GRP 胃肠病学研究和实践 1687 - 630 x 1687 - 6121 Hindawi出版公司 685150年 10.1155 / 2013/685150 685150年 研究文章 RNA干扰的研究针对NET-1结合索拉非尼对肝细胞癌的治疗 在体外和 在活的有机体内 他 首歌 1 魏 Ying-ze 1、2 王 Gui-lan 2 徐 共襄 2 周 家明 2 张 Yi-xin 1 陈 李 1、2 江 Chunping 1 病理学系 南通肿瘤医院 南通226361 中国 2 的病理解剖学 南通大学 南通226001 中国 ntu.edu.cn 2013年 7 11 2013年 2013年 18 07年 2013年 03 09年 2013年 12 09年 2013年 2013年 版权©2013首歌他et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

本研究的目的是探索的抑制性影响核糖核酸干扰(RNAi)针对NET-1或结合肝癌索拉非尼 在体外和 在活的有机体内和可能的潜在机制。NET-1 mRNA的表达和蛋白质被RT-QPCR和免疫印迹检测。扩散是由CCK-8试验的能力。细胞凋亡被流式细胞术(FCM)检测。迁移和入侵的能力是衡量scratch-wound化验和transwell试验。MHCC97H细胞稳定转染的NET-1shRNA注入皮下注射准备裸小鼠肝癌模型和Caspase-3 Caspase-8, Caspase-9 mrna不同组肿瘤组织的检查。NET-1信使rna和蛋白质在MHCC97H细胞转染与NET-1shRNA急剧减少。增殖和迁移的能力被抑制,细胞凋亡被提拔NET-1shRNA或索拉非尼与未经处理的细胞 在体外和 在活的有机体内( P < 0.05 )。caspase-8 caspase-3的mRNA水平,减少肿瘤组织caspase-9在不同治疗组与对照组相比,特别是在组合组。( P < 0.05 )。与索拉非尼联合NET-1shRNA大大增强索拉非尼抗肿瘤的影响,阻断ras可能涉及的信号通路和刺激同时凋亡通路。

 1。介绍

肝细胞癌(HCC)是全世界癌症死亡的第三大原因 1与某些地理区域),发展中国家肝癌的发病率在发达国家至少需要补充16至32倍。基因治疗,一个新的和有前途的治疗策略,已被用于许多癌症包括肝癌。SiRNA-targeted沉默的基因与肿瘤细胞增殖或转移有关,基因治疗的方法之一,显示了巨大的力量在肝癌治疗。新的EST tetraspanin-1,也称为NET-1 (C4.8, Tspan-1 P503S)的成员tetraspan总科(TM4SF) [ 2- - - - - - 4),似乎表达了大多数肝癌而不是在正常成人肝组织( 5]。这个有吸引力的肿瘤特异性表达的特点可以使NET-1作为肝癌的潜在的治疗目标。

索拉非尼,口服multikinase抑制剂经美国食品和药物管理局批准用于治疗晚期肾细胞癌(RCC)患者肝癌和耐火材料。最近几年, 在活的有机体内和 在体外研究表明,索拉非尼可以抑制肿瘤的生长,破坏肿瘤微脉管系统通过抗增殖、抗血管增生和/或proapoptotic效果。索拉非尼是一种治疗晚期肝癌的重要发展,是第一个系统性治疗延长生存在先进的肝癌。许多试验研究结合使用索拉非尼加化疗药物(如氟尿嘧啶[ 6),吉西他滨( 7),或卡培他滨+铂( 8])或索拉非尼+其他分子靶向治疗(例如,西罗莫司 9)目前正在进行中,是产生不错的效果。然而,研究基因治疗使用RNAi技术结合索拉非尼在HCC很少报道。因此在目前的研究中,我们使用NET-1shRNA结合索拉非尼治疗肝癌探索一种新的策略 在活的有机体内和 在体外。

 2。方法 2.1。细胞培养

人类肝癌细胞株MHCC97H肝癌研究所提供的是和善的,中山医院,上海。细胞培养与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM)(表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(的边后卫)(表达载体,卡尔斯巴德,CA)湿大气中含有5%的股份有限公司2在37°C。目前的实验分为四组包括未经处理的集团,索拉非尼组、NET-1shRNA组和组合NET-1shRNA索拉非尼组。

 2.2。质粒的转染

pSilencer4.1-CMVneo-NET-1shRNA (NET-1shRNA)和pSilencer4.1-CMVneo-control成分(控制shRNA)质粒被Biomics设计和合成生物技术有限公司有限公司(江苏南通,中国)。转染前的一天,在培养基培养细胞无血清和抗生素。轻轻混合和孵化20分钟后在室温下,转染混合物的成分和Lipofectamine 2000(表达载体)添加到文化板块。6小时后,转染混合取代DMEM补充10%的边后卫。细胞转染48 h后收获。

 2.3。实时RT-QPCR

总RNA分离PicoPure RNA隔离设备(大角星生物科学、山景、钙、美国)根据生产的指令。Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)放大作为内部控制( 10]。由总理引物PCR引物设计软件(表5.0 1)。引物(20 pmol / μL)被添加到反应缓冲区的总量25 μL与模板一起RNA 4 μ12.5 L,掌握混合 μ我0.5 L, SYBR绿色 μl . PCR进行下列条件:30秒94°C, 30秒62°C, 40秒在72°C 50°C周期。实时RT-QPCR SYBR绿色PCR主混合(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)进行使用筛选机(Bio-Rad实验室、大力神、CA)。荧光信号收集在扩展阶段,Ct值的示例计算,由2-ΔΔCt方法和NET-1转录水平进行了分析。

引物序列NET-1、半胱天冬酶3、半胱天冬酶和GAPDH半胱天冬酶9日。

底漆 序列 产品(bp)
NET-1-F′ 5′-GTGGCTTCACCAACTATACG-3′ 191年
NET-1-R′ 5′-GACTGCATTAGTTCGGATGT-3′
Caspase-3-F′ 5′-AGAACTGGACTGTGGCATTGAG-3′ 191年
Caspase-3-R′ 5′-GCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-3′
Caspase-8-F′ 5′-CATCCAGTCACTTTGCCAGA-3′ 128年
Caspase-8-R′ 5′-GCATCTGTTTCCCCATGTTT-3′
Caspase-9-F′ 5′-TTCCCAGGTTTTGTTTCCTG-3′ 143年
Caspase-9-R′ 5′-CCTTTCACCGAAACAGCATT-3′
GAPDH-F′ 5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3′ 240年
GAPDH-R′ 5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3′
2.4。免疫印迹分析

在转染后48 h MHCC97H细胞收获。细胞细胞溶解与缓冲区包含0.1 mol / L Tris-HCl (pH6.8), 4% SDS、20%甘油,BPB, 0.1%和5% β巯基乙醇。复杂的是在沸水中加热5分钟。蛋白质10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)为2 h 350毫安,后来浸泡2 h在屏蔽解决方案(Tris-buffered盐水含5%脱脂奶粉和0.01%卷/卷Tween-20),和孵化一小时在室温下存在Anti-NET-1兔多克隆抗体( 11, 12),或anti-GAPDH鼠单克隆抗体(σ,美国)作为内部控制,然后在4°C隔夜孵化。孵化后,细胞膜是洗3次,peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit或山羊anti-mouse二级抗体(ICN实验室、欧文、CA;稀释1:10000)被添加和孵化一个额外的一小时。反应是可视化的ECL化学发光检测系统(美国皮尔斯)透视片子(美国幸田来未)。的分子量NET-1和GAPDH 13分别76 kDa和37 kDa。使用图像J软件结果进行了分析。

 2.5。细胞计数Kit-8 CCK-8化验 2.5.1。IC50决心

索拉非尼从拜耳制药公司购买,在无菌DMSO溶液溶解,轻防护条件下储存冷冻−20°C。股票的解决方案的索拉非尼在DMEM培养基稀释,添加了平等的整除个别井,这样最终浓度为0,3、9,18岁,30岁,60岁,100 μm .确定50%抑制浓度(IC50)对索拉非尼的CCK-8 (Dojindo、熊本、日本)使用。MHCC97H细胞被播种在5.0×103细胞/在100 μL 96年DMEM -微型板块和孵化一夜之间在37°C在湿润的气氛中有5%的公司2。文化孵化后0 h, 24 h, 48 h,和72 h,我们交换了新鲜轻轻DMEM和10 μL CCK-8的解决方案是添加到每个好,盘子被孵化2 h在37°C。我们测量了吸光度在450 nm使用光学密度(标550;Bio-Rad,东京、日本)和计算索拉非尼的IC50浓度绘制线(图的交集 2)。索拉非尼的IC50用于生长、凋亡,scratch-wound, transwell化验。

 2.5.2。增长分析

5×103每组细胞被播种在96孔板和培养0,24日,48岁和72 h, 450纳米波长的光密度测量通过自动化板读者,然后绘制细胞生长曲线。

 2.6。流式细胞术(FCM)

细胞凋亡是决定使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测装备我(美国Clontech实验室Inc .)根据制造商的协议。细胞被播种在6-well板块2×10的密度5/毫升PBS和收获通过胰蛋白酶化然后洗冷,离心机在1000 rpm, resuspended在400年 μL 1×绑定缓冲,离心机,上层的删除。细胞被resuspended在200年 μL 1×绑定缓冲和转移到无菌FCM玻璃管。3 μL膜联蛋白V-FITC和3 μL propidium碘被添加,然后在室温下在黑暗中孵化。细胞被FCM分析(美国正欲FACSCalibur)在488海里。细胞的分布进行了分析使用CellQuest软件(becton dickinson)染色的FCM在1小时内。10000细胞收集的数据为每个数据文件。凋亡细胞被确定为膜联蛋白V-FITC-positive和P-negative细胞。

 2.7。Scratch-Wound化验

细胞被播种密度的5×105在24孔板中过夜。后的第二天,菜肴的表面轻微挠黄色P200吸管提示(费舍尔)和图像拍摄下卡尔蔡司Axiovert 25(美国纽约Thornwood)倒置显微镜使用大炮博秀G9数码相机使用40 x客观,完全连续观察72 h。

 2.8。Transwell化验

裸露的或Matrigel-coated transwells包含8 μm毛孔被用于化验(合演,康宁,纽约)。采用无血清细胞被播种到参议院DMEM媒体。DMEM媒体包含10%的边后卫是添加到众议院。细胞被固定在100%甲醇20 h后,沾0.2%浓度的结晶紫在室温下15分钟。剩余的细胞上的过滤用棉球被移除。过滤器被安装上盖卡瓦和图像拍摄40 x放大。从这些图片,迁徙或入侵细胞的数量统计。

 2.9。G418筛选

氨基糖苷类抗生素G418,是最常antistable转染试剂筛选的分子基因检测。细胞被播种密度的2×105细胞/在24-well盘子和一夜之间长大。中被完全取代中没有的边后卫。NET-1shRNA和控制成分被转染进MHCC97H细胞使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。中被替换为一个全新的媒介牛血清(150毫升/ L)后6 h转染。一天后,转染细胞被G418选择(400 μg / mL)(华美生物技术公司,北京),直到发现了阳性克隆后14天。细胞培养,最后选择了G418 (200 μg / mL)进一步14天。单一的克隆选择构建一个稳定转染细胞系。

 2.10。动物肿瘤模型的建立 2.10.1。动物

裸体BALB / c小鼠,女,4 - 6周大,重18 ~ 20克,来自上海Slac实验动物(中国)和安置在无菌条件下根据NIH指南保健的建议和使用实验室。这项研究已经得到南通大学动物伦理委员会的批准。

 2.10.2。肿瘤模型

裸小鼠接种在正确的前腋窝皮下注射1×107在200年稳定转染NET-1 MHCC97H细胞 μL PBS和左前腋窝等于未经处理的细胞,如自动控制。最短的轴( 一个 )和最长轴( b 每天)的肿瘤被卡尺测量。肿瘤体积计算公式:= 一个 2 × b × π / 6 。当肿瘤体积达到100毫米3至少,带有裸小鼠模型建立成功。

实验由12个裸体小鼠,随机分配到四个实验组,每组。四个实验小组如下:未经处理的MHCC97H细胞群,稳定转染NET-1shRNA MHCC97H细胞群,索拉非尼治疗MHCC97H细胞群,索拉非尼治疗稳定转染NET-1shRNA MHCC97H细胞组。索拉非尼治疗组的小鼠接受100毫克/公斤索拉非尼在100年 μL通过腹腔注射肿瘤植入后建立。所有控制老鼠收到同等体积的载体溶液腹腔注射。

3周的治疗,治疗的老鼠都牺牲了,肝脏切除和权衡,一部分用于病理检查和其他储存在检测Caspase-3−80°C, Caspase-8,并通过实时RT-QPCR Caspase-9信使rna;引物序列表 1。

 2.11。统计分析

所有的实验进行了一式三份,结果被表示为平均值±标准错误。所有数据借助SPSS13.0统计软件进行了分析与统计软件使用学生的 t 以及。双尾 P < 0.05的值被认为是具有统计学意义。

 3所示。结果 3.1。NET-1 MHCC97H细胞中表达

RT-QPCR和免疫印迹分析,以确定转染与NET-1shRNA导致减少NET-1 mRNA和蛋白的表达。与控制成分相比,有49%和51%减少NET-1 mRNA和蛋白水平与NET-1shRNA转染细胞,并没有发现显著减少NET-1表达与控制成分或未经处理的细胞转染组(图 1)。

NET-1shRNA NET-1 mRNA和蛋白表达的抑制肝癌细胞行MHCC97H细胞。(一)RT-QPCR显示NET-1shRNA导致NET-1 mRNA水平降低49%,与对照组相比。(b)免疫印迹显示NET-1蛋白质和GAPDH蛋白的强度在这些三组。(c)图像分析J NET-1shRNA导致NET-1蛋白质水平降低51%,与对照组相比(* * P < 0.0 1 )。

索拉非尼剂量相关细胞毒性72 h后暴光了。索拉非尼的IC50表示由绘制线的交点。索拉非尼是31 μM。

评估被NET-1shRNA MHCC97H细胞的增殖,索拉非尼,并结合,细胞生长曲线通过CCK-8试验获得的。有显著减少扩散在所有细胞治疗,特别是在组合NET-1shRNA与索拉非尼与未经处理的细胞(每个 P < 0.0 1 )。然而,在细胞增殖率没有显著差异索拉非尼和NET-1shRNA组织(图 3)。

生长曲线显示MHCC97H细胞的增殖,直到72年由CCK-8分析h。NET-1shRNA,索拉非尼和结合NET-1shRNA索拉非尼导致14.6%,19.3%,和33.3%在48小时减少细胞增殖,减少在46.5%,50.6%,和66.3%的细胞增殖在72 h。(● P < 0.0 5 与对照组相比。* P < 0.05 相比之下,结合集团)。

 3.2。MHCC97H细胞的增殖

MHCC97H细胞在96 -文化板块被暴露于不同浓度的索拉非尼48 h。索拉非尼的IC50计算为31日 μM(图 2)。

 3.3。MHCC97H细胞的凋亡

FCM用于检查MHCC97H细胞的凋亡。细胞凋亡率起来在所有三个治疗组与对照组相比。有趣的是,与索拉非尼联合NET-1shRNA尤其是先进的细胞凋亡率比索拉非尼或NET-1shRNA集团( P < 0.05 、职责)。但是没有区别这两个单一组(图 4)。

凋亡细胞百分比包括早期和晚期凋亡(AV + /π−πAV + / +)被FCM检测。NET-1shRNA的细胞凋亡率,索拉非尼,组合,和未治疗组24±0.72%,17.64±0.46%,51.34±1.25%,分别和6.3±0.03%。

 3.4。MHCC97H细胞的能动性

Scratch-wound和trans-well室进行了分析评估MHCC97H细胞的迁移在索拉非尼的存在,NET-1shRNA,他们两人。在这种情况下,Scratch-wound(图 5)和trans-well室(图 6显示MHCC97H细胞显示不同的迁移可能与未经处理的细胞相比,分别。有趣的是,没有NET-1shRNA组和索拉非尼组之间的差异。在倒置显微镜下观察细胞。

在不同时间点细胞相对迁移距离在不同的组。● P < 0.0 5 与对照组相比。* P < 0.05 相比之下,联合治疗组。

运动性抑制MHCC97H细胞的NET-1shRNA和索拉非尼。(a) Trans-well室显示渗透的MHCC97H细胞48 h后NET-1shRNA转染或索拉非尼治疗。(b) Trans-well室试验表明,渗透NET-1shRNA MHCC97H细胞,索拉非尼,并与索拉非尼联合NET-1shRNA和未经处理的细胞组分别为83.67±6.03、83.33±10.01、50.33±4.73、197.00±6.00,分别。(●代表 P < 0.0 5 与对照组相比。*代表 P < 0.05 相比之下,结合集团)。

 3.5。抑制肝癌模型增长NET-1shRNA单独或结合索拉非尼

肿瘤被用来模拟肝癌小鼠肿瘤的生长。平均肿瘤大小呈现统计上的差异这四个组。所有治疗组的血压有较小的肿瘤大小比治疗组( P < 0.05 、职责)。值得注意的是,联合治疗组的抑制效果优于各单一集团( P < 0.05 、职责)。但是,没有NET-1shRNA组和索拉非尼组之间有统计学差异(表 2)。

比较治疗肝癌发展单靠NET-1shRNA,结合索拉非尼。

组 MHCC97H (cm3)
NET-1shRNA 1.354±0.042●★
索拉非尼 1.201±0.152●★
结合 0.558±0.018●
未经处理的 3.459±0.121
空向量 3.279±0.084

每组的平均肿瘤大小为1.354±0.042厘米3,1.201±0.152厘米3,0.558±0.018厘米3,3.459±0.121厘米3分别(● P < 0.0 5 与对照组相比。★ P < 0.05 相比之下,结合集团)。

进一步调查对抑制肿瘤生长的机制,我们检测到的mRNA水平caspase-3, caspase-8, caspase-9肿瘤组织的这四个组。实时RT-QPCR的结果显示,NET-1shRNA半胱天冬酶3,索拉非尼,和组合组明显增加,分别与对照组相比(每个 P < 0.05 )。因为半胱天冬酶8 mRNA水平显著增加NET-1shRNA和组合组、半胱天冬酶9 mRNA水平显著增加在索拉非尼和组合组,分别与对照组相比(每个 P < 0.05 ),以便增加caspase-3的表情,Caspase-8, Caspase-9 mRNA结合组高于每个组( P < 0.05 职责。)(图 7)。

信使rna表达水平的半胱天冬酶3,半胱天冬酶8日和半胱天冬酶9 NET-1shRNA的肿瘤组织,索拉非尼,组合,治疗组。RT-QPCR NET-1shRNA表明,索拉非尼,结合组织细胞凋亡蛋白酶3 mRNA水平增加了2.99,1.89,和4.18倍,半胱天冬酶8 mRNA水平增加了2.14,1.31和2.47倍,和半胱天冬酶9 mRNA水平增加了1.15,1.91,和1.99倍,分别与对照组相比,。(● P < 0.0 5 与对照组相比,* P < 0.05 相比之下,结合集团)。

 4所示。讨论

NET-1小说作为一个肿瘤相关基因过度表达在许多恶性肿瘤包括乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、食道癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、胃肠道和皮肤( 10, 14- - - - - - 28]。最近的研究表明,NET-1参与多种肿瘤形成等过程,细胞周期控制、凋亡、迁移。Wollscheid et al。 17]发现NET-1基因表达与细胞增殖,可以用作宫颈癌预后的标志。

RNAi技术是一种强大的方法来沉默哺乳动物基因表达的研究基因功能和基因治疗的可能性。小干扰rna可以触发RNAi合成反应在哺乳动物细胞和诱导特定基因表达的抑制作用。为一个试验性新药获得FDA的批准许可测试使用表达了对乙肝病毒的RNA序列( 29日),RNAi治疗肝细胞癌的承诺。具体成分用于我们的实验已经被陈等人,在以前的研究证实有效( 10]。在目前的研究中,NET-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低49%和51%,分别使用NET-1shRNA。

NET-1被证明是与肿瘤细胞增殖( 20.]。我们的数据表明肿瘤细胞增殖的抑制单药索拉非尼治疗后46.5%,和50.6% NET-1shRNA转染后,分别。与索拉非尼联合治疗+ NET-1shRNA显著增强抗增殖索拉非尼对肝癌的影响 在体外。此外,还结合治疗肿瘤裸鼠模型的抑制肿瘤体积比处理一个单一的代理更果断的行动 在活的有机体内。NET-1属于鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的成员的家庭,后者帮助小G蛋白相互过渡从GDP到三磷酸鸟苷,从而激活Ras和ρ。因此我们的研究结果暗示NET-1可能促进肿瘤增殖和生长通过Ras激活信号转导通路,介导肿瘤细胞增殖,分化和生存。索拉非尼的抗肿瘤效果RNAi NET-1差别以及对这些可能实现协同效应的抑制细胞生长的抑制几个相关的通路。

NET-1 30%身份与转移相关tetraspans(例如,co - 029和Talla-1) ( 2]。Tetraspanins涉及调节信号,能动性,迁移和侵袭性 30.]。黄等人显示MK-induced NET-1途径导致迁移/人体头颈部鳞状细胞癌细胞的侵蚀,然后发现RNAi MMP-2 NET-1显著减少MK-induced表达的沉默,这证明NET-1的角色(TSPAN1)各种信号组件之一 31日]。我们的研究结果显示,迁移和浸润的NET-1shRNA MHCC97H细胞转染后被大大降低了。与索拉非尼联合治疗NET-1shRNA放大索拉非尼对肿瘤的抑制作用迁移和侵袭性从57.71%提高到74.46%,比未经处理的。与此同时,索拉非尼被归类为血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂,哪些块肿瘤血管生成减少微血管密度与VEGF水平。VEGF是最强有力的血管生成的因素之一。MMP2标记与血管生成和转移相关入侵( 32]。几项研究表明,在肝癌血管生成的强度与血管侵犯的风险转移和患者预后[ 33, 34]。因此,这两个代理(索拉非尼和NET-1shRNA)结合可能促进每个单代理的影响。

索拉非尼最近发现诱导细胞凋亡在几个人类癌症。尽管索拉非尼诱导细胞凋亡的机制尚未完全阐明,玉等人发现索拉非尼诱导细胞凋亡的表达下调骨髓细胞leukemia-1 (mcl1) [ 35),这被认为是与从线粒体细胞色素c的释放到胞质,半胱天冬酶激活,凋亡细胞死亡。 在体外细胞凋亡分析证明这一假设:索拉非尼治疗组的凋亡率高于未经处理的细胞。此外,我们的研究结果显示,半胱天冬酶3和半胱天冬酶9 mRNA水平索拉非尼治疗后显著改变。有趣的是,从研究结果,我们可以发现半胱天冬酶3 mRNA水平急剧增加和半胱天冬酶8 mRNA增加NET-1shRNA和组合组。半胱天冬酶的增加8信使rna由NET-1shRNA也许暗示NET-1可能是一个细胞凋亡相关基因与死亡受体通路介导的膜受体。此外, 在体外结果表明,减少NET-1 RNAi也可以诱导细胞凋亡。在我们的演绎之下,很容易解释为什么半胱天冬酶3组结合mRNA水平大大增加。至于NET-1和半胱天冬酶8之间的关系,我们仍然需要探索NET-1shRNA诱导细胞凋亡的机制通过其他有效的方法。

综上所述,在本研究中NET-1shRNA明显抑制增殖、存活和迁移/肝癌的侵袭性 在体外和 在活的有机体内。NET-1shRNA对肝癌的抑制作用表现以及索拉非尼。此外,索拉非尼的组合+ NET-1shRNA显示比单药治疗更好的抗肿瘤效应。这些发现将带来一个新的治疗肝细胞癌。

 确认

这项研究受到了重点学科资助项目江苏高等教育机构的发展,卫生部的基础,江苏,中国(没有。H201052);江苏南通城市的科学基金会、中国(K2009060号和S2010018);南通大学的和先进的项目计划。作者感谢Biomics生物技术有限公司有限公司(江苏南通,中国),请帮助我们NET-1shRNA的合成和技术指导。

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