使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific，威豪，MA, USA)将总RNA转化为cDNA。随后，使用ABI 7300 real-time PCR系统(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)和SYBR Green/ROX qPCR Mix (Thermo Fisher Scientific)对cDNA进行定量。mRNA表达的内参是甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和智人RNA, U6小核1 (RNU6-1)的miRNA表达。引物列于表中1。

2.5。免疫印迹

RIPA缓冲液（碧云天生物，上海，中国）用于免疫印迹准备细胞提取物。然后，使用Bio-Rad公司的蛋白质测定试剂盒（Bio-Rad实验室，赫拉克勒斯，CA，USA）测定总蛋白含量。蛋白样品电印迹到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。TBST（含Tween20的Tris缓冲盐水），用5％牛血清白蛋白缓冲液用于阻止膜。The membranes were blocked at room temperature for 1 h, and then, the corresponding primary antibodies,α-SMA(Affinity Biosciences, Cincinnati, OH, USA; AF1032; 1 : 500), COL1A1 (Affinity Biosciences; AF7001; 1 : 500), TGF-β(Abcam，美国麻州剑桥;Ab179695;FGFR4(亲和力生物科学;DF10316;和GAPDH (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA;# 5174;1:20 00)，在TBST缓冲液中孵育膜。这些膜被保存在4℃过夜。第二天，膜与二抗(Beyotime)在室温下孵育1小时。增强化学发光显色底物(Thermo Fisher Scientific)用于可视化蛋白条带。

2.6。双萤光素酶检测

FGFR4 3 -扩增UTR并亚克隆psiCHECK-2载体(Promega, Madison, WI, USA)，构建的质粒命名为wt-FGFR4-3UTR。位点定向PCR与高保真酶(TaKaRa，志贺，日本)一起用于产生突变的FGFR4 3 -UTR如前所述[22]中，构建的质粒命名为MUT-FGFR4-3UTR。脂质体2000分别用来cotransfect重量/ MUT-FGFR4-3UT和NC或与miR-7-5p模拟到LX-2细胞。The Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) was employed to assess the firefly and Renilla luciferase activity 48 h after transfection.

2.7。细胞增殖分析

Cells with different treatments were inoculated to each well of 96-well plates and grown in a 37°C humidified atmosphere for 12, 24, or 48 h. A Cell Counting Kit-8 (CCK-8, SAB, Nanjing, China) assay was performed according to the manufacturer’s instructions. All experiments were conducted at least three times.

2.8。羟脯氨酸含量的测定

在肝细胞中羟脯氨酸的含量是使用羟脯氨酸测定试剂盒（建成，南京，中国）测量。

2.9。统计分析

数据显示为 。GraphPad Prism (San Diego, CA, USA)用于统计分析。组间差异评估使用 -测试。计算Pearson相关系数以测量肝脏组织样本中miR-7-5p和FGFR4 mRNA水平之间的线性关联强度。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1。miR-7-5p在HSCs中负调控FGFR4

在网上分析显示，FGFR4可能是miR-7-5p的靶点(图)1(一))。为了研究miR-7-5p对HSCs中FGFR4表达的影响，我们将miR-7-5p mimic或inhibitor转染到LX-2细胞中。NC作为对照。与对照组相比，过表达miR-7-5p的细胞中miR-7-5p的表达显著增强，而miR-7-5p inhibitor处理的细胞中miR-7-5p的表达则受到抑制(图)1 (b))。与NC和对照组相比，FGFR4在miR-7-5p过表达的LX-2细胞中显著降低，而在miR-7-5p抑制剂处理的造血干细胞中显著升高(图)1 (b)和1 (c)，表明miR-7-5p负调控了HSCs中FGFR4的表达。

检测miR-7-5p是否能结合FGFR4 3 -UTR直接，WT-FGFR4-3UTR和MUT-FGFR4-3UTR荧光素酶报告质粒构建，和双荧光素酶报告测定在LX-2细胞进行。在相对萤光素酶活性的miR-7-5p过表达与WT-FGFR4-3UTR处理的细胞中相比减小显著对照组，而没有显著变化被认为在荧光素酶活性的miR-7-5p过度表达细胞与MUT处理-FGFR4-3UTR与相应的对照组相比（图1 (d))。我们的结果表明，miR-7-5p通过其3靶向FGFR4 -UTR。

3.2。的miR-7-5p负调控FGFR4病理性肝组织

的miR-7-5p水平15克轻度纤维化的样品，15克度纤维化的样品，和15个肝硬化样品使用qRT-PCR测定。的miR-7-5p严重纤维化或肝硬化样品中大幅度提高相比轻度纤维化（图2(一个))。患有严重纤维化的样品相比，的miR-7-5p在肝硬化显著上调。相反，FGFR4显着严重纤维化或肝硬化样品中相比，减少轻度纤维化（图图2（b）)。与严重纤维化样本相比，肝硬化中的FGFR4表达显著下降。如图所示图2（c），在不同程度肝纤维化患者的肝组织中，miR-7-5p与FGFR4水平呈负相关( , )。

3.3。LPS促进HSCs中miR-7-5p的表达并抑制FGFR4的表达

LPS增加了生产的miR-7-5p，但抑制FGFR4 mRNA和蛋白表达以剂量依赖的方式（图3.)，提示LPS介导了HSCs中的miR-7-5p/FGFR4模块。

3.4。miR-7-5p抑制剂阻断了脂多糖诱导的星状细胞的增殖和活化

与miR-7-5p抑制剂引入到抑制的miR-7-5p生产在HSC中。Under the condition of 100 ng/ml LPS, the miR-7-5p inhibitor or NC was transfected into LX-2 cells. miR-7-5p was markedly raised in the LPS group compared to the vehicle control, while it was markedly reduced in LX-2 cells treated with the miR-7-5p inhibitor and 100 ng/ml LPS compared to LX-2 cells treated with NC and 100 ng/ml LPS (Figure4(一))。接下来，我们使用CCK-8实验检测了经miR-7-5p抑制剂处理的LX-2细胞的增殖活性。如图所示4 (b)与对照组相比，仅用100 ng/mL LPS处理或转染NC和LPS处理LPS可显著提高LX-2细胞的增殖能力。相反，与NC和LPS处理的LX-2细胞相比，miR-7-5p inhibitor和LPS处理的LX-2细胞的增殖能力明显受到抑制。这些数据表明miR-7-5p抑制剂阻断了LPS诱导的LX-2细胞的增殖。然后，我们测量了羟脯氨酸含量(星状细胞激活的标记)和FGFR4和三种星状细胞激活标记TGFB1的表达，α-SMA，和COL1A1，在LX-2细胞。如图4 (c)- - - - - -图4（e）与对照相比，LPS处理显著提高LX-2细胞中羟脯氨酸含量和标记物表达水平;然而，miR-7-5p抑制剂处理大大降低了LPS诱导的羟脯氨酸含量和标记物水平的升高。作为miR-7-5p的靶点，FGFR4在LPS组中显著下调，而在经miR-7-5p抑制剂和LPS处理的LX-2细胞中，其水平显著高于NC和LPS处理的细胞(图)4 (d)和图4（e）)。该数据表明，与miR-7-5p抑制剂可以有效地阻挡HSC活化。

3.5。FGFR4过表达抑制mir -7-5p促进星状细胞增殖和活化

为了验证FGFR4是肝脏纤维化中受miR-7-5p调控的下游效应因子，将NC/miR-7-5p mimic和pcDNA3.1空载体或pcDNA3.1-FGFR4表达载体共转染到LX-2细胞中。miR-7-5p LX-2细胞显著增加治疗miR-7-5p模仿和pcDNA3.1空向量处理数控相比,和pcDNA3.1空向量,miR-7-5p模仿,pcDNA3.1-FGFR4表达载体治疗进一步调节miR-7-5p LX-2细胞相比LX-2细胞治疗miR-7-5p模仿和pcDNA3.1空向量(图5(一个))。The subsequent CCK-8 assay demonstrated that LX-2 cell proliferation was greatly enhanced in the mimic+Vector group but markedly inhibited in the NC+oeFGFR4 group 24 h after transfection compared to the NC+Vector group (Figure图5（b）)。与mimic+载体组相比，miR-7-5p mimic和pcDNA3.1-FGFR4表达载体处理显著抑制了LX-2细胞的增殖，但与NC+oeFGFR4组相比，显著促进了LX-2细胞的增殖。这些数据表明，FGFR4过表达抑制了miR-7-5p诱导的LX-2细胞增殖。研究还检测了LX-2细胞中FGFR4和三种星状细胞激活标记物的羟脯氨酸含量和mRNA/蛋白水平。miR-7-5p mimic和pcDNA3.1空载体处理显著提高羟脯氨酸含量和标记物水平;然而，与NC+载体组相比，FGFR4过表达显著降低了羟脯氨酸含量和标记物水平(图)图5（c）- - - - - -图5（e）)。当与所述miR-7-5p模拟物和pCDNA3.1-FGFR4表达载体中，羟脯氨酸含量和标志物水平在LX-2细胞处理的显着减少与模拟+载体组比较，而他们大大增加与NC相比+ oeFGFR4基。FGFR4模仿+载体组中显著下调但相比于NC +矢量组（图中的NC + oeFGFR4组中显着增加图5（d）和图5（e）)。相比于模拟+向量组，FGFR4模仿+ oeFGFR4组中上调。相较于NC + oeFGFR4组，FGFR4模仿+ oeFGFR4组中被抑制。这些结果建议，作为受miR-7-5p调节的下游效应，FGFR4过表达能有效阻断的miR-7-5p诱导HSC活化。

4.讨论

我们的在网上分析认为牵连FGFR4被的miR-7-5p的目标，这表明的miR-7-5p可能在肝纤维化有关。在病理肝组织，的miR-7-5p相比轻度纤维化样品重度纤维化或肝硬化样品中显着增加和肝硬化样品中更加强与严重纤维化样品进行比较。相反，FGFR4表达重度纤维化或肝硬化样品中下调显著相比轻度纤维化的样品，并且它是肝硬化样品中低得多的重度纤维化样品进行比较。的miR-7-5p呈负FGFR4水平在肝脏病变，这与一致的相关性我们在网上预测。

FGF19是一种激素分泌到肠和发送到肝脏中作为信号。FGF19是负责胆汁酸，脂质，和在肝脏中糖代谢的体内平衡[23]。FGF19的许多靶点与代谢和增殖有关[23]。多项实验表明FGF19对肝纤维化具有保护作用[24- - - - - -27]。结合FGFR4需要在小鼠肝脏FGF19增殖函数[28,29]。使用LX-2细胞（人HSC细胞系），我们进一步研究的miR-7-5p和FGFR4功能在HSC增殖和活化。我们发现，FGFR4表达在的miR-7-5p过表达LX-2细胞明显减少，而这是与所述miR-7-5p抑制剂治疗LX-2细胞大大增强，用NC和载体对照相比。这一发现进一步证实了FGFR4通过的miR-7-5p在肝脏中产生负面调制。双萤光素酶测定也验证了miR-7-5p通过结合到其3调节FGFR4 -UTR。miR-7已被报道为肝脏脂质代谢的关键介质[三十]。miR-7的下调与多种癌症类型相关[31- - - - - -33]。在肝中，的miR-7是归因于肿瘤抑制中的作用[34,35和维持脂质稳态的关键介质[三十]。此外，我们发现LPS处理与载体对照相比，促进了LX-2细胞的增殖;然而，与NC和LPS处理组相比，miR-7-5p抑制剂和LPS处理抑制了LPS诱导的LX-2细胞的增殖能力，说明miR-7-5p抑制剂阻断了LPS诱导的LX-2细胞的增殖。此外，过表达FGFR4可以挽救miR-7-5p抑制剂对LX-2细胞增殖的影响。我们的结果表明，FGFR4是miR-7-5p的靶基因。

激活的HSCs触发生产在细胞外基质的羟脯氨酸，羟脯氨酸和保持肝细胞的完整性和正常功能[36]。因此，肝羟脯氨酸含量可以正确反映肝纤维化程度。此外，活化的HSCs有上调作用α-SMA和COL1A1和产生肝细胞因子TGF-ββ(37]。因此，我们测定了COL1A1、TGFB1和的羟脯氨酸含量和表达α不同处理的LX-2细胞中的-SMA，以揭示miR-7-5p和FGFR4在星状细胞激活中的作用。我们的数据表明，miR-7-5p抑制剂降低了lps诱导的HSCs中羟脯氨酸含量和星状细胞激活标记物的上调，而FGFR4过表达抑制了miR-7-5p引发的HSCs中羟脯氨酸含量和星状细胞激活标记物的上调。在LPS条件下，与对照剂相比，LPS组中的FGFR4显著下调，而miR-7-5p抑制剂和LPS处理组中的FGFR4显著升高，与NC和LPS处理组相比。所有这些数据都表明，FGFR4被miR-7-5p下调。

总之，我们的结果表明，miR-7-5p通过下调FGFR4促进星状细胞的增殖和激活。靶向miR-7-5p的抑制药物可能为肝纤维化的治疗提供新的选择。

数据可用性

支持本研究结果的数据可从通讯作者处获得。

的利益冲突

的利益没有冲突存在。

作者的贡献

田淑霞和陈敏为这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项研究是由中国国家自然科学基金（81774061）资助项目，重点学科建设在浦东新区卫生系统（PWZxk2017-02），中国中医药传承与科技创新工程上海的（ZYKC2019035），并集成传统的中国和上海的西药（ZHYY-ZXYJHZX-201910）的特别项目。

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