抑制Syndecan-1脱落可通过抑制NF-改善肠上皮炎症κB途径和TNF-α

抽象

Syndecan-1 (SDC1)具有长可变外结构域，携带硫酸肝素链，参与炎症反应的许多步骤。但关于SDC1的不脱落外膜结构域对肠上皮炎症的作用及确切的潜在机制的报道还很有限。在我们的研究中，通过将未脱落的SDC1质粒分别转染肠上皮细胞建立未脱落的SDC1模型。并进一步研究未脱落的SDC1在肠道炎症中的作用。我们发现NF-的成分κB通路，包括P65和IκBα，分泌TNF-α在LPS的刺激下肠上皮细胞表达上调。SDC1，特别是通过其未脱落的外域，显著降低了上调程度。它还通过下调CXCL-1的分泌抑制中性粒细胞的迁移。综上所述，我们认为抑制肠上皮细胞中SDC1的脱落可以通过灭活NF-减轻肠炎症的严重程度κB途径和TNF-的下调α表达式。提示SDC1外膜结构域可能是治疗肠道炎症的选择。

1.简介

配体蛋白聚糖-1（SDC1），硫酸乙酰肝素蛋白多糖（聚糖）的上皮细胞的表面上的显着表达的一个成员，主要由短的保守的胞质结构域，跨膜结构域，和携带硫酸乙酰肝素长可变胞外域（HS）链[1]。SDC1的大部分功能是由配体结合的HS部分介导的。过去几十年的研究表明，SDC1以依赖hs的方式调节多种炎症反应的活性[2- - - - - -4]。通过HS链，SDC1可以结合多种分子，包括细胞因子、趋化因子、细胞外基质成分，甚至是细菌表面的肝素结合蛋白。此外，它还在白细胞招募、炎症化解和基质重构中发挥关键作用[5,6]。

SDC1的定位不仅局限于细胞表面，还具有可溶性HSPG的功能，可通过一种称为外域脱落的过程从细胞表面蛋白水解释放[7]。外胚区脱落被多种炎症因子激活，并作为宿主对炎症、微生物发病机制和伤口愈合的反应调节的一部分[8- - - - - -10]。例如，在急性肺损伤的小鼠模型中，shed SDC1促进了CXC趋化因子梯度的形成，以增强中性粒细胞跨上皮迁移，并抑制宿主来源的抗菌肽促进铜绿假单胞菌鼻内诱导肺感染小鼠模型的感染[11,12]。

目前，shed SDC1在许多疾病状态的病理生理中发挥着重要作用;然而，肠道炎症反应的确切潜在机制尚不清楚。在多发性骨髓瘤中，成骨细胞或基质细胞中肝素酶的高表达诱导SDC1的脱落，并通过HGF/c-met/IL-11轴刺激信号转导。IL-11、RANKL表达增强导致溶骨性骨病升高[13]。在过敏性肺炎，SDC1的胞外域可以结合CC趋化因子，包括CCL11和CCL17，和肺抑制CC趋化因子介导的Th2细胞募集[14]。在宿主对组织损伤的反应中，可溶性外膜结构域也显著激活成纤维细胞生长因子-2的有丝分裂性，并参与形态发生和创伤修复[15]。在肠内，TNF-诱导的肠上皮细胞脱落SDC1胞外结构域α和干扰素-γ与肠道致病菌内在化程度降低有关[16]。通过SDC1的减少伴随着，谷氨酰胺可以衰减肠缺血再灌注引起的肠道通透性增加，炎症，和损伤SDC1 KO小鼠[17]。现有数据表明，SDC1参与了肠道炎症，但为了更好地理解其下游过程，迫切需要详细说明。

在本研究中，我们构建了SDC1不棚由PMA引起的质粒，仿照肠道炎症在体外，并试图阐明NF-的潜在作用κB途径和细胞因子分泌在启动SDC1脱落事件中的作用。我们的数据显示，激活的SDC1脱落有助于肠道炎症，抑制其从肠上皮细胞脱落可通过失活NF-显著减轻炎症的严重程度κB途径，下调TNF-α中性粒细胞的表达和抑制迁移。SDC1和NF-的连接κ肠道细胞B通路可能揭示了SDC1参与肠道炎症的新机制。而SDC1的外域可能对肠道炎症有特殊的治疗作用。

2.材料和方法

2.1。细胞培养和处理

肠上皮细胞IEC-6购自美国型培养标本，常规生长在含10%胎牛血清(胎牛血清;(美国加州Gibco))，在含5% CO的37℃加湿空气中培养₂。使用pcDNA 3.0载体构建编码野生型SDC1 (wt-SDC1)和不脱落SDC1 (mutl -SDC1)的重组质粒，并将其转染Lipofectamine 3000 (Invitrogen, CA, USA)。在所有实验的处理组中，培养或转染细胞均用1处理μ12-myristate 13-acetate (PMA;持续15分钟或1分钟μg / mL有限合伙人大肠杆菌(血清型0111:B4;(美国密苏里州Sigma-Aldrich)，在进行以下实验前24小时。

2.2。反转录PCR

使用Trizol (Invitrogen, CA, USA)从细胞中提取总RNA。使用第一链cDNA合成试剂盒(Takara，大连，中国)对RNA样本进行逆转录(RT)。PCR是由5分钟在94°C和孵化结束后10分钟在72°C扩展,与35周期在94°C变性30年代,退火在53°C 30年代,在72°C和扩展1分钟使用PCR试剂盒(SBS通用有限公司、北京、中国)。同时扩增GAPDH mRNA作为内控。

2.3。Western Blot和Dot Blot检测

用Western blot检测SDC1和表达NF-κB通路。1% PMSF、蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂在RIPA缓冲液中裂解细胞。蛋白被装载到SDS-PAGE微型芯片上，并转移到PVDF膜上。一抗在4℃下检测过夜后，用酶标二抗孵育印迹。使用ECL基质(Millipore, MA, USA)对信号进行可视化。以GAPDH作为内源性蛋白进行归一化。

采用斑点印迹法检测细胞培养上清中脱落的SDC1外膜结构域。上清液用于增湿固定器-纽约⁺膜(Millipore, MA，美国)在温和真空下的斑点印迹仪器(霍曼，美国新泽西州)。三次洗涤后，膜在4℃的SDC1抗体中孵育过夜，然后孵育二抗，然后使用ECL底物暴露。

2.4。免疫荧光分析

免疫荧光染色:细胞在冰甲醇中固定10 min，室温下用含5% BSA的PBS封闭1 h，然后用SDC1抗体在4℃孵育过夜(1:100;研发、MN、美国)。未培养抗体的细胞作为对照。三次洗涤后，在室温下用pe标记的IgG标记1小时。DAPI染色10分钟后检测核状态。最后将细胞装于载玻片上，用荧光显微镜观察。

2.5。酶联免疫吸附试验

肿瘤坏死因子的浓度,α,il - 1β，细胞培养上清中细胞因子诱导的中性粒细胞趋化剂(CXCL-1)采用夹式酶联免疫吸附试验(ELISA)，按照说明书(Boster，中国武汉)进行检测。在450 nm处读取吸光度，并通过与标准曲线比较其光密度来确定浓度。

2.6。中性粒细胞的分离和迁移测定

从健康大鼠体内抽取5毫升静脉血，放入含肝素的收集管中，在2小时内处理。如前所述分离出中性粒细胞[18]。对于迁移测定，为0.5×10⁶将10%胎牛血清培养基中的中性粒细胞加入transwell聚酯膜过滤器(直径6.5 mm的过滤器，3.0)的上部插入物中μ米孔径;BD，NJ，USA）和500 μL在CXCL-1分泌量最高的指定时间点收集IEC-6细胞培养上清，加入相应的下腔室。孵育24小时后，用棉签从上表面去除未迁移的细胞。下膜表面的迁移细胞用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，上清下清用台盘蓝染色计数细胞。迁移率是按总中性粒细胞添加到上插入物的百分比计算的。

2.7。统计分析

所有的3个或更大的独立实验数据表示为平均值±SD，并使用SPSS 13.0统计软件进行处理。单向ANOVA方差分析与邓肯的事后组间比较采用比较。显著性水平定义为。

3.结果

3.1。诱导PMA脱落SDC1的被抑制在MUT-SDC1转染的细胞

PMA可诱导细胞中SDC1的脱落，导致培养基中细胞外区域的出现[19]。因此，建立与unshedding SDC1细胞模型，我们首先构建并鉴定野生型-配体蛋白聚糖-1（WT-SDC1）的小鼠向量和unshedding-配体蛋白聚糖-1（MUT-SDC1）;测序结果与GenBank中记录的协议。然后，我们转染的mut-SDC1或WT-SDC1质粒导入肠上皮细胞和评估SDC1是否脱落可在刺激后用PMA被抑制。一个t 24 h after transfection, IEC-6 cells exhibited dramatically increased expression of SDC1 at the mRNA and protein levels compared with the parental and vector-transfected cells (Figure1(一)(左)。PMA刺激15min后，wt-SDC1转染细胞上的SDC1显著脱落，而muti -SDC1转染细胞上的SDC1脱落受到抑制(图)1(一)右)。收集IEC-6细胞的条件生长培养基，测量SDC1胞外结构域的水平(图)1 (b),)。

3.2。抑制SDC1的脱落可下调TNF-α，但对IL-1无影响β

在IEC-6细胞中，LPS刺激导致TNF-显著上调α和il - 1β在转录水平。转染野生型SDC1和MUT-SDC1导致这些细胞因子的下调，但减少是在MUT-SDC1转染的细胞更显着;然而，无差异IL-1β观察(,数据2 (b)和2 (d))。我们通过检测TNF-的表达，进一步研究炎性细胞因子对SDC1抑制炎症反应的作用α和il - 1β在细胞培养上清。LPS刺激后0 - 24小时，TNF-稳定增长α保存在IEC-6细胞中。6、12、24 h时TNF-含量α在转染wt-SDC1和muti - sdc1的细胞中显著降低(,图2(一个))，而48h时差异不显著。在转染了muti - sdc1的细胞中，下降程度更明显。而IL-1无差异β观察(图2 (c))。

3.3。抑制SDC1的脱落可使NF-失活κ乙途径

我们研究了脱落的NF-SDC1的影响κLPS诱导肠炎症的IEC-6细胞模型的B通路研究LPS刺激时，总P65和I的水平κBα(图2(一个)），细胞质P65（图2 (b))和核P65(图2 (c))均显著上调。在wt-SDC1和muti - sdc1转染的细胞中，上调程度降低，特别是后者。这些数据提示SDC1可以下调P65和I的表达κBα灭活NF -κB途径，下调作用可能主要依赖于抑制外结构域的脱落(图)3.)。

3.4。抑制SDC1脱落抑制CXCL-1分泌和中性粒细胞迁移

嗜中性粒细胞被称为先天免疫系统的重要组成部分和炎症期间招募到炎症部位为第一类型的白细胞[20.]，其迁移始终通过产生嗜中性粒细胞化学引诱物的前面CXCL-1 [21]。因此，我们评估了SDC1水平可能会影响中性粒细胞CXCL-1和跨上皮迁移。在IEC-6细胞中，LPS刺激后CXCL-1水平开始呈时间依赖性升高。wt-SDC1和muti - sdc1转染的细胞均抑制CXCL-1的分泌。后者的抑制作用更大(,图4(一))。

LPS刺激后24小时CXCL-1水平最高，因此我们在上述时间点收集了这些细胞的条件生长培养基。此外，IEC-6细胞系来源于正常大鼠肠道[22]。因此，我们使用所收集的媒体向其中来自大鼠静脉血液分别分离，治疗嗜中性粒细胞。与媒体从LPS处理的嗜中性粒细胞的迁移刺激细胞比未处理的细胞显著更高。但这种影响是显着地抑制嗜中性粒细胞时用媒体从WT-SDC1处理和MUT-SDC1转染的细胞。抑制效果是，当被引入从MUT-SDC1转染的细胞介质甚至更大（,数据4 (b)和4 (c))。

4.讨论

肠道是一个独特的组织，是一个复杂的，和谐的平衡得以维持，而这种和谐始终是控制炎症状态。如果失去平衡，疾病可以表现如炎性肠疾病（IBD），脂泻病，或食物过敏[23]。最近，越来越多的证据强调了SDC1的重要性，其病理破坏破坏了上皮内稳态和内部免疫[10- - - - - -12,24]。在我们的研究中，我们证实SDC1的肠道炎症反应的保护作用。在PMA刺激成功构建SDC1的unshedding模型，和，因此，进一步的实验可以得到促进。我们的研究结果提出SDC1脱落和肠上皮细胞的炎症调节之间显著的相关性。SDC1，特别是由unshedding胞外域，可以灭活NF-κ乙途径，下调TNF-α，并抑制CXCL-1诱导的中性粒细胞迁移。这些结果充分证实了抑制SDC1的脱落可以部分通过抑制NF-来减轻炎症反应κB途径和TNF-α在粘膜，其与一致下降SDC1的水平，但在患者血清中增加了其胞外域的水平与克罗恩病[6]。

自它被发现以来，NF-κB被认为是上皮组织稳态和慢性炎症的关键调节因子。刺激,我κB蛋白降解并产生NF-κB到易位到核中，在那里它可以在加剧炎症应答调节靶基因的转录和结果[25]。据报道，在IBD患者的粘膜炎症和肠道炎症实验模型中，活化的NF-水平升高κB，特别是P65、P50和c-Rel [26,27]。我们的结果表明，在LPS的刺激下，P65的总水平和细胞质水平都增加了。这种增强可以被SDC1抑制，这在逻辑上与之前的研究结果一致。然而，我们的结果显示，P65的细胞核水平下降的同时，总水平和细胞质水平下调，提示SDC1是否灭活了NF-还不清楚κB途径通过抑制P65核易位或完全破坏P65基因表达。这也表明可能存在其他一些新的调控蛋白或核伙伴来控制NF-的活性κB，并且还需要进一步研究。但是现在可以肯定的是上皮细胞表面是SDC1，特别是通过unshedding胞外域，可以显著下调P65和我κBα。总之，这些研究结果充分压实是SDC1通过抑制起到了肠炎症反应具有抑制作用NF-κB通路，有效域是外域。

激活NF -κB需要的IkB的多泛素化和蛋白酶体降解α，允许NF-κ乙二聚体在细胞核和激活基因转录积累，伴随着无数的细胞因子包括TNF的显着增加α和il - 1β(25]。在我们的研究中，LPS刺激后，P65显著积累，但IκBα未能降低。SDC1灭活NF -κ通过下调P65乙途径，并未能压制我κBα退化。我们发现SDC1，特别是通过未脱落的完整外膜结构域，可以显著减少TNF-的分泌α，以减轻炎症反应。il - 1β也是肠道炎症升高的重要促炎因子[28]。结果发现我的降解κBα诱导肿瘤坏死因子αT淋巴细胞和单核细胞中的PMA引起NF-的同时激活κ其次是I的急剧增加κBαmRNA及蛋白质合成[29]。I的发起人κBα基因包含κB位点直接参与NF-诱导κB复合体，提示存在一个自我调节回路，借此，IκBα调节NF-的活性κB得到进一步论证[30.]。NF -κB也可以调节I的核衰变κBα/ MAD-3 mRNA在单核细胞，而不影响其基因转录[31]。激活NF -κB可能与I水平的增加平行κBα反之亦然。综上所述,NF -κB / P65形式的监管复杂与我κBα，在那里他们可以互相交流，而我迅速增加κBα其降解后对NF-的重建起重要作用κB /我κBα复杂。

CXCL-1被认为能够通过中性粒细胞迁移诱发炎症事件，并在LPS诱导的肺部炎症、肾小球肾炎和炎症渗出物中被检测到[32]。SDC1有助于中性粒细胞趋化;在小鼠特发性肺纤维化模型中，shed和外源性SDC1外胚结构域可诱导中性粒细胞趋化，抑制上皮创面愈合，促进纤维形成[33]。然而，SDC1和CXCL-1依赖性中性粒细胞迁移的关系进行了研究很少。我们的研究结果表明引起转染野生型SDC1和MUT-SDC1肠细胞CXCL-1含量的这种变化被显著下调，和由这些转染的细胞的条件生长培养基诱导的嗜中性粒细胞迁移降低为好。在肠道炎症，CXCL-1新兵中性粒细胞和加重肠道损伤的高水平。而这种炎症反应可以通过SDC1被取消，特别是由unshedding胞外域。

总之，我们发现SDC1的保护作用，尤其是它的unshedding外功能区，抑制肠道炎症。这表明潜在价值，并在肠道炎症的治疗改善SDC1的重要见解。从抑制肠上皮细胞的SDC1脱落起着改善结肠炎抗炎作用，并因此可用于治疗结肠炎有帮助。

相互竞争的利益

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

作者的贡献

张燕和仲秋王同等贡献。

致谢

这项工作是由中国国家自然科学基金（8157041627）和国家计划，中国的863（2015AA020701）的支持。笔者衷心感谢SONAL Jhaveri博士为她在英语的专业风格改良剂帮助。

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