RNA干扰靶向NET-1联合索拉非尼治疗肝癌的研究体外和体内

摘要

本研究的目的是探讨RNA干扰的靶向的抑制效果（RNAi）的NET-1或与HCC索拉非尼组合体外和体内及其可能的机制。通过RT-QPCR和免疫印迹法检测NET-1 mRNA和蛋白的表达。增殖的能力通过CCK-8测定法测定。细胞凋亡，通过流式细胞术（FCM）检测。迁移和侵袭的能力，通过刮擦伤口测定和Transwell小测定法测量。MHCC97H细胞用NET-1shRNA的稳定转染皮下注射以制备HCC和Caspase-3和Caspase-8的裸鼠模型中，并且检查在不同组中的肿瘤组织的胱天蛋白酶-9的mRNA。NET-1 mRNA和蛋白在用NET-1shRNA转染的细胞MHCC97H急剧降低。增殖和迁移的能力受到抑制和细胞凋亡是在任一NET-1shRNA或索拉非尼晋升为与未处理的细胞相比体外和体内()。胱天蛋白酶-3的mRNA水平，胱天蛋白酶-8，和caspase-9肿瘤组织在不同的治疗组均减少，与未处理组，特别是在组合组相比。()。组合NET-1shRNA用索拉非尼显着增强的抗肿瘤索拉非尼，其可以在阻断Ras信号通路并且同时刺激凋亡途径涉及的影响。

1.介绍

肝细胞癌(HCC)是全球第三大癌症死亡原因[1]，发展中国家某些地区的HCC发病率比发达国家高16-32倍。基因治疗作为一种新的治疗策略，已被广泛应用于包括肝癌在内的多种癌症。以sirna为靶点，沉默与肿瘤细胞增殖或转移相关的基因，作为一种基因治疗方法，对肝癌的治疗效果显著。New EST tetraspanin-1，又称NET-1(C4.8, Tspan-1, P503S)， tetraspan超家族(TM4SF)的成员之一[2- - - - - -4]，似乎在大多数肝癌是相当表达较正常成人肝组织[5]。这种肿瘤特异性表达的诱人特性使NET-1成为肝癌潜在的治疗靶点。

索拉非尼，美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期肾细胞癌(RCC)和难治性HCC患者的口服多激酶抑制剂。最近几年,体内和体外研究表明索拉非尼可以通过抗增殖、抗血管生成和/或促凋亡作用抑制肿瘤生长和破坏肿瘤微血管系统。索拉非尼是治疗中晚期HCC的重要进展，是首个被证明可以延长中晚期HCC生存期的全身疗法。一些检查索拉非尼与化疗药物(如氟尿嘧啶)联合使用的试验[6]，吉西他滨[7]，或卡培他滨联合奥沙利铂[8)或索拉非尼加其他分子靶向治疗(如西罗莫司[9)正在进行中，并正在产生有希望的结果。然而，使用RNAi技术联合索拉非尼进行基因治疗治疗HCC的研究却鲜有报道。因此在本研究中，我们采用NET-1shRNA联合索拉非尼探索治疗HCC的新策略体内和体外。

2.方法

2.1。细胞培养

人类肝癌细胞系MHCC97H是好心的肝癌研究所，中山医院，上海提供的。细胞用Dulbecco氏补充有10％胎牛血清（FBS）（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）在潮湿气氛中含5％CO改良Eagle培养基（DMEM）（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA）中培养₂在37℃下。本实验分为四组，包括未处理组，索拉非尼组，NET-1shRNA组和组合NET-1shRNA用索拉非尼组。

2.2。质粒转染

pSilencer4.1-CMVneo-NET-1shRNA（NET-1shRNA）和pSilencer4.1-CMVneo-对照shRNA（对照s​​hRNA）质粒设计和百奥迈科生物技术有限公司（南通中国江苏）合成。前一天的转染，将细胞在无血清和抗生素的培养基中培养。轻轻混合，并温育在室温下20分钟后，shRNA和脂质体2000（Invitrogen）中的转染混合物加入到培养板中。After 6 h, the transfection mixture was replaced by DMEM supplemented with 10% FBS. Cells were harvested at 48 h after transfection.

2.3。实时定量RT-QPCR

使用PicoPure RNA isolation Kit (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA, USA)按照制造商的说明提取总RNA。扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内控[10]。该PCR引物由底漆总理5.0软件设计（表1)。引物(20 pmol /μL）加入到反应缓冲液中的25的总体积 μ与模板RNA 4升一起 μL，掌握混合12.5μL，和SYBR Green我0.5 μL. PCR是在下列条件下进行：在94℃下30秒，在62℃下30秒，以及在7240秒℃，50℃循环。实时RT-Q-PCR用SYBR Green PCR主混合物（Applied Biosystems公司，福斯特市，CA，USA）使用MIQ机（Bio-Rad实验室，大力士，CA）进行。荧光信号在伸展相，收集，计算样品的Ct值，和NET-1转录物水平通过2-ΔΔCT方法进行分析。

2.4。Western印迹分析

MHCC97H cells were harvested at 48 h after transfection. Cells were lysed with buffer containing 0.1 mol/L Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS, 20% glycerine, 0.1% BPB, and 5%β巯基乙醇。在沸水中加热了5分钟。蛋白质10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)为2 h 350毫安,后来浸泡2 h在屏蔽解决方案(Tris-buffered盐水含5%脱脂奶粉和0.01%卷/卷Tween-20),和孵化一小时在室温下存在Anti-NET-1兔多克隆抗体(11,12]，或者用作内部对照，然后在4℃下孵育过夜抗GAPDH小鼠单克隆抗体（Sigma，USA）。After incubation, the membrane was washed 3 times, and peroxidase-conjugated goat anti-rabbit or goat anti-mouse secondary antibodies (ICN Laboratories, Irvine, CA; diluted 1 : 10,000) were added and incubated for an additional one hour. Reaction was visualized by the ECL chemiluminescence detection system (Pierce, USA) on radiographic films (Koda, USA). The molecular weight of NET-1 and GAPDH [13] were 76 kDa and 37 kDa, respectively. The results were analyzed using Image J software.

2.5。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

2.5.1。IC 50测定法

索拉非尼购自拜耳制药公司，溶解于无菌DMSO中，冷冻保存在- 20℃的光照保护条件下。将索拉非尼的原液用DMEM培养基稀释，并在各孔中加入等份，使最终浓度为0、3、9、18、30、60和100μM.为了确定索拉非尼的50％抑制浓度（IC50），将CCK-8（同仁，熊本，日本）中。MHCC97H细胞以5.0×10接种^3. cells/well in 100 μL将DMEM置于96孔微板中，在37℃加5% CO的加湿气氛中孵育过夜₂。After the cultures were incubated for 0 h, 24 h, 48 h, and 72 h, we exchanged fresh DMEM gently and 10 μL of CCK-8 solution was added to each well, and the plates were incubated for 2 h at 37°C. We measured the absorbance at 450 nm using an optical density (Microplate Reader 550; Bio-Rad, Tokyo, Japan) and calculated the IC50 concentration of sorafenib by the intersection of the plotted line (Figure2)。索拉非尼的IC50是在生长，凋亡，刮擦伤口，transwell小室测定法中使用。

2.5.2。生长试验

5×10^3.cells in each group were seeded in 96-well plates and cultured for 0, 24, 48, and 72 h, the optical density at 450 nm wavelength was measured through an automated plate reader and then cell growth curves were drawn.

2.6。流式细胞仪（FCM）

细胞凋亡检测使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒I (Clontech Laboratories Inc.， USA)，根据制造商的协议检测细胞凋亡。细胞以2×10的密度接种于6孔板⁵/mL胰酶法收获，冷PBS洗涤，1000rpm离心，400 rpm重悬μ大号1×结合缓冲液，再次离心并除去上清液。细胞重新悬浮于200个细胞 μL 1 * binding buffer，转移到无菌FCM玻璃管中。3μ大号的膜联蛋白V-FITC和3 μ大号碘化丙锭加入，然后在室温下黑暗中温育。Cells were analyzed by FCM (FACSCalibur, Becton-Dickinson, USA) at 488 nm. The distribution of cells was analyzed using CellQuest software (Becton-Dickinson) in the FCM within 1 hour of staining. Data from 10,000 cells was collected for each data file. Apoptotic cells were identified as Annexin V-FITC-positive and P-negative cells.

2.7。划痕伤口分析

将细胞以5×10孔的密度接种⁵在24个孔板中并孵育过夜。一天后，在餐具表面进行轻度有一个黄色的P200移液器吸头划伤（费舍尔）和下一个卡尔蔡司的Axiovert 25（索恩伍德纽约州，美国），倒置显微镜使用佳能的PowerShot G9数码相机拍摄的图像using a 40X objective, which were totally observed continuously for 72 h.

2.8。Transwell小室法

含有8无包衣或基质胶包被的transwell μ米的孔被用于测定（Costar公司，康宁，纽约州）。细胞接种到在无血清DMEM培养基上室。含有10个％FBS的DMEM培养基加入到下室。Cells were fixed in 100% methanol 20 h later and stained with 0.2% concentration of crystal violet for 15 min at room temperature. Cells remaining on the upper side of the filter were removed with a cotton swab. The filters were then mounted onto cover slips and images were taken at 40X magnification. From these images, the number of migratory or invasive cells was counted.

2.9。G418选择

G418，氨基糖苷类抗生素，是在分子遗传学检测筛查最常用antistable转染试剂。将细胞以2×10的密度接种⁵ cells/well in 24-well plates and grew overnight. The medium was replaced with complete medium without FBS. NET-1shRNA and control shRNA were transfected into MHCC97H cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. The medium was replaced with a fresh medium of bovine serum (150 mL/L) after 6 h transfection. One day later, the transfected cells were selected by G418 (400 μ克/毫升）（华美生物工程公司，北京，中国），直至阳性克隆后14天发现。将细胞培养，最后用G418（200所选 μ克/毫升）再14天。单克隆选择建立一个稳定转染的细胞系。

2.10。动物和建立肿瘤模型的

2.10.1。动物

裸鼠BALB / c小鼠，雌性，4-6周龄，体重1820 g, were obtained from Shanghai Slac Laboratory Animal (China) and housed under pathogen-free conditions according to the recommendations of NIH guidelines for care and use of laboratory. This study has been approved by the Animal Ethical Committee of Nantong University.

2.10.2。肿瘤模型

裸鼠在右前腋下皮下接种1×10⁷稳定转染的NET-1 MHCC97H细胞在200 μ微升PBS，并在左前腋下以相等的未经处理的细胞，如自动控制。最短的轴（）和最长轴线（）肿瘤的通过卡尺每天测量。肿瘤体积用下式计算：体积=。When the tumor volume reached 100 mm^3.至少，荷瘤裸鼠模型已经成功建立。

实验由12个裸鼠，其被随机分配到4个实验组的。四个实验组如下：未处理的细胞MHCC97H基，稳定转染的NET-1shRNA MHCC97H细胞组，索拉非尼治疗MHCC97H细胞组，和索拉非尼治疗稳定转染的NET-1shRNA MHCC97H细胞组。In sorafenib treatment group, the mice were given 100 mg/kg sorafenib in 100 μL请肿瘤植入后腹腔注射建立。所有对照小鼠腹腔注射接受的载体溶液等体积。

在第3周的治疗，所有经处理小鼠处死，切除肝并称重，用于病理检查的一部分，其它储存在-80℃下，用于检测胱天蛋白酶-3，胱天蛋白酶-8，胱天蛋白酶和9个基因通过实时RT-QPCR;的引物序列在表1。

2.11。统计分析

所有实验共进行3个重复，结果以平均值±标准误差表示。所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行分析以及。双尾<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1。NET-1在MHCC97H细胞中的表达

RT-QPCR和免疫印迹分析以确定与NET-1shRNA转染是否导致减少NET-1 mRNA和蛋白的表达的。与对照shRNA相比，有49％，而在用NET-1shRNA转染的细胞NET-1 mRNA和蛋白水平的减少51％，和NET-1的表达的无显著减少在用对照shRNA或未经处理的转染的细胞被发现组（图1)。

为了评估通过NET-1shRNA，索拉非尼，并且将它们的组合处理的MHCC97H细胞的增殖，是通过CCK-8测定获得的细胞的生长曲线。有增殖的中的所有处理的细胞一个显著减少，尤其是在组合NET-1shRNA用索拉非尼作为与未经处理的细胞相比（各)。然而，索拉非尼组和NET-1shRNA组的细胞增殖率没有显著差异(图)3.)。

3.2。MHCC97H细胞增殖的影响

MHCC97H cells in 96-well culture plates were exposed to different concentrations of sorafenib for 48 h. IC50 of sorafenib was calculated as 31 μM（图2)。

3.3。MHCC97H细胞凋亡

FCM法检测MHCC97H细胞凋亡。与模型组相比，在所有三个处理组凋亡率起来。有趣的是，组合NET-1shRNA用索拉非尼特别提出的凋亡率比任何索拉非尼或NET-1shRNA基（、职责)。但两组间无差异(图)4)。

3.4。MHCC97H细胞的运动

刮擦伤口和反式孔小室测定法以评价在索拉非尼的存在下，NET-1shRNA MHCC97H细胞的迁移，和它们两者。在这些条件下，临时缠绕（图5）和反式井室（图6)显示MHCC97H细胞与未处理细胞分别显示不同的迁移电位。有趣的是，NET-1shRNA组和索拉非尼组之间没有差异。细胞在倒置显微镜下观察。

3.5。单独使用NET-1shRNA或联合索拉非尼抑制肝癌模型生长

肿瘤被用来在小鼠肝模拟肿瘤生长。平均肿瘤大小介绍了这些四组统计学差异。在所有治疗组比在未处理组比较有较小的肿瘤大小（、职责)。值得注意的是，在抑制效果组合组优于各单组（、职责)。然而，NET-1shRNA组与索拉非尼组之间无统计学差异(表)2)。

为了进一步研究关于抑制肿瘤生长的作用机制，我们检测到胱天蛋白酶-3，胱天蛋白酶-8，并且从这些四组肿瘤组织的胱天蛋白酶-9的mRNA水平。实时RT-QPCR的结果在NET-1shRNA显示出胱天蛋白酶3，索拉非尼，和组合组显著增加，分别，当与未经处理的组（每一个比较)。因为胱天蛋白酶8 mRNA水平在NET-1shRNA和组合组显著增加，胱天蛋白酶9 mRNA水平显著在索拉非尼和组合组分别增加了，当与未处理组相比，（各)，联合组caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的增加量均高于单独组(职责。)(图7)。

4.讨论

在许多恶性肿瘤包括乳腺癌，宫颈癌，结肠癌，食道癌，肝癌，肺癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，胃肠道和皮肤[NET-1作为新的肿瘤相关基因的过表达10,14- - - - - -28]。最近的研究已经表明，NET-1参与多种诸如肿瘤发生，细胞周期控制，细胞凋亡，和迁移过程。Wollscheid等。[17发现NET-1基因表达与细胞增殖相关，可作为宫颈癌预后的标志。

RNAi技术是一种有效的方法，以沉默哺乳动物基因表达的基因功能的研究，并已用于基因治疗的可能性。合成的siRNA可以触发在哺乳动物细胞中的RNAi响应和诱导基因表达的特异性抑制。FDA批准已被授予了研究新药的许可，以测试抗HBV [使用表达的RNA序列29]，带来了对肝癌的RNAi治疗的承诺。在我们的实验中使用的特定的shRNA已被陈等人利用。并证实有效在以前的研究[10]。在本研究中，NET-1 mRNA和蛋白表达水平显著分别49％和51％，减少的，用NET-1shRNA。

NET-1被证明是与瘤细胞增殖相关[20]。我们的数据表明肿瘤细胞增殖的46.5％单药索拉非尼治疗后NET-1shRNA转染后的抑制，和50.6％之间。索拉非尼加NET-1shRNA联合治疗显著增强索拉非尼对HCC的抗增殖作用体外。另外，联合治疗也抑制了肿瘤体积的荷瘤裸鼠模型的更激烈的比单剂处理体内。NET-1属于鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）家族的成员，后者有助于从GDP到GTP小G蛋白相互转换，从而激活的Ras和Rho。因此，我们的研究结果暗示，NET-1可以通过激活的Ras信号转导通路，从而介导肿瘤细胞的增殖，分化和存活促进肿瘤的增殖和生长。索拉非尼联合的下调NET-1的通过RNAi抗肿瘤效果可以通过抑制几个相关途径实现对细胞生长的抑制具有协同效应。

NET-1具有30％的同一性与转移相关tetraspans（例如Co-029和TALLA-1）[2]。四次跨膜蛋白在信令，运动，迁移，和侵袭[调控牵连三十]。黄等人。呈MK诱导的NET-1途径有助于迁移人体头部和颈部鳞状细胞癌的细胞/侵袭性随后发现的RNA干扰沉默NET-1显着降低MMP-2，这表明NET-1的作用的MK诱导的表达（TSPAN1）作为各种信令组件之一[31]。我们的结果显示，转染NET-1shRNA后，MHCC97H细胞的迁移和浸润明显减少。与未处理组相比，sorafenib和NET-1shRNA联合治疗将sorafenib对肿瘤迁移/侵袭的抑制作用从57.71%提高到74.46%。与此同时，索拉非尼被列为血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂，通过降低微血管密度和循环VEGF水平阻断肿瘤血管生成。VEGF是最有效的血管生成因子之一。MMP2是一种与血管生成和转移性侵袭相关的标志物[32]。多项研究表明，HCC血管生成强度与血管侵犯、转移的风险及患者预后相关[33,34]。因此，这两种药物（索拉非尼和NET-1shRNA）在组合可以提高各单剂的效果。

索拉非尼最近被发现，诱导细胞凋亡的几个人类癌症线。虽然通过何种机制索拉非尼诱导的细胞凋亡尚未完全阐明，Yu等人。通过下调发现索拉非尼诱导的细胞凋亡的骨髓细胞白血病-1（MCL-1）[35]，将其推定为与细胞色素C的释放从线粒体到胞质溶胶中，胱天蛋白酶活化，和凋亡性细胞死亡相关联。体外细胞凋亡测定证明这一假设：索拉非尼治疗组的细胞凋亡率比未处理的细胞更高。此外，我们的研究结果表明，半胱天冬3和Caspase 9个mRNA水平索拉非尼治疗后显著改变。有趣的是，从结果来看，我们可以发现，蛋白酶3 mRNA水平显着提高，胱天蛋白酶8 mRNA的NET-1shRNA组，联合组增加。基因为首的NET-1shRNA的caspase 8的增加或许暗示，NET-1可能是由膜受体介导的死亡受体途径有关的细胞凋亡相关基因。此外，体外结果表明，通过RNAi降低NET-1也可诱导细胞凋亡。根据我们的演绎，很容易解释为什么caspase 3的mRNA水平在联合组大大增加。至于关系NET-1和caspase 8，我们还需要通过其他有效的方法来探索NET-1shRNA诱导细胞凋亡的机制。

总之，在这项研究中NET-1shRNA已明显抑制增殖，存活和迁移/ HCC的侵袭都体外和体内。NET-1shRNA表现抑制作用对肝癌和索拉非尼。此外，索拉非尼联合NET-1shRNA的组合显示出比单药治疗更好的抗肿瘤作用。这些发现将带来肝癌新疗法。

致谢

这项研究是由来自江苏省重点高校，卫生部，中国江苏省（编号H201052）部的基金会学术项目发展资金支持;南通市科学基金会，中国江苏省（第K2009060和S2010018）;南通大学高级项目计划。作者是与NET-1shRNA和技术指导的合成好心帮助我们感谢百奥迈科生物技术有限公司（江苏省南通市，中国）。

参考

1. 谁,全球疾病负担：2004年更新，世界卫生组织，日内瓦，瑞士，2008年，http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/2004_report_update/en/index.html。
2. V. Serru, P. Dessen, C. Boucheix, E. Rubinstein，“七种新四冠虫的序列和表达”，生物化学与生物物理学ACTA卷。1478年，没有。1，第159-163，2000。查看在：出版商网站|谷歌学术
3. C.克拉斯，S. Seiter，A.克拉斯，L. Savelyeva，M.施瓦布和M. ZOLLER，“CO-029的同源物的大鼠的关联，一个转移相关四次跨膜蛋白分子和消耗性凝血病，”细胞生物学杂志卷。141，没有。1，第267-280，1998。查看在：出版商网站|谷歌学术
4. J. Xu, J. A. Stolk, X. Zhang等，“应用减法和芯片技术鉴定人类前列腺癌差异表达基因”，癌症研究第60卷，no。2000年，第1677-1682页。查看在：谷歌学术
5. 李志强，李德春，朱媛媛，" NET-1基因在肝癌中的表达及意义"中国肿瘤临床与实验病理学杂志第19卷，no。2003年，第488-491页。查看在：谷歌学术
6. 在医学肿瘤学意大利语审判，“索拉非尼和输注5-氟尿嘧啶的中晚期肝细胞癌（HCC）二期研究[ClinicalTrials.gov标识符NCT00619541]，”健康，2008年美国国立卫生研究院，http://www.clinicaltrials.gov/。查看在：谷歌学术
7. “索拉非尼联合吉西他滨治疗晚期肝癌的疗效和安全性”，美国国立卫生研究院，2008年，http://www.clinicaltrials.gov/。查看在：谷歌学术
8. 香港大学，“索拉非尼与卡培他滨和奥沙利铂用于晚期或转移性肝癌（SECOX）[ClinicalTrials.gov标识符NCT00752063]，”健康，2008年美国国立卫生研究院，http://www.clinicaltrials.gov/。查看在：谷歌学术
9. Radboud大学，“索拉非尼和西罗莫司的I期研究[ClinicalTrials.gov标识符NCT00509613]，”健康，2008年美国国立卫生研究院，http://www.clinicaltrials.gov/。查看在：谷歌学术
10. 陈丽玲，王丽玲，李海华，秦，吴，" NET-1基因在皮肤鳞状细胞癌细胞系(A431)中的功能:siRNA研究"中华李冰冰杂志卷。38，没有。10，第691-696，2009。查看在：出版商网站|谷歌学术
11. L.陈，李X.，G.王，王Y.，Y.朱，和朱军，“TSPAN1，Ki67和CD34在胃癌中表达的临床病理意义，”的肿瘤卷。94，没有。4，第531-538，2008。查看在：谷歌学术
12. 王国良，陈丽玲，魏玉忠等，“NET-1对SMMC-7721肝癌细胞系增殖、迁移和内吞作用的影响”，肿瘤的报道第27卷第2期1944-1952, 2012页。查看在：出版商网站|谷歌学术
13. P. Lott, E. A. Amiott, J. Soto等，“患有米托富素2突变的Charcot-Marie-Tooth型2A患者成纤维细胞的线粒体融合和功能”实验神经学卷。211，没有。1，第115-127，2008。查看在：出版商网站|谷歌学术
14. M. C.阿巴，Y.胡，H。Sun等人，“雌激素受体的基因表达签名α在乳腺癌中的地位，”BMC基因组学卷。6，第37条，2005年。查看在：出版商网站|谷歌学术
15. T. Nishidate，T.片桐，M. Lin等人，“全基因组基因表达与激光微束显微切割纯化的乳腺癌细胞的轮廓：与进展和转移相关的基因的鉴定，”国际肿瘤学杂志卷。25，没有。4，第797-819，2004。查看在：谷歌学术
16. L.陈，Y Y.朱，张X.等人。“TSPAN1蛋白的表达：患者的大肠腺癌一个显著的预后指标，”世界胃肠病学杂志卷。15，没有。18，第2270至76年，2009年。查看在：出版商网站|谷歌学术
17. V. Wollscheid，R. KUHNE-HEID，I. Stein等人，“一种新的增殖相关蛋白NET-1 / C4.8高档的子集特征的鉴定宫颈上皮内瘤和宫颈癌，”国际癌症杂志卷。99，没有。6，第771-775，2002。查看在：出版商网站|谷歌学术
18. J.布拉本德，P.马郁兰，D.萨隆加等人，“Barrett食管和食道的巴雷特腺癌的分子诊断中的多基因表达面板，”癌基因第23卷，no。27，第4780-4788页，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术
19. L.陈，A. G.沉，G.王，卢体育和X.李，“NET-1基因和蛋白在肝癌及相关组织中的表达，”艾蛰嗯卷。25，没有。3，第320-325，2006年。查看在：谷歌学术
20. L.陈，王Z.，十战，D. C.李，Y Y.朱，和朱军，“以人肝癌NET-1基因表达的协会”国际中华外科病理学卷。15，没有。4，第346-353，2007。查看在：出版商网站|谷歌学术
21. A. C. Borczuk，L.的Gorenstein，K. L.沃尔特A. A.阿萨德，L. Wang和C. A.鲍威尔，“非小细胞肺癌的分子特征综述肺发育途径，”美国病理学杂志卷。163，没有。5，第1949年至1960年，2003。查看在：谷歌学术
22. N. I. Euer，S.考尔，H. Deissler，V. J. MOBUS，R. Zeillinger，和U. H. Weidle，“L1CAM，Jagged2的和神经介肽U作为卵巢癌相关抗原的鉴定，”肿瘤的报道卷。13，没有。3，第375-387，2005。查看在：谷歌学术
23. A. D.桑廷，F.詹，S. Bellone的等人，“在原发性卵巢浆液性乳头状瘤和正常卵巢上皮基因表达谱：用于卵巢癌的诊断和治疗的候选分子标记鉴定，”。国际癌症杂志卷。112，没有。1，第14-25，2004。查看在：出版商网站|谷歌学术
24. M. Buchholz, M. Braun, A. Heidenblut等，“胰腺上皮内肿瘤病变显微解剖的转录组分析”，癌基因第24卷第2期44，第6626-6636页，2005。查看在：出版商网站|谷歌学术
25. 。C. A. Iacobuzio - 多纳休，R.阿什法克，A迈特拉等人，“高表达的胰腺导管腺癌的基因：从三大技术获得的转录概况的一个全面特性和比较，”癌症研究第63卷，no。2003年，第8614-8622页。查看在：谷歌学术
26. C. A. Iacobuzio-Donahue, A. Maitra, M. Olsen等，“利用cDNA微阵列探索胰腺腺癌的整体基因表达模式，”美国病理学杂志卷。162，没有。4，第1151至1162年，2003。查看在：谷歌学术
27. B.柳，J.琼斯，N.J。刀片等人，“胰腺癌之间的关系和差异表达的基因研究了基因表达的大规模连续分析，”癌症研究卷。62，没有。3，第819-826，2002。查看在：谷歌学术
28. C. H.李，S. H.砰，李S.，K.宋和I.李，“基因表达谱揭示在原位胃管状腺瘤和癌的连续改变，”世界胃肠病学杂志卷。11，没有。13，第1937-1945，2005年。查看在：谷歌学术
29. P.阿布斯诺特和L. J.汤普森，“利用RNA干扰途径预先治疗和预防肝癌，”世界胃肠病学杂志卷。14，没有。11，第1670至1681年，2008年。查看在：出版商网站|谷歌学术
30. 四虫素蛋白介导细胞渗透、侵袭和融合事件，并定义了一种新型的膜微域。细胞与发育生物学年评，第19卷，第397-422页，2003年。查看在：出版商网站|谷歌学术
31. Midkine促进tetraspanin-integrin相互作用，诱导FAK-Stat1α向途径促进人体头部和颈部鳞状细胞癌细胞的迁移/侵袭，”生物化学和生物物理研究通讯卷。377，没有。2，第474-478，2008。查看在：出版商网站|谷歌学术
32. M. G. Tutton，M. L.乔治，S. A.埃克尔斯，S.伯顿，R. I.夫特，和A. M. Abulafi，“血浆MMP-2和MMP-9水平作为在结肠直肠癌患者的肿瘤中表达的替代的用途，”国际癌症杂志卷。107，没有。4，第541-550，2003。查看在：出版商网站|谷歌学术
33. R. T.潘，I. O.伍，C. Lau等人，。“肿瘤微血管密度为复发的切除肝细胞癌的后预测的前瞻性研究中，”临床肿瘤学杂志卷。20，没有。7，第1775-1785，2002年。查看在：出版商网站|谷歌学术
34. 姚德芳，吴新华，朱玉华等，“人肝癌中血管内皮生长因子、微血管密度及其临床病理特征的定量分析”，肝胆胰疾病国际，第4卷，第2期。第220-226页，2005年。查看在：谷歌学术
35. C.于，L.M。Bruzek，W. M. Xue等人，“Mcl-1的下调在多激酶抑制剂BAY 43-9006的促凋亡活性中的作用，”癌基因第24卷第2期46，第6861-6869，2005。查看在：出版商网站|谷歌学术

版权

版权所有:宋鹤等这是一篇开放获取下发布的文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。