幽门螺杆菌CagA和il - 1β在非转化上皮细胞模型中促进上皮细胞向间充质细胞的转变

摘要

胃癌是世界范围内导致死亡和感染的第三大癌症幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌)被认为是最重要的危险因素，主要由其活性毒力因子CagA决定。幽门螺旋杆菌/相关蛋白诱导的慢性炎症触发一系列严重性增加的胃损伤，开始与胃炎和与癌症的结束。IL-1β在包括胃癌在内的不同类型的癌症中与肿瘤的发展和侵袭性有关。目前尚不清楚CagA和IL-1之间是否存在关联β在细胞水平上。在本研究中，我们分析了IL-1的作用βMCF-10A非转化细胞的CagA。我们发现了CagA和IL-1的证据β触发上皮细胞向间充质细胞转变的起始β-catenin核易位，表达增加SNAIL1和ZEB1，下调背景，而在MCF-10A腺泡形成形态变化。然而，只有相关蛋白诱导的MMP9活性和细胞侵袭。我们的数据支持，IL-1β和卡加针对β-catenin通路，CagA导致获得与侵袭性肿瘤相关的一个阶段。

1.简介

胃癌(Gastric cancer, GC)是世界第五常见的恶性肿瘤，也是世界第三大癌症死亡原因[1]。GC与by感染密切相关幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌），微需氧革兰氏阴性细菌，其持续寄居的世界人口中至少有50％的胃黏膜[2]。由于它与GC的联系，幽门螺旋杆菌被国际癌症研究机构(IARC)列为第1类致癌物质[3.- - - - - -7]。

幽门螺旋杆菌表达几种毒力和定植因子[8- - - - - -11]。病理效应幽门螺旋杆菌in the gastric mucosa are associated with the presence of CagA (cytotoxin associated gene A), which is encoded in the cag pathogenicity island (cagPAI), a chromosomal DNA segment of about 40 kb encoding genes for a type IV secretion system (T4SS) [6,12- - - - - -14]。不同的细菌利用T4SS向宿主细胞释放效应分子[15,16]。在胃癌细胞系的研究表明，中后粘连幽门螺旋杆菌在上皮细胞中，该分泌系统用于转移CagA蛋白[17]。一旦CagA进入细胞，它就会被激酶Src家族成员和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源基因1 (c-Abl)激酶以EPIYA基序磷酸化[18- - - - - -23]。磷酸化和未磷酸化的CagA会激活一个复杂的信号分子网络，直接影响与细胞转化相关的细胞过程，如增殖、细胞存活、细胞极性以及上皮-间质转化(EMT) [24- - - - - -31]。

慢性炎症是不同类型癌症的重要驱动因素[32,33]。特别地，通过渐进的炎性病变GC演变，开始与浅表性胃炎，其次是萎缩性胃炎，肠化生，和发育异常，到最后成为癌性病变[34,35]。胃癌前病变以单核和多形核免疫细胞浸润和炎症细胞因子如肿瘤坏死因子的存在为特征α(肿瘤坏死因子α白细胞介素- (IL-β和IL-8 [36]。流行病学数据也支持GC和编码TNF的基因多态性之间的关联α,il - 1β和IL-8 [37- - - - - -39]。转基因小鼠体外表达IL-1β进展性病变，反映了人类胃癌发生的多阶段过程。有趣的是，当幽门螺旋杆菌感染被引入提供的证据表明，IL-1β和幽门螺旋杆菌胃癌发生过程中可以合作[40- - - - - -44]。

EMT的特征在于由多个转录，生物化学和形态的变化允许终末分化上皮细胞获得间充质表型。肿瘤细胞EMT后成为迁移性的，具有增加的对降解细胞外基质（ECM）成分的能力和耐失巢凋亡，一种类型的分离的细胞的细胞凋亡的[45]。据认为，从非侵入性进展到浸润性肿瘤依赖于特征在于转录活化因子蜗牛，扭曲，蛞蝓，和ZEB和细胞 - 细胞连接复合的损失通过的核易位引起的EMT程序的激活β-连环蛋白，e -钙粘蛋白的降解，以及背景启动子。所有这些过程都与高度侵袭性肿瘤有关[46]。

我们最近发现CagA通过激活AKT信号通路诱导anoikis耐药[47]。AKT也EMT通过糖原合酶激酶3失活的重要介质β(GSK3β），的关键负调节物β连环。一旦GSK3β是不活跃的,β连环移动到细胞核它有助于打开EMT转录程序[48]。最近的研究也支持CagA、AKT和EMT之间的联系[49,50]。在这项研究中，使用未转化上皮细胞模型中，我们发现，无论是相关蛋白和IL-1β诱导的易位β-catenin进入细胞核和EMT的发生，但只有CagA导致MMP9活性增强和细胞侵袭。

2.材料和方法

2.1。幽门螺旋杆菌菌株和培养

两个相关蛋白阳性幽门螺旋杆菌菌株被用于这项研究:11637年应变与西方类型CagA (EPIYA ABCCC)获得美国类型文化的集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国,43504年)和应变ny02 - 149 East-Asian-type CagA (EPIYA ABD)请捐赠的吉列尔莫Perez-Perez博士从纽约大学。两个额外的幽门螺旋杆菌相关蛋白阴性菌株用作对照：应变365A3，其具有缺少的部分cagPAIcagA基因和含有非功能cagPAI的254菌株。所有幽门螺旋杆菌在5% CO的条件下，将菌株在血琼脂(BD Biosciences, San Jose, CA, USA，编号211037)上生长48小时₂和37°C。

2.2。MCF-10A培养，感染，和IL-1β促进

MCF-10A细胞是人乳腺上皮细胞，取自美国型培养标本(ATCC CRL-10317, Manassas, VA, USA)。按照us和Debnath等人之前报道的方法进行MCF-10A三维(3D)或单层(2D)培养。[47,51]。对于infection assays, MCF-10A cells were seeded at 3000 cells/cm²培养48小时至70%次融合，转入不含胎牛血清(FBS)的dmi - f12。随后，细胞被an感染幽门螺旋杆菌multiplicity of infection (MOI) of 100 and/or stimulated with 20 ng/mL of human recombinant IL-1β(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)。作为所有实验的对照，细胞同样被处理，但未被感染或IL-1处理β(模拟感染/处理的对照组细胞)。在3D培养感染刺激试验中，按上述方法处理单细胞悬液，然后接种于Matrigel中(BD Biosciences, San Jose, CA, USA，编号354230)。细胞培养14天，每隔一天更换培养基。感染和/或IL-1β处理的细胞，天2，4的媒体，和图6种还包含细菌和IL-1β维持刺激政策，而腺泡成长和塑造。

2.3。免疫荧光

在三维条件下细胞生长与多聚甲醛固定(PFA电镜科学猫。15713)20分钟在室温下3.7%,清洗,permeabilized pbs - 0.2% Triton x - 100 20分钟,然后再清洗和治疗pbs - 0.02% Triton goat-serum x - 100 + 10%和1% BSA(阻断缓冲区)。然后用抗gm130抗体(基因号GTX61445;洗涤后用Alexa-488标记的抗兔IgG(美国加州卡尔斯巴德英杰公司编号A11008, 1:100稀释)孵育1小时。细胞用DAPI染色(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA，编号D1306)。最后洗涤后装入3D培养室，加入12个μ大号VECTASHIELD（Vector Laboratories公司，Burlingame的CA，编号H-1000），并在共聚焦显微镜的Lei​​ca SP2观察（徕卡公司，韦茨拉尔，德国）的。共聚焦图像与Leica LAS AF-精简版2.6.0软件进行分析。

2D检测中，细胞在DMEM-F12无菌玻璃杯盖上生长48小时。然后血清饥饿细胞和IL-1β刺激的或受感染的48小时。然后，对细胞进行如通过使用抗用于3D培养物描述的相同的染色处理β联蛋白（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA，编号138400），E-cadherin的（BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州，数量610182），和ZO-1（Genetex，尔湾，CA，数字GTX108613）。最后，细胞制备物固定在载玻片上，并用倒置落射荧光显微镜奥林巴斯IX50观察。图像记录用DP72数码相机和使用Image-Pro Plus软件（V7.0）分析平均控制论（银泉，MD，USA）。

2.4。RNA提取和RT-PCR

总RNA从IL-1中得到β刺激,幽门螺旋杆菌用1ml TRIzol裂解感染细胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA，编号15596018)。使用2.5进行互补DNA合成μ克与试剂盒的SuperScript VILO主混合物（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA，编号11755-050）的反应混合物的总RNA。ZEB1GGG AAT GCT AAG AAC TGC TGG和反义：GGT GTA ACT GCA CAG GGA GC基因是通过使用寡核苷酸对，感觉放大。对于SNAIL1寡核苷酸的基因表现为:意义:TCG GAA GCC TAA CTA CAG CGA;反义:AGA TGA GCA TTG GCA GCG AG;为背景感：CCC ACC ACG TAC AAG GGT C和反义：CTG GGG TAT TGG GGG GCA TC;为RPLP0感：ATG GGG AAG CTG AAG GTC GG和反义：GTG GCA GTG ATG GCA TGG ACT;为GAPDH意义:ATG GGG AAG GTG AAG GTC GG和反义:GTG GCA GTG ATG GCA TGG ACT。20μL PCR混合物含200μM of dNTPs mix, 2.0 mM of MgCl₂，每个引物200 nM, Taq聚合酶缓冲液和1.0 U重组Taq聚合酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA，编号11615-010)。反应过程为94℃变性2 min, 94℃变性1 min, 60℃变性1 min, 72℃变性1 min, 30个循环，最后72℃变性5 min。

2.5。酶谱

MCF-10A细胞的感染幽门螺旋杆菌或者用IL-1处理β48小时后，使用30 K截止Amicon Centricon过滤器(Millipore, Billerica, MA, USA，编号UFC503024)回收和浓缩培养上清液。与1 mg/mL明胶和活化缓冲液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 4.5 mM CaCl)共聚的8% SDS-PAGE凝胶中显示了蛋白酶活性₂)。凝胶用考马斯蓝染色，用ImageJ软件进行密度分析。

2.6。入侵检测

1×10^3.IL-1β刺激的或幽门螺旋杆菌受感染的MCF-10A细胞中的Transwell小单位（康宁，NY，USA，3422号），用基质胶涂覆的聚碳酸酯过滤器内室作为降解基板接种并用无血清DMEM的-F12填充。Transwell小单元的外室中装载补充有10％FBS的作为化学引诱物的DMEM-F12。细胞s were allowed to migrate for 36 h at 37°C. The porous membranes containing migrating cells were cut out from the inner chambers and fixed with 3.4% PFA for 30 min. Fixed cells were permeabilized with PBS-0.2% Triton X-100 and stained with DAPI.

2.7。SDS-PAGE和Western Blot

30μ蛋白质提取物的克在10分出％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），然后转移到硝酸纤维素膜上。膜用抗E-cadherin的抗体印迹，β连环，和β肌动蛋白作为上样对照（由J. M. Hernandez的博士惠赠; CINVESTAV-IPN，墨西哥）。HRP缀合的二级抗体是自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA，编号G21040）。阳性带通过增强化学发光透露。

2.8。统计分析

统计分析采用单因素方差分析检验。数据以均数±标准差表示。值≤0.05为显著性。

3.结果

我们讨论了CagA是否单独和/或与炎症细胞因子IL-1合作β促进β-连环蛋白易位，EMT的第一步。在模拟控制单元中ββ-连环蛋白被定位于细胞膜。相反，后IL-1β治疗或感染cagA基因我们观察到阳性菌株β-catenin被转运至细胞核(图)1(一))。我们没有发现证据表明，两个刺激的组合能够诱导易位β-catenin在细胞核中添加或协同作用(图)1 (b))。当细胞被感染幽门螺旋杆菌菌株缺乏cagA基因或与有缺陷的cagPAI、膜的定位有关β联蛋白没有改变（图1 (b))。

我们分析相关蛋白对位于粘附路口其他膜蛋白的作用。我们发现，E-cadherin的是细胞膜上均匀地分布在未受感染的细胞分布，而在细胞感染cagA基因阳性菌株在部分区域荧光信号下降(箭头)(图)2(一个))。相关蛋白还能够重新分配ZO-1（箭头）（图2 (b))。然后我们评估了CagA和IL-1的作用β在MCF-10A 3D腺泡形态发生。在模拟的细胞，GM130朝向腺泡在心尖面中心本地化。然而，当细胞用IL-1刺激的β或感染幽门螺杆菌cagA阳性菌株GM130蛋白的重新分布，观察周围腺泡中央细胞（图2 (c)顶部面板和底部增强图像)。这些结果表明CagA和IL-1β在腺泡形成过程中干扰GM130定位。

当β通过Western blot分析-catenin和E-cadherin，我们发现这两种蛋白在CagA和IL-1后均保持稳定β实验早期时间点的刺激(图3(一个))。另一方面，转录因子的表达水平ZEB1和SNAIL1EMT启动的两个主要调节因子和背景，该基因对E-cadherin的编码，分别显著两种刺激后发生变化。我们发现的表达增加SNAIL1和ZEB1在IL-1刺激后β或感染(图3 (b)和3 (c)），但SNAIL1表达明显大于幽门螺旋杆菌与东亚EPIYA (ABD)菌株相比，与西方ABCCC菌株相比背景IL-1的表达严重减少β治疗或感染的任何cagA基因积极的幽门螺旋杆菌菌株(图3 (b))。

然后我们测量了MCF-10A细胞上清液中分泌的金属蛋白酶的活性。对明胶酶谱中水解条带的密度分析显示，酶活性的分子量与MMP9相关(图)4(一))。当细胞受到感染时，这种活性有一个主要的高峰幽门螺旋杆菌感染相比，IL-1后β刺激(图4 (b))。入侵检测表明相关蛋白具有在赋予迁徙特性的能力幽门螺旋杆菌受感染的MCF-10A细胞（图4 (c)和4 (d))。有趣的是，类似于金属蛋白酶测定中，IL-1β是效率不高，以诱导细胞侵袭。最后，我们发现入侵的刺激是依赖于AKT和Src激酶活性（图4 (c)和4 (d))。Src的是，磷酸化CagA的主激酶和我们以前曾表明，AKT的相关蛋白诱导的活化依赖于Src活性[47]。总的来说，这些结果与a CagA和IL-1一致β-诱导EMT发病，CagA促进更具侵袭性的癌症特征。

4。讨论

非转化细胞系MCF-10A概括了腺上皮结构的几个特征，提供了一个关于细胞生长、增殖、生长因子独立性和细胞极性机制的系统。该模型已被用于研究病毒和细胞癌基因触发的转化机制，包括一些与乳腺癌的发生无关的基因[51- - - - - -54]。

ZO-1、粘附和β-catenin是上皮细胞顶端连接复合体的一部分，调节细胞极性、增殖和分化[55- - - - - -57]。幽门螺旋杆菌感染可导致MDCK细胞极性丢失和ZO-1蛋白的重新定位，导致上皮屏障完整性受损[26,三十,58]。e -钙粘蛋白经常在emt诱导的转移性癌细胞中丢失[59]。我们观察到，虽然E-cadherin蛋白水平保持不变，但表达下调背景两个IL-1之后的转录本β和CagA的刺激。E-cadherin的降解可能在稍后的时间被激活比那些在这项研究分析或因为它已经在其他研究已经表明EMT可以在不影响E-cadherin的水平发生60,61]。

CagA和EMT之间的联系已经在之前的研究中得到证实。在AGS和MKN74细胞中幽门螺旋杆菌诱导间充质标记的表达ZEB1,波形蛋白,SNAIL1,Snail3,MMP9伴随上皮标志物的减少角蛋白7(62]。EMT还产生具有癌症干细胞(CSC)特征的细胞，并表达CD44 [63]。然而，AGS和MKN74细胞进行转化;因此与癌症相关的信号转导途径和生物学过程相关蛋白的表达之前已经改变[62,63]。在过去的两年中，出现了几个主要的人体胃器官样体模型来进行评估幽门螺旋杆菌感染或相关蛋白的活性。在一项研究中，幽门螺旋杆菌是否会诱导TNF分泌α和il - 1β炎症细胞因子，以及一些趋化因子，通过激活NFκB (64]。在其他研究中，幽门螺旋杆菌通过紧密连接蛋白7的重定位通过激活改变了细胞极性β-连环和蜗牛[65]。

据认为，抗anoikis是入侵肿瘤细胞在EMT和脱离基膜后存活的原因[66]。我们之前的研究表明，CagA通过AKT磷酸化和促凋亡蛋白BIM和BAD失活来诱导anoikis耐药[47]。AKT也是β通过GSK3的灭活联蛋白的核转β;核β-catenin然后启动EMT转录程序[67]。其他研究显示CagA的活性，导致β-连环蛋白核积聚[31]。我们的研究结果表明那易位β-连环蛋白与增加的表达SNAIL1和ZEB1EMT基因，这些基因参与了通过转录抑制贴壁连接的放松背景启动子(68]。此外，我们还观察到增加细胞的浸润和MMP9蛋白酶活性促进由相关蛋白。金属蛋白酶降解ECM成分促进细胞侵袭。有趣的是，我们观察到仅一个相关蛋白介导的增加的MMP9活性和细胞侵袭力，尽管IL-1的β有效地促进β-连环蛋白易位，转录上调ZEB1和SNAIL1和下调背景。这可能是由于长期需要IL-1所致β实现了类似的活动。最近的一份报告显示，稳定的EMT相关的变化只诱导的IL-1后>3周β治疗(69，而在我们的研究中，治疗只持续2到6天。同样相关的还有CagA和IL-1之间缺乏合作β。这可能是因为感染幽门螺旋杆菌IL-1β是否已经饱和了对IL-1的需求β活动。

5。结论

我们的发现支持了CagA的癌蛋白从幽门螺旋杆菌和IL-1的炎症刺激β使用腺泡形态发生模型指导非转化细胞中EMT的发生。是CagA，而不是IL-1β发现诱导有关的癌症的侵袭性表型的细胞的侵袭和形成。

相互竞争的利益

提交人说，他们没有任何相互竞争的利益。

致谢

本论文是为Arevalo-Romero完成分子生物医学研究生项目CINVESTAV (IPN)。作者感谢R.博尼拉-莫雷诺、I. galvano - mendoza、M. C. Dominguez-Robles和A. Trejo提供的技术援助。本研究得到了CONACyT和IMSS (Arevalo-Romero)的奖学金、CONACyT的176880 (Fuentes-Panana)和166462 (Meza)以及Fondo de Apoyo调查HIMFG的Grant HIM-2013-051 (Fuentes-Panana)的资助。

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