蟾毒灵抑制HCT116结肠癌细胞及其原位肿瘤异种移植小鼠模型通过凋亡相关基因和PTEN / AKT通路

文摘

的目标是。探讨anticolorectal蟾毒灵癌症(CRC)的影响,从毒生物活性polyhydroxysteroid Bufonis,使用HCT116人类CRC细胞和一个建立原位异种移植小鼠模型,并探讨行动的机制。材料和方法。培养HCT116细胞或BALB / c小鼠原位肿瘤治疗的蟾毒灵(积极的控制:研究者用)。细胞增殖、凋亡、MTT比色和骑自行车,膜联蛋白V / PI染色,分别和流式细胞术。在老鼠中,肿瘤抑制率计算和动物生存。PTEN的表达/ phosphate-PTEN, AKT / phosphate-AKT坏,Bcl-xl,伯灵顿,或者Caspase-3细胞和/或肿瘤免疫印迹和免疫组织化学染色法测定。结果。蟾毒灵显著抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡及周期逮捕剂量/时间的方式。在动物模型中,蟾毒灵治疗导致显著抑制肿瘤的生长,延长生存。在Bufalin-treated培养细胞和/或异种移植肿瘤,PTEN的表达,坏,伯灵顿,和Caspase-3显著增加,而p-AKT和Bcl-xL显著下降。结论。我们的研究结果表明,蟾毒灵抑制细胞增殖和原位肿瘤的生长通过内在的凋亡通路诱导细胞凋亡,具有关键意义的识别的一种抗癌药物协同蟾毒灵。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是最常见的恶性肿瘤之一,估计在120万年全世界每年新诊断病例和608700人死亡(1]。结果晚期CRC患者仍然贫穷,与平均生存时间(还不到20个月2]。如此高的发病率和持续相对不良预后的CRC强调需要一个新的治疗策略。

蟾毒灵是一种生物活性polyhydroxysteroid隔绝毒Bufonis,也被称为Chansu,中药经皮肤和腮腺毒液腺的蟾蜍3,4]。Chansu最初记录的1000多年前,是一个著名的中国传统医学在中国广泛应用于癌症治疗(5,6]。最近的实验研究表明,Chansu及其活性化合物蟾毒灵在各种肿瘤模型表现出显著的抗肿瘤活性。底层机制包括抑制细胞增殖、诱导细胞分化和凋亡,干扰细胞周期,抑制血管生成,逆转多药耐药性,调节免疫反应的7- - - - - -11]。

最近表明,蟾毒灵导致CRC细胞凋亡的抑制Jak-STAT3通路(12]。然而,很少有报道相关的抗癌效果蟾毒灵在CRC动物模型,和确切的机制调解这种抗癌效果仍有待阐明。本研究旨在调查在体外和在活的有机体内anticolon癌症的影响蟾毒灵使用HCT116人类结肠癌细胞培养系统和原位癌异种移植CRC模型。次要目的是确定蟾毒灵的作用的可能机制,关注细胞凋亡和apoptosis-related通路的基因。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和动物模型

HCT116结肠癌细胞(上海生命科学研究院)是培养rpmi - 1640中补充10%的边后卫(美国生活技术,Gibco)、青霉素100单位/毫升,100年μg / mL链霉素和2 m毫升谷氨酰胺在37°C公司为5%₂并通过使用0.25%胰蛋白酶/ 0.02%乙二胺四乙酸(EDTA) 70%至80%的融合(2 - 3天)。细胞通道的最大时间小于10(< 3个月)后细胞从冻结的股票中恢复过来。收集细胞对数生长期的实验。

为在活的有机体内研究,5-6-week-old雄性BALB / c小鼠的体重使用18 - 20克(上海Sippr BK实验动物有限公司、上海、中国)。老鼠被安置在一个温度和湿度控制无菌动物设施和美联储根据提供的标准指令动物提供者。动物研究都是按照国际标准执行批准的动物福利和动物保健和使用委员会研究所上海中医药大学(批准文号:SYXK,上海,2013 - 0055)。

的原位HCT116异种移植模型建立如下:HCT116细胞从培养瓶和悬浮在培养基的浓度10×10⁷毫升⁻¹。为每个5老鼠,200μL细胞悬液是右腋部皮下注入。两周后,皮下异种移植肿瘤是收获,后切成块(直径1.5毫米)刮掉周围的纤维囊,和直接植入腋部皮下肿瘤为下一代模式。从第三皮下肿瘤生成用于建立原位异种移植模型,根据先前的报道13- - - - - -16]。总之,第三代皮下肿瘤收获,切成块直径(1.5毫米),裸体小鼠麻醉,腹部与碘和酒精棉签消毒。小中线切口是和盲肠肠是形象化的一部分。浆膜的肿瘤块的地方被植入了amyxis。单一的肿瘤被植入的墙壁盲肠和医用胶固定。小肠是返回到腹腔,腹壁外科缝合关闭。然后动物被保存在一个无菌的环境。

2.2。MTT (3 - 4, 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyl溴化四唑)测定

HCT116细胞被播种在1×10的浓度⁵/ 96 -孔板和孵化24 h。细胞被对待蟾毒灵(美国Sigma-Aldrich)浓度的6 3,1,0.6,0.3,0.1,0.06和0.03μ24小时和48小时。消极的控制只是对待文化值。MTT试验进行了细胞生长测定工具包(美国Sigma-Aldrich),根据制造商的指示。细胞生长抑制率计算。

2.3。流仪对细胞周期的分析

HCT116细胞被播种在6-well细胞培养板2×10的浓度⁵每24 h和暴露于蟾毒灵在不同浓度的0.03,0.3,和3μ米额外48 h。消极的控制只是对待文化值。细胞被收集,离心机,并与70%乙醇固定在4°C,过夜。最后,固定细胞被propidium碘染色(PI)解决方案(1毫克/毫升π,100μL /)在室温下30分钟在一个黑暗的环境。使用流式细胞仪分析细胞周期。

2.4。细胞凋亡测定

细胞凋亡是由膜联蛋白V和π(V / PI)双重染色。HCT116细胞被放置在6细胞培养板2×10的浓度⁵每口井。24小时孵化后,细胞暴露于蟾毒灵在不同浓度的0.03,0.3,和3μM和培养48 h。井处理文化中没有蟾毒灵作为消极的控制。细胞被收获和离心机,细胞浓度调整到10⁹/ L。的膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备用于染色细胞和细胞凋亡是由流式细胞术,根据制造商的指示。

TUNEL分析(终端原位deoxy-UTP-fluorescein尼克末端标记分析)确定执行组织样本中细胞凋亡。四个μ测试使用m的组织部分原位细胞死亡检测设备(罗氏,曼海姆,德国)根据程序所描述的制造商。高的显微镜下,5个随机选择的字段(×400)没有任何观察坏死区域,和阳性细胞的平均比例为每节在5个领域是计算。

2.5。透射电子显微镜下凋亡细胞的形态学观察

HCT116细胞被播种在6-well细胞培养板2×10的浓度⁵每口井和孵化24 h。细胞被对待蟾毒灵在不同浓度的0.03,0.3,和3μM(-井用培养基没有蟾毒灵)治疗的另一个24小时。细胞与汉克斯解决方案收集和清洗离心机紧随其后。样品固定在2.5%戊二醛(一夜),其次是1% OsO4 1 h。最后,细胞脱水系列的丙酮浓度和嵌入在树脂。超薄部分被削减和透射电子显微镜下观察(飞利浦Tecnai-12)。

2.5.1。免疫印迹

坏的表情,PTEN / p-PTEN磷酸(PTEN),或一种蛋白激酶/ p-AKT(磷酸盐AKT)细胞,Bcl-xl,伯灵顿,或者Caspase-3异种移植的组织样品测定免疫印迹。培养HCT116细胞被放置在6细胞培养板1×10的浓度⁸细胞每口井和孵化24 h。然后细胞治疗蟾毒灵在不同浓度的0.03,0.3,和3μ米(负控制井被培养基)治疗48 h。总蛋白提取和纯化利用ProteoJET哺乳动物细胞裂解试剂工具包(美国热科学)。异种移植肿瘤组织,50毫克的组织是地面与液态氮和蛋白质然后使用ProteoJET哺乳动物细胞裂解提取和纯化试剂盒(美国热科学)。40毫克的蛋白质从每个样本中提取与凝胶混合加载缓冲区,煮5分钟,8% SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,然后转移到聚乙二烯二氟化物膜。减少非特异性背景,膜浸泡在5%脱脂奶粉溶液在室温下1 h。涂抹膜与anti-Bad孵化、anti-PTEN anti-p-PTEN, anti-AKT,或anti-p-AKT单克隆抗体(细胞信号技术,美国)培养细胞和anti-Bcl-xl, anti-Bax,或anti-Caspase-3异种移植组织,一夜之间在4°C。随后,细胞膜是孵化HRP-labeled anti-rabbit或anti-mouse抗体室温1 h。乐队被使用ECL +可视化检测系统(微孔,德国)。蛋白质表达水平量化了萤石化学FC2(αInnotech,美国),表示为目标蛋白的光密度比内部控制,β肌动蛋白。所有的测试进行了一式三份。

2.6。在活的有机体内疗效研究

验证原位异种移植的成功,开腹探查术进行随机选择5日老鼠肿瘤接种后第12天。六十与原位肿瘤异种移植小鼠随机分为5组(每组12只老鼠):NS组(治疗0.2毫升生理盐水),研究者用组(治疗研究者用25毫克/公斤),和三个独立的蟾毒灵团体治疗与低(0.5毫克/公斤),中等(1.0毫克/公斤),或高剂量的蟾毒灵(1.5毫克/公斤)。研究者用NS,蟾毒灵被腹腔内注射管理,每天一次从每天15 - 21所示。

所有的老鼠都在研究期间每天观察和称重一次。最后一次治疗后三天,从每组6只老鼠被安乐死。所有的肿瘤都仔细切除并测量获得的最大直径和最小直径。肿瘤体积和生长抑制率(IR)计算如下:;IR = ()×100% /。所有的肿瘤都是一分为二的,一部分为常规于10%福尔马林固定,石蜡包埋他和免疫组织化学染色,和其他快速冷冻和储存在液氮TUNEL检测和免疫印迹。对于剩下的每组6只老鼠,时间从肿瘤植入到垂死的状态(生存)被记录。

2.7。免疫组织化学染色(包含IHC)

串行的部分4μ米厚度减少的福尔马林固定和石蜡包埋原位异种移植组织样本包含IHC染色。检索后抗原使用柠檬酸缓冲(0.01毫升,pH值6.0),幻灯片洗了三次PBS和孵化10%正常山羊血清非特异性背景染色。部分与兔子反Bcl-xl被孵化,伯灵顿,Caspase-3,坏,PTEN、p-AKT抗体(细胞信号,美国)在一夜之间在4°C。与PBS洗了三次后,部分被孵化与辣根过氧化物酶(合)anti-rabbit免疫球蛋白(Maixin生物、福州、中国)在室温下为30分钟,最后用PBS和使用diaminobenzidine开发(DAB)。五个高功率微观领域(×400)随机选择从每个幻灯片来确定Bcl-xl的阳性染色强度,伯灵顿,Caspase-3,坏,PTEN、p-AKT蛋白质IPP软件(Image-Pro Plus6.0,媒体,控制论)。一个清白的区域被选中并设置为背景。蛋白质的表达水平的平均染色强度提出了5个字段从每个幻灯片。

2.8。统计分析

所有数据都表示为百分数,平均值和标准偏差(x±sd)或中位数95%置信区间(95% CI)。统计分析是利用学生的完成的tMann-Whitney以及方差分析、卡方检验U测试,Wilcoxon测试,LSD Games-Howell测试,或kaplan meier和生存率较合适,使用SPSS 17.0对Windows。被认为是一个统计上的显著水平。

3所示。结果

3.1。蟾蜍灵对HCT116细胞增殖和细胞周期的影响

MTT测试表明,蟾毒灵抑制细胞增殖。的集成电路₅₀0.243在24和48 hμM和0.024μM,分别。的抑制作用,并存在剂量依赖的相关性(图1)。流式细胞仪显示G的数量₂/ M细胞显著增加在那些接受0.03,0.3,和3μM蟾毒灵用药剂量的方式,相对于控件()(图1)。

3.2。蟾蜍灵对HCT116细胞凋亡和形态学的影响

V / PI双染色法和流量仪分析表明,细胞的凋亡率接受不同剂量的蟾毒灵均明显高于对照组()(图2)。细胞凋亡率依赖于剂量的蟾毒灵()(图2)。此外,有一个显著的差异指出在所有团体治疗与蟾毒灵()(图2)。

显微镜下,他彩色未经处理的细胞似乎是不规则与细胞有丝分裂纺锤形或多边形。0.03在细胞治疗μM蟾毒灵,形态的变化包括细胞dwindlement和收缩,细胞间隙增大,染色质凝聚,降低有丝分裂。然而,细胞的数量与对照组相比没有显著不同。细胞治疗0.3和3μM蟾毒灵,染色质浓缩,细胞之间的断开,和损失的球形细胞形状(图2);细胞的数量也与对照组相比显著降低()。0.03透射电子显微镜下,细胞治疗μM蟾毒灵有典型的早期细胞凋亡的超微结构变化,包括血浆的稀疏和染色质着边。细胞质散射、染色质缩合和细胞的凋亡的身体被处理0.3μ蟾毒灵。在细胞凋亡的身体也看到处理3μM蟾毒灵(图2)。

3.3。蟾蜍灵对表达的影响不好,Caspase-3, PTEN / p-PTEN,或者一种蛋白激酶/ p-AKT细胞

PTEN的表达是调节细胞内处理3μM蟾毒灵,而p-PTEN显著减少细胞处理0.3μ米和3μM蟾毒灵相比对照组()(图3)。也有增加在糟糕的表达式()(图3)。没有明显变化的一种蛋白激酶表达所有组处理蟾毒灵,但p-AKT的差别明显对这些基因在细胞治疗0.3μ米和3μ蟾毒灵()(图3)。蟾毒灵增加剂量,Caspase-3的磷酸化是增强的,0.3的治疗μ米和3μM蟾毒灵劈开Caspase-3引起的(分子量的碎片17或19 kd)。

3.4。蟾蜍灵对小鼠原位肿瘤异种移植的效果

肿瘤接种后12天,原位肿瘤异种移植被认为在所有5个随机选择的老鼠接受开腹探查术和测量直径0.8 - -1.0厘米。在实验中,没有明显的临床表现或体重变化在所有组与蟾毒灵治疗。

研究者用和蟾毒灵的抑制率低、中、高剂量分别为69.6%,45.6%,56.2%,和58.5%,分别。肿瘤体积显著低于治疗组比对照组()(表1和图4)。老鼠用蟾毒灵治疗显示出显著延长生存时间控件(相比)(表2和图4)。

3.5。蟾蜍灵对肿瘤细胞凋亡的影响及细胞凋亡相关基因的表达

异种移植肿瘤的凋亡率在每个组表中列出1。每个Bufalin-treated组的肿瘤凋亡率显著高于控制和研究者用组()。凋亡率没有显著差异之间的研究者用治疗,对照组。图4显示凋亡细胞(细胞的核由绿色荧光染色)在显微镜下。

免疫印迹显示每个Bufalin-treated Bcl-xL组的表达显著下调剂量依赖性的方式()(图5)与对照组相比。然而,在没有区别Bcl-xL表达式中三个Bufalin-treated组()(图5)。伯灵顿的表达和Caspase-3增加肿瘤治疗蟾毒灵,也是存在剂量依赖的相关性(图5)。的表达裂解Caspase-3被发现在三个治疗组(图5)。包含IHC染色的肿瘤部分显示类似的结果(图5)。

此外,糟糕的表达、PTEN和p-AKT在肿瘤检测到我(图5)。结果显示坏、PTEN和p-AKT蛋白质是位于细胞质中。蟾蜍灵诱导糟糕的表达方式存在剂量依赖的相关性,并负对照组和弱,介质,和强阳性染色法在治疗组低,中,高剂量蟾毒灵。PTEN的表达是软弱的对照组,但显著增加肿瘤时蟾毒灵治疗剂量的1.0和1.5毫克/公斤()。p-AKT高度表达的蛋白质控制肿瘤,减少与0.5毫克/公斤蟾毒灵治疗后,虽然这没有达到统计学意义。肿瘤治疗1.0毫克/公斤和1.5毫克/公斤蟾毒灵p-AKT表达显著降低,而控制()。

4所示。讨论

蟾毒灵是一个主要的生物活性成分的毒Bufonis并从Chansu干的皮肤分泌物中提取以以卵泡中的康托尔或b . melanostictus施耐德。Cinobufacini注入的最活跃的成分,已在中国使用治疗肝、肺、结直肠恶性肿瘤(5,6]。最近,一些实验研究结果表明,蟾毒灵各肿瘤细胞表现出显著的抗肿瘤活性,如人类肝细胞癌(7),肺癌8),早幼粒细胞白血病(17),和胃癌10]。符合秋等人的研究。18),我们的研究发现,蟾毒灵减少培养的可行性HCT116人类CRC细胞剂量和时间的方式。类似的研究结果报道在SW620结肠癌细胞(12]。

此外,蟾毒灵发现了引起细胞周期阻滞在有丝分裂期(胃癌10]),g1期(非小细胞肺癌A549 [8]),G2 / m期(白血病细胞(19)和骨肉瘤细胞(20.])。蟾毒灵在s阶段降低卵巢癌细胞的比例,增加比例在G0 / G1期细胞周期,但几乎没有影响正常的人类子宫内膜上皮细胞(21]。在目前的研究中,我们发现蟾毒灵治疗引起的细胞累积在G2 / M期。针对不同细胞系的不同细胞周期的变化表明,蟾蜍灵对细胞周期的影响可能是特异性的。它也发现蟾毒灵明显诱发HCT116细胞凋亡,与先前的报道在不同的癌症包括肝(7)、肺(10)、前列腺癌(11],colorectum [12]。

受这些发现,我们旨在评估蟾毒灵的抗癌效果CRC动物模型。CRC,皮下异种移植模型被广泛用于调查候选药物的抗癌作用[22- - - - - -25]。这样的模型,然而,可能会导致异种移植肿瘤生物学特性的变化;例如,它可能永远不会导致肿瘤转移,因为不合适的生长环境。蟾毒灵被报道以来,抑制癌症转移(18),研究蟾毒灵的抗癌效应在CRC的原位动物模型可能比传统的皮下模型更合适。据我们所知,这是第一个研究解决蟾毒灵在先前建立的抗肿瘤效应原位CRC异种移植模型(26]。蟾毒灵被发现显著抑制肿瘤的生长,延长生存的动物模型。

底层机制调解蟾毒灵的抗癌效果是多方面的,包括自噬、血管生成和恶性表型相关的基因表达在人类癌症细胞7- - - - - -11]。我们进一步探讨潜在机制通过测试的几个关键基因的表达AKT-related凋亡通路包括PTEN / p-PTEN,坏,伯灵顿,Bcl-XL, Caspase-3, AKT / p-AKT Bufalin-treated HCT116细胞和/或原位异种移植肿瘤。

人类的哺乳动物细胞凋亡的内在和外在的通路。内在或线粒体通路,bcl - 2家族在控制细胞凋亡中起着至关重要的作用和功能上可以分为两个不同的组:proapoptotic蛋白质如伯灵顿,坏,出价和bcl - 2凋亡蛋白如Bcl-xL,严格调控线粒体凋亡通路。蟾毒灵可以触发mitochondria-mediated在许多肿瘤细胞凋亡的差别通过对这些基因bcl - 2 / Bcl-xL和/或upregulation伯灵顿/坏/报价10,21,27,28]。例如,Qi et al。28]发现蟾毒灵可以增加Fas的表达,伯灵顿,投标和减少bcl - 2表达,破坏线粒体膜电位表明蟾毒灵通过mitochondria-mediated凋亡通路。同样地,我们发现坏的增加表现在Bufalin-treated培养HCT116细胞异种移植肿瘤组织和伯灵顿的表达增加和减少的表达在Bufalin-treated Bcl-xL异种移植肿瘤组织。这表明mitochondria-mediated凋亡起着至关重要的作用。

我们还研究了上游基因的改变(PTEN和AKT)和下游基因Caspase-3 Bufalin-treated培养细胞和异种移植肿瘤组织,发现PTEN表达增加而p-AKT减少。PTEN是一个肿瘤抑制基因与许多癌症相关的生物功能,如抑制细胞增殖的29日和迁移30.)和核细胞周期蛋白D1的本地化(31日]。缺乏和突变的PTEN、多种可能发生肿瘤,包括子宫内膜癌(32),膀胱癌(33),胃肠道癌症(34]。核PTEN的表达逐渐减少恶性转变后,和损失在细胞核中PTEN的表达与肿瘤进展和临床疗效不佳在CRC (35]。PTEN以来报道涉及PI3-K信号的失活36),PTEN的Bufalin-related增加可能灭活AKT通过减少p-AKT通过PI-3K通路水平。这是支持的发现的表达降低p-AKT Bufalin-treated细胞和异种移植肿瘤。之前的研究表明,一种蛋白激酶磷酸化坏灭活的,因此,上游阻止线粒体细胞色素C的释放行为(37]。Akt也发挥其在细胞凋亡影响premitochondrial阶段,至少在某种程度上,通过抑制伯灵顿构象变化和线粒体膜的再分配。此外,一种蛋白激酶抑制细胞死亡通过维持线粒体完整性和抑制半胱天冬酶激活(38]。因此,AKT失活可能也扮演着重要的角色在Bufalin-treated细胞的增殖和凋亡。最后,正如上面所提到的PTEN-AKT-Bad /伯灵顿信号导致下游蛋白的激活,Caspase-3。我们发现Caspase-3在Bufalin-treated激活细胞异种移植肿瘤。在这项研究中,p-PTEN Bufalin-treated细胞减少,这很令人吃惊,这还有待进一步阐明。

研究局限性包括以下几点:(1)只有一个细胞系进行了研究;(2)虽然我们确实发现蟾毒灵治疗和apoptosis-related基因表达之间的联系,详细的激活/失活过程需要进一步阐明利用特殊敲入或可拆卸的技术,这是我们正在进行的研究的一部分。

5。结论

这项研究的结果表明,蟾毒灵可以显著抑制细胞增殖培养细胞和肿瘤生长在原位异种移植动物模型。蟾蜍灵诱导细胞凋亡通过内在的基因的激活凋亡通路包括PTEN、一种蛋白激酶,坏/伯灵顿,Caspase-3,识别关键意义的抗癌药物可能协同蟾毒灵治疗。

信息披露

这部分工作是在2012年的美国癌症研究协会年会上,芝加哥,2012年3月31日至4月4日。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

洁王、陈曹国伟同样起到了推波助澜的作用。

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