ATAD2过表达可识别结直肠癌患者预后不良并促进癌细胞增殖

摘要

ATPase family AAA domain-containing 2 (ATAD2)被认为是参与细胞增殖和侵袭的关键调控因子。本研究旨在探讨ATAD2在结直肠癌组织中的表达及其与恶性程度的关系。来自Oncomine数据库的三份独立调查数据显示，与正常组织相比，CRC中ATAD2过表达，通过qPCR在32对CRC组织中也发现了类似的结果。在6个CRC细胞系和300个CRC标本中检测ATAD2蛋白表达。结果显示ATAD2高表达与肿瘤大小显著相关、血清CEA，淋巴结转移、肝转移，临床阶段．Kaplan-Meier法提示，ATAD2蛋白表达增高与CRC患者总生存期(OS)显著相关是预后差的独立预测因子。功能研究表明，siRNA抑制ATAD2表达可显著抑制SW480和HCT116细胞的生长。这些结果表明，ATAD2可以作为结直肠癌的预后标志物和治疗靶点。

1.介绍

结直肠癌(CRC)是最常见的致命恶性肿瘤之一，无论是发病率和死亡率[1]．虽然CRC的诊断和治疗水平有所提高，但由于诊断较晚，手术和化疗的疗效仍不理想[2]．因此，迫切需要新的诊断和治疗策略。

ATPase family AAA domain-containing 2 (ATAD2)，又称anca (AAA+ nuclear coregulator cancer associated)，是AAA+ ATPase家族的新成员[3.，4]．ATAD2包含一个溴结构域和一个atp酶结构域，也被定位到染色体8q24，这是许多类型癌症中最常见的扩增区域[5]．ATAD2的特殊结构表明它与基因组调控有关，包括细胞增殖、分裂、凋亡和分化[6- - - - - -10]．最近有报道称ATAD2的异常表达有助于肝癌的增殖和转移[11，12]．研究表明，ATAD2在几种类型的肿瘤如乳腺癌、肺癌和胃癌中高表达[13- - - - - -15]．因此，ATAD2具有致癌功能，在肿瘤发生发展中发挥重要作用。然而，ATAD2蛋白在CRC中的表达及其意义尚不明确。

2.方法

2．1．在硅分析中使用Oncomine数据库

为了确定ATAD2在CRC中的表达模式，在Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)使用。我们按照前面所述的标准程序比较了CRC组织与正常结直肠组织中ATAD2基因的表达[16]．

2．2．细胞培养和转染

5株人CRC细胞系(HCT116、SW480、LoVo、T84、HT29)和1株正常对照结肠细胞系(HCoEpiC)均保存于上海癌症研究所。所有这些细胞系在添加了10% (v/v)胎牛血清(FBS)和1%抗生素的DMEM培养基(Invitrogen)中培养，37℃，在5% CO的湿化培养箱中培养₂条件。

使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，美国)进行转染。靶向ATAD2的小干扰rna (Small interfering RNAs, siRNA)和阴性对照均来自中国上海GenePharma Technology公司。转染是按照制造商的协议进行的。

2．3.患者和组织样本

2005年1月至2014年11月在中国上海交通大学医学院仁济医院收集300例福尔马林固定石蜡包被的CRC组织进行免疫组化染色。此外，本研究同时纳入了32个snap-frozen CRC组织和相应的相邻非癌组织，用于分离RNA，这些组织也是来自仁济医院。入选标准为经组织学证实的结直肠癌和无术前或术后辅助治疗的治愈性肿瘤切除术。从每位患者的病历中收集重要的临床资料，如肿瘤位置、血清CEA水平、临床分期等。随访时间计算从手术日期到死亡日期或最后一次已知随访。本研究中所有CRC组织标本均经患者书面知情同意，所有实验均经当地医院伦理委员会批准。

２.４.实时定量聚合酶链反应

采用Trizol试剂(Takara, Japan)提取原发肿瘤及癌旁非癌组织样本的总RNA，根据厂家说明书使用PrimeScript RT-PCR试剂盒(Takara, Japan)进行逆转录。采用7500 Real-time PCR系统(Applied Biosystems, Inc.， USA)进行实时定量PCR (qPCR)。ATAD2的引物如下:正向引物:5 ' -GGAATCCCAAACCACTGGACA-3 ';反向:5“-GGTAGCGTCGTCGTAAAGCACA-3”。用GAPDH mRNA对ATAD2的相对表达进行标准化。GAPDH的引物为正向引物:5 ' -GCATTGCCCTCAACGACCAC-3 '，反向引物:5 ' -CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 '。

2．5．免疫组织化学染色

4微米厚的组织切片用亲和素-生物素-过氧化物酶复合物系统进行免疫组化染色，如前所述[17]．组织切片用抗atad2抗体(1:400,Abcam, Cambridge, UK)在4°C孵育过夜。免疫组化染色由两名独立的病理学家同时根据阳性细胞的强度和百分比进行评分。染色强度评分如下:0:阴性;1:弱染色;2:适度染色;3:染色较强，阳性细胞百分率0 - 4分(0，<5%;1、5% - -30%;2、30% - -50%;3、51% - -75%; 4, >75%). And the final score was designated as low or high expression group using the percent of positive cell score × staining intensity score as follows: low expression was defined as a total score < 6 and high expression with a total score ≥ 6.

2．6．免疫印迹

Western blot如前所述[18]．转染48小时后收获细胞，40μg蛋白样品经SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上。用免疫染色中使用的一抗在4°C下过夜，用二抗孵育1小时(Boston, MA, USA)。Western blotting分析至少重复三次。

2.7。细胞增殖实验

细胞计数试剂盒8 (CCK-8;Dojindo)。简单地说，对照和处理过的SW480和HCT116细胞以初始密度为3000细胞/孔接种到96孔板中。在每个时间点，10μ每孔加L CCK-8溶液孵育2小时。用酶标仪在450nm处扫描测定吸光度。这个实验至少重复了三次。

2.8。统计分析

采用SPSS 19.0 (SPSS Inc;芝加哥,美国)。与学生对照，分析CRC组织及相应非癌组织中ATAD2 mRNA的表达情况以及。CCK8测定法的相对吸光度值的差异也用学生法测定以及。采用卡方检验分析ATAD2表达与临床病理特征的关系。生存率采用Kaplan-Meier法，生存曲线差异采用log-rank检验。值小于0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.在mRNA水平上，CRC中ATAD2过表达

为了全面研究ATAD2在CRC中的表达，我们分析了来自Oncomine数据库的三个独立的微阵列数据集[19- - - - - -21]．结果显示，与正常组织相比，大部分CRC组织中ATAD2 mRNA表达水平上调(图)1(一)- - - - - -1 (c)）.然后对32对CRC和匹配的正常组织进行qPCR。与Oncomine数据库数据一致，68.75%(22/32)的CRC患者在mRNA水平上也过表达ATAD2(图)1 (d)）.

3．2．ATAD2在CRC中有多种蛋白表达

为了进一步研究ATAD2在蛋白水平上的表达，我们检测了CRC细胞系和组织中的ATAD2水平。与非恶性HCoEpiC细胞相比，5种CRC细胞系中ATAD2蛋白表达均增加。此外，我们发现ATAD2蛋白在低分化的CRC细胞株(SW480、HCT116和LoVo)中表达高于高分化的CRC细胞株(HT29、T84)(图)1 (e)-1 (f)）.然后，我们采用免疫组化染色的方法对300例CRC组织样本进行检测，发现在300例CRC样本中，ATAD2低表达的有124例(41.33%)，其余176例(58.67%)仍为高表达(图)2(一个)- - - - - -2 (c)）.

3．3.ATAD2表达与相应临床参数的关系

为评价ATAD2的临床意义，采用卡方检验分析CRC中ATAD2蛋白表达与临床病理参数的相关性。结果表明，CRC组织中ATAD2的高表达与肿瘤大小密切相关()，血清CEA水平()、淋巴结转移()、肝转移()及临床阶段(）.然而，ATAD2表达与其他临床病理特征(包括年龄、性别和肿瘤位置)之间没有统计学意义的相关性1）.

3．4．CRC患者ATAD2表达与预后的关系

为探讨ATAD2对预后的影响，采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验分析CRC患者的总生存率。结果显示，189个样本中ATAD2高表达与OS呈负相关()(图3(一个)）.此外，根据淋巴转移和肝转移分离的标本，ATAD2阴性组的OS明显优于ATAD2阳性组(图)3 (b)- - - - - -3 (e)）.

对182例CRC患者进行单因素和多因素分析，确认ATAD2作为预后不良的独立危险因素的可能性。单因素Cox回归分析显示ATAD2表达、肿瘤大小、血清CEA、肝转移、临床分期与总生存期(OS)显著相关(见表)2）.多因素Cox回归分析证实ATAD2表达、肿瘤大小、临床分期是CRC患者OS的独立预测因素(表)2）.

3．5．ATAD2对体外CRC细胞增殖的影响

为了更好地了解ATAD2的生物学功能，我们将sirna -ATAD2转染到SW480和HCT116细胞中，内源性ATAD2蛋白的表达水平被Western blot显著抑制(图)4(一)）.此外，我们发现，通过CCK-8测量，与对照组相比，ATAD2敲低导致细胞活力显著下降(图)4 (b)-4 (c)）.

4.讨论

针对CRC的人类临床标本和基因工程小鼠模型的研究，使人们对这种遗传恶性肿瘤有了更好的了解[22]．ATAD2通过不同的机制广泛参与多种肿瘤类型，如前列腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌[4，13，14，23]．前期研究表明ATAD2直接与癌基因AIB1/ACTR相互作用，在ER招募中发挥重要作用α促进促使癌细胞增殖的基因的表达[24]．此外，ATAD2的ATPase结构域也增强了E2诱导cyclin D1和E2F1的表达[4]．此外，ATAD2还与AR直接相关，激活AR介导的转录，调控雄激素诱导基因的表达，控制癌细胞的增殖和生存[4]．

在本研究中，我们首先在mRNA水平检测ATAD2的表达。Oncomine数据库的数据和我们的结果都表明，大多数原发性CRC组织的ATAD2 mRNA表达明显高于与其匹配的正常组织。免疫组化证实了这一趋势，300例CRC组织中有176例(58.67%)发现ATAD2蛋白高表达。既往研究表明，在肝腺癌患者中，通过miR-372调控在转录水平上的ATAD2过表达促进肿瘤恶性化，从而导致预后不良[11]．我们的结果显示类似的现象，ATAD2与CRC患者血清CEA水平、淋巴结转移、远处转移及临床分期呈正相关。此外，ATAD2高表达患者的生存时间明显短于ATAD2低表达患者。此外，单因素分析显示，ATAD2表达升高与CRC患者的OS显著相关;多因素分析显示ATAD2表达、肿瘤大小、临床分期是影响CRC患者预后的独立危险因素。综上所述，这些结果提示ATAD2可能参与了CRC的起始和进展。最后，我们发现ATAD2下调可显著抑制SW480和HCT116细胞的增殖，这与之前对其他癌细胞的研究一致。但其潜在的分子机制尚需进一步研究。

综上所述，我们的研究表明，与相邻的正常组织相比，CRC组织中ATAD2表达增加，可能与CRC的病理发展有关。此外，我们发现ATAD2的高表达可以作为CRC患者的独立预后因素。因此，ATAD2可能是CRC治疗的重要临床标志物。

利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

罗阳、叶光耀、秦少兰等人对这部作品都有贡献。

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