GRP 胃肠病学研究和实践 1687 - 630 x 1687 - 6121 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/4969163 4969163 研究文章 幽门螺杆菌CagA和il - 1 β促进一个是非Epithelial-to-Mesenchymal过渡上皮细胞模型 Arevalo-Romero 子》 1、2 2 面向社会 Isaura 1 Vallejo-Flores 加芙 2 http://orcid.org/0000 - 0003 - 2872 - 0459 Fuentes-Panana 伊齐米。 2 Helieh 盎司 1 Departamento de Biomedicina分子 Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados Politecnico Nacional del网页 加拉卡斯Politecnico Nacional研究所2508年 圣佩德罗Zacatenco 07360年墨西哥之城 DF 墨西哥 cinvestav.mx 2 失去de Investigacion en Virologia y癌症 医院Infantil de墨西哥费德里科•戈麦斯 博士162年马尔克斯 殖民地的医生 06720年墨西哥之城 DF 墨西哥 himfg.edu.mx 2016年 20. 7 2016年 2016年 11 02 2016年 13 05年 2016年 26 06 2016年 2016年 版权©2016 Haruki Arevalo-Romero et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

胃癌是全世界癌症死亡的第三个原因和感染 幽门螺杆菌( 幽门螺旋杆菌)被认为是最重要的危险因素,主要由CagA毒性的活动因素。 幽门螺旋杆菌/ CagA-induced慢性炎症触发一系列的胃损伤的严重程度增加,从胃炎与癌症和结束。il - 1 β与肿瘤发展和侵袭性有关不同类型的癌症,包括胃癌。目前,还不清楚CagA和il - 1之间的联系 β在细胞水平上。在这项研究中,我们分析了il - 1的影响 β和CagA MCF-10A是非细胞。我们发现的证据表明,CagA和il - 1 β触发的起始epithelial-to-mesenchymal过渡特征 β连环蛋白核易位的表达增加 Snail1和 ZEB1的差别,对这些 背景期间,形态变化MCF-10A腺泡的形成。然而,只有CagA诱导MMP9活动和细胞入侵。我们的数据支持,il - 1 β和CagA目标 β与CagA连环蛋白通路,导致收购侵略性肿瘤相关的一个阶段。

 CONACyT IMSS 176880年 166462年 CONACyT 他- 2013 - 051 洋底de Apoyo la Investigacion HIMFG 1。介绍

胃癌(GC)是世界上第五个最常诊断恶性肿瘤和全世界癌症死亡的第三个原因 1]。GC是与感染密切相关 幽门螺杆菌( 幽门螺旋杆菌微量需氧的革兰氏阴性细菌,持续开拓殖民地的胃粘膜至少50%的世界人口 2]。由于其与GC, 幽门螺旋杆菌被列为一级致癌物,国际癌症研究机构(IARC) ( 3- - - - - - 7]。

幽门螺旋杆菌表达一些毒性和殖民因素( 8- - - - - - 11]。病理的影响 幽门螺旋杆菌胃粘膜与存在相关联的CagA)(细胞毒素相关的基因,编码的cag致病性岛(cagPAI),约40 kb的编码基因的染色体DNA片段(T4SS) [IV型分泌系统 6, 12- - - - - - 14]。不同的细菌利用T4SS效应分子释放到宿主细胞( 15, 16]。在GC细胞系的研究表明,粘附后 幽门螺旋杆菌上皮细胞,分泌系统是用来把CagA蛋白( 17]。一旦CagA细胞内,它是磷酸化EPIYA图案的Src的激酶家族成员和Abelson小鼠白血病病毒致癌基因1 (c-Abl)激酶[同系物 18- - - - - - 23]。磷酸化,磷酸化CagA然后激活一个复杂网络相关的信号分子直接影响细胞过程的细胞转换,如增殖、细胞存活、细胞极性,epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT) [ 24- - - - - - 31日]。

慢性炎症是不同类型的癌症的重要驱动力 32, 33]。特别是,GC的发展通过进步炎性病变,从浅表胃炎,萎缩性胃炎,肠上皮化生,发育不良,最终成为一个恶性病变( 34, 35]。胃癌癌前病变的特点是突出浸润的单核和多形核的免疫细胞和炎性细胞因子的存在,如肿瘤坏死因子 α(肿瘤坏死因子 α)、白介素- 1 (IL) β,引发 36]。流行病学数据也支持一个GC之间的联系和多态性的基因编码TNF α,il - 1 β,引发 37- - - - - - 39]。转基因小鼠ectopically表达il - 1 β发展进步的病变,镜子多级过程发生在人类胃致癌作用。有趣的是,这些病变时加速 幽门螺旋杆菌介绍了感染提供证据表明,il - 1 β和 幽门螺旋杆菌可以合作在胃致癌作用[ 40- - - - - - 44]。

EMT的特点是多个转录、生化和形态学变化允许终末分化上皮细胞间质表型。肿瘤细胞成为EMT迁徙后,增加降解细胞外基质(ECM)能力组件和他们抵抗,一种分离的细胞的细胞凋亡( 45]。相信从非侵入性侵袭性肿瘤发展依赖于EMT的激活程序的特点是激活转录因子的蜗牛,扭曲、蛞蝓、塔尔·失去细胞间交叉的复合物诱导的核易位 β的差别连环蛋白,钙粘蛋白的降解,对这些基因 背景启动子。一起这些过程与高度侵略性的肿瘤( 46]。

我们最近发现CagA诱发女性抵抗通过一种蛋白激酶信号通路的激活 47]。AKT也是一个重要的调停人EMT通过失活的糖原合成酶激酶3 β(GSK3 β),一个关键的消极的监管机构 β连环蛋白。一旦GSK3 β是不活跃的, β连环蛋白转移到细胞核,它有助于打开EMT转录程序( 48]。最近的研究也支持CagA之间的联系,一种蛋白激酶,EMT ( 49, 50]。在这项研究中,使用一个是非上皮细胞模型,我们发现CagA和il - 1 β诱导的易位 β连环蛋白细胞核和EMT的发作,但只有CagA导致增强MMP9活动和细胞入侵。

 2。材料和方法 2.1。<斜体> H。螺杆菌< /斜体>菌株和文化

两个CagA积极 幽门螺旋杆菌菌株被用于这项研究:11637年应变与西方类型CagA (EPIYA ABCCC)获得美国类型文化的集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国,43504年)和应变ny02 - 149 East-Asian-type CagA (EPIYA ABD)请捐赠的吉列尔莫Perez-Perez博士从纽约大学。两个额外的 幽门螺旋杆菌CagA负面压力被用作控制:365菌株a3,部分cagPAI缺乏 cagA基因,菌株254,包含一个非功能性cagPAI。所有 幽门螺旋杆菌菌株生长在血琼脂(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,数量211037)48 h有限公司5%2和37°C。

 2.2。MCF-10A文化、感染和il - 1 <斜体>β< /斜体>刺激

MCF-10A细胞是人类乳腺上皮细胞,获得来自美国文化集合类型(写明ATCC crl - 10317,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。MCF-10A三维(3 d)或单层(2 d)文化进行之前报道的美国和Debnath et al。 47, 51]。感染化验,MCF-10A细胞被播种在3000个细胞/厘米2和培养48小时达到70% subconfluency然后转向DMEM-F12没有胎牛血清的边后卫。之后,细胞被感染的 幽门螺旋杆菌感染复数(MOI) 100和/或刺激人类重组il - 1的20 ng / mL β(Peprotech落基山,新泽西,美国)48小时。作为所有的控制实验,细胞同样处理但是没有感染,也不接受il - 1 β(模拟感染/治疗控制细胞)。对3 d文化infection-stimulation化验,单个细胞悬浮液如上所述进行处理,然后播种在基底膜基质(美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,354230)。细胞生长14天每隔一天改变介质。在感染和/或il - 1 β细胞治疗、媒体几天2,4,6还包含细菌和il - 1 β维持经济刺激而腺泡生长和塑造。

 2.3。免疫荧光

在三维条件下细胞生长与多聚甲醛固定(PFA电镜科学猫。15713)20分钟在室温下3.7%,清洗,permeabilized pbs - 0.2% Triton x - 100 20分钟,然后再清洗和治疗pbs - 0.02% Triton goat-serum x - 100 + 10%和1% BSA(阻断缓冲区)。细胞培养过夜anti-GM130抗体(Genetex GTX61445数量;1:50稀释阻断缓冲区),洗,孵化anti-rabbit免疫球蛋白贴上alexa - 488(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA, A11008数量,1:100稀释)一小时。细胞与DAPI染色(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA, D1306数量)。最后,准备清洗和安装在3 d文化钱伯斯添加12 μL (VECTASHIELD(向量实验室,伯林盖姆,CA, h - 1000)和共焦显微镜中观察到徕卡SP2(徕卡微系统公司位于德国)。分析了共焦图像与徕卡LAS AF-Lite 2.6.0软件。

2 d化验,细胞生长在无菌玻璃盖玻片DMEM-F12 48小时。细胞被血清饥饿和il - 1 β刺激或感染48小时。然后,细胞受到相同的染色过程作为3 d描述文化通过抗体 β连环蛋白表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国、138400号),钙粘蛋白(BD生物科学,圣何塞,CA,号码610182),和ZO-1 (Genetex欧文CA, GTX108613)。最后,细胞准备安装在幻灯片和观察倒置荧光显微镜数字化奥林巴斯IX50。与DP72数码相机图像记录和分析与Image-Pro +软件(V7.0)平均控制论(美国马里兰州银泉)。

 2.4。RNA提取和rt - pcr

从il - 1获得的总RNA β刺激, 幽门螺旋杆菌感染细胞细胞溶解1毫升的试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA,编号15596018)。2.5互补DNA合成进行使用 μg总RNA的反应混合物上标设备很掌握混合(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA, 11755 - 050)。 ZEB1基因放大利用寡核苷酸对,意义:GGG AAT GCT亚美大陆煤层气有限公司AAC TGC TGG和反义:GGT GTA GCA CAG GGA GC。为 Snail1基因的寡核苷酸如下:意义:TCG棉酚GCC TAA CTA CAG海巡署和反义:AGA TGA GCA TTG GCA GCG AG);为 背景意义:CCC ACC ACG TAC亚美大陆煤层气有限公司GGT C和反义:CTG GGG答TGG GGG GCA TC;为 RPLP0意义:ATG GGG亚美大陆煤层气有限公司CTG亚美大陆煤层气有限公司GTC GG和反义:GTG GCA GTG ATG GCA TGG行为;为 GAPDH意义:ATG GGG亚美大陆煤层气有限公司GTG亚美大陆煤层气有限公司GTC GG和反义:GTG GCA GTG ATG GCA TGG行动。20 μL聚合酶链反应混合物含有200 μMgCl M的核苷酸,2.0毫米2,每个引物的200海里,Taq缓冲区,和1.0 U(重组Taq(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA,号码11615 - 010)。反应进行初始变性在94°C 2分钟步,紧随其后的是30 94°C的周期为1分钟,1分钟60°C, 1分钟和72°C,最终扩展72°C的5分钟。

 2.5。Zymography

MCF-10A细胞被感染 幽门螺旋杆菌或接受il - 1 β48 h和文化上层清液回收和集中使用30 K截止Amicon Centricon过滤器(美国马Billerica的微孔,UFC503024数量)。蛋白酶活性显示在8% sds - page凝胶共聚1毫克/毫升明胶和激活缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值7.4,4.5毫米CaCl2)。凝胶是沾Coomassie蓝色与ImageJ光密度分析软件。

 2.6。入侵检测

1×103il - 1 β刺激或 幽门螺旋杆菌感染MCF-10A细胞被播种的内室Transwell单位(3422年美国纽约康宁、数量)与Matrigel-coated聚碳酸酯过滤器作为降解的底物和填满DMEM-F12自由血清。的外室Transwell单位满载着DMEM-F12补充10%的化学引诱物的边后卫。细胞被允许迁移36 h在37°C。包含迁移的多孔膜细胞削减3.4%从内部钱伯斯和固定PFA 30分钟。固定细胞permeabilized pbs - 0.2% Triton x - 100与DAPI染色。

 2.7。sds - page及免疫印迹

30 μg蛋白的提取分离,10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sds - page),然后转移到硝化纤维膜。膜与钙粘蛋白的抗体,涂抹 β连环蛋白, β肌动蛋白作为加载控制(请提供的j·m·埃尔南德斯博士;CINVESTAV-IPN、墨西哥)。HRP-conjugated二级抗体是英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德G21040)。积极的乐队被增强化学发光显示。

 2.8。统计分析

统计分析是由单向方差分析测试。数据平均值±标准偏差。 p 值≤0.05被认为是重要的。

 3所示。结果

我们解决CagA是否单独和/或配合炎性细胞因子il - 1 β促进 β连环蛋白易位,EMT的第一步。在模拟控制细胞 β连环蛋白是细胞膜的本地化。相比之下,后il - 1 β治疗或感染 cagA积极的压力我们观察到 β连环蛋白转移到细胞核(图 1(一))。我们没有发现证据表明,两者的结合刺激诱发的易位 β连环蛋白进入细胞的细胞核相加或协同效应(图 1 (b))。当细胞被感染 幽门螺旋杆菌菌株缺乏 cagA或有缺陷的cagPAI,膜的本地化 β连环蛋白没有改变(图 1 (b))。

幽门螺旋杆菌CagA和il - 1 β诱导 β连环蛋白核易位。(一)MCF-10A细胞感染CagA阳性菌株(ABCCC或ABD)或与il - 1刺激 β。(b) MCF-10A细胞感染CagA阳性菌株,与il - 1刺激 β或单一感染CagA负变异CagA(−)和cagPAI (−)。免疫荧光图像显示 β连环蛋白(绿色)和原子核(DAPI,蓝色)。箭头表示核染色膜染色(a)和(b) β连环蛋白。数字是代表三个独立的实验进行重复或一式三份。

我们分析的影响CagA其他膜蛋白位于附着连接。我们发现,钙粘蛋白是均匀地分布在细胞膜的细胞无毒性,在细胞感染了 cagA阳性菌株有一些地区的荧光信号下降(箭头)((图 2(一个))。CagA也能够重新分配ZO-1(箭头)(图 2 (b))。然后,我们评估CagA和il - 1的影响 β在MCF-10A 3 d腺泡形态发生。在模拟细胞,GM130本地化对腺泡中心的顶端的脸。然而,当与il - 1细胞被刺激 β或感染 幽门螺杆菌cagA阳性菌株的再分配GM130观察蛋白质周围腺泡中央细胞(图 2 (c)上面板和下增强的图像)。这些结果表明,CagA和il - 1 β干扰GM130定位在腺泡形态发生。

本地化ZO-1 GM130是改变的 幽门螺旋杆菌CagA。(a - b)细胞被感染了CagA积极应变EPIYA ABCCC,沾anti-ZO-1或anti-E-cadherin抗体(绿色)和DAPI(蓝色)。箭在面板(一个)显示信号的钙粘蛋白(b)和面板显示ZO-1移位。(c) MCF-10A细胞被感染 幽门螺旋杆菌阳性菌株ABCCC ABD,与il - 1刺激 β期间,或感染和刺激腺泡形态发生。腺泡结构与anti-GM130抗体(绿色)和DAPI染色(蓝色)和共焦显微镜部分是由腺泡的深度为50%。底部面板显示腺泡的一个增强的片段看到详细GM130分布。数字是代表三个独立的实验进行重复或一式三份。

当 β连环蛋白和钙粘蛋白免疫印迹分析,我们发现两个蛋白质CagA和il - 1后保持稳定 β在早期的实验跨度为(图刺激 3(一个))。另一方面,转录因子的表达水平 ZEB1和 Snail1,两个主监管机构的EMT起始,和 背景钙粘蛋白的编码基因,同时刺激后显著改变。我们发现增加的表达 Snail1和 ZEB1与il - 1刺激后 β或感染(图 3 (b)和 3 (c)),但 Snail1表达明显增大了 幽门螺旋杆菌与东亚EPIYA (ABD)比西方ABCCC应变, 背景表达式由il - 1严重减少 β治疗或感染的 cagA积极的 幽门螺旋杆菌菌株(图 3 (b))。

核易位 β连环蛋白的表达与增加 ZEB1和 Snail1。(一)免疫印迹完整的细胞溶解产物的感染或il - 1 β刺激细胞与反 β连环蛋白和anti-E-cadherin抗体。(b)的相对表达 Snail1和 背景和(c) ZEB1基因是由半定量rt - pcr。管家基因的表达 RPLP0和 GAPDH作为内部控制。数字是代表三个独立的实验进行重复或一式三份。数字是代表三个独立的实验进行重复或一式三份。

然后我们测量的活动metalloproteases MCF-10A上层清液的分泌细胞。光密度分析水解明胶基本吻合乐队显示与分子量相关酶活性与MMP9(图 4(一))。这个活动有一个主峰,当细胞受到 幽门螺旋杆菌相比,感染后il - 1 β刺激(图 4 (b))。入侵检测表明,CagA有能力赋予迁移上的属性 幽门螺旋杆菌感染MCF-10A细胞(数字 4 (c)和 4 (d))。有趣的是,类似于金属蛋白酶试验,il - 1 β不作为有效诱导细胞入侵。最后,我们发现,入侵的刺激是依赖于一种蛋白激酶和Src激酶活动(数据 4 (c)和 4 (d))。Src是主要的激酶磷酸化CagA我们以前表明CagA-induced AKT的激活依赖于Src活动( 47]。总的来说这些结果同意CagA和il - 1 βEMT的全身发作,CagA促进更具侵略性癌症特性。

CagA但不是il - 1 β促进MMP9活动和入侵。(a)代表明胶酶谱显示金属蛋白酶9 (MMP-9)水解活动与il - 1培养基从MCF-10A细胞刺激中恢复过来 β或感染 cagA积极的和消极的 幽门螺旋杆菌菌株。(b)的光密度分析三个独立的实验。(c - d)入侵检测与il - 1细胞的刺激 β或感染。一种蛋白激酶和Src激酶抑制剂(异烟肼)被用来抑制epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT)和CagA活动,分别。(c)显示了一个代表插入入侵细胞数和(d)显示一个图形表示的量化分析。酒吧是意味着折叠标准化模拟细胞变化。实验(a)和(b)进行三次重复以及(c)和(d)一式三份。统计分析是由单向方差分析( p ∗ ∗ ∗ ≤ 0.001 )和模拟细胞作为基线值。

 4所示。讨论

是非细胞系MCF-10A概括几个特点的腺上皮的体系结构提供了一个系统的问细胞生长的机制,增殖,独立生长因子,细胞极性。这个模型被用来研究机制的转换由病毒和细胞癌基因引起的,包括一些乳房癌的发展并不相关( 51- - - - - - 54]。

ZO-1、粘附和 β连环蛋白是调节细胞极性的上皮细胞顶端交叉的复合物,增殖,分化 55- - - - - - 57]。 幽门螺旋杆菌感染诱导极性和搬迁ZO-1蛋白质的MDCK细胞,导致损伤的上皮屏障的完整性 26, 30., 58]。钙粘蛋白经常迷失在EMT-induced转移性肿瘤细胞( 59]。我们观察到,尽管钙粘蛋白的蛋白质含量保持不变,以上的差别是对这些 背景成绩单后il - 1 β和CagA刺激。钙粘蛋白降解可能被激活后次的分析研究或EMT可能发生在不影响水平的钙粘蛋白,因为它已被证明在其他研究 60, 61年]。

CagA和EMT之间的联系已经在以前的研究中显示。在AGS和MKN74细胞 幽门螺旋杆菌诱导表达间充质标记 ZEB1, 波形蛋白, Snail1, Snail3, MMP9的同时减少上皮标记 keratin-7( 62年]。EMT也生成具有癌症干细胞性质的细胞(CSC)和CD44的表达( 63年]。然而,AGS和MKN74细胞转化;因此与癌症相关的信号通路和生物进程已经改变了之前的表达CagA [ 62年, 63年]。在过去的两年里,几个主要出现了人类胃瀑样模型来评估 幽门螺旋杆菌感染或CagA活动。在一项研究中, 幽门螺旋杆菌发现诱导的分泌TNF吗 α和il - 1 β炎性细胞因子,以及几种趋化因子,通过激活NF κB ( 64年]。在其他的研究中, 幽门螺旋杆菌改变了细胞极性通过relocalization claudin-7激活 β连环蛋白和蜗牛 65年]。

人们认为女性抵抗入侵的生存负责肿瘤细胞在发生EMT从基底膜分离 66年]。我们先前表明,女性CagA诱导阻力通过一种蛋白激酶磷酸化和失活proapoptotic蛋白质BIM和坏的 47]。一种蛋白激酶也是一个重要的诱导物 β连环蛋白核易位GSK3通过失活 β;核 β连环蛋白,然后产生EMT转录程序( 67年]。其他研究显示CagA活动导致 β连环蛋白核积累( 31日]。我们的结果表明,易位 β连环蛋白表达增加有关 Snail1和 ZEB1EMT基因,参与的转录镇压粘合连接处并且放松管制 背景启动子( 68年]。此外,我们还观察到细胞入侵和MMP9蛋白酶活动增加CagA提升。金属蛋白酶降解ECM组件促进细胞的侵袭性。有趣的是,我们只看到一个CagA-mediated MMP9活动增加和细胞侵袭性,尽管il - 1 β有效地促进 β连环蛋白易位,转录upregulation的 ZEB1和 Snail1的差别,对这些 背景。这可能是由于慢性il - 1的要求 β实现类似的活动。最近的一份报告显示,稳定EMT-related变化只是诱导il - 1 > 3周后 β治疗( 69年),而在我们的研究中治疗仅为2到6天。同样相关的是CagA之间缺乏合作和il - 1 β。这可能是因为感染了 幽门螺旋杆菌可能直接诱发炎症反应,其中il - 1 β存在,因此已经饱和il - 1的必要性 β活动。

 5。结论

我们的研究结果支持CagA癌蛋白 幽门螺旋杆菌和il - 1的炎症刺激 β指导EMT的出现是非细胞使用模型的腺泡形态发生。CagA但不是il - 1 β发现诱导细胞入侵和咄咄逼人的表型的形成与癌症有关。

 相互竞争的利益

作者认为他们没有任何利益冲突。

 确认

本文是实现分子生物医学的研究生项目,CINVESTAV (IPN) Arevalo-Romero。作者感谢r . Bonilla-Moreno Galvan-Mendoza, m . c . Dominguez-Robles和a . Trejo技术援助。本研究从CONACyT奖学金支持,IMSS (Arevalo-Romero)和赠款176880 (Fuentes-Panana)和166462(就)CONACyT授予他- 2013 - 051 (Fuentes-Panana)从洋底de Apoyo la Investigacion HIMFG。

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