营养利用率改变自噬对舒林酸硫诱导的结肠癌细胞凋亡的影响

摘要

自噬是细胞降解细胞内物质以补充自身的分解代谢过程。在各种细胞应激刺激下诱导自噬可通过凋亡和/或自噬(非凋亡)途径导致细胞存活或死亡。非甾体抗炎药舒林酸硫化物诱导结肠癌细胞凋亡。在本研究中，我们发现在血清缺失条件下抑制自噬可显著减少硫代舒林酸诱导的HT-29结肠癌细胞凋亡。相反，在血清可用的条件下抑制自噬可显著增加硫代舒林酸诱导的HT-29细胞凋亡。我们之前的研究表明，凋亡抑制剂survivin在调控非甾体抗炎药诱导的凋亡和自噬细胞死亡中发挥作用。在这里，我们表明，在血清缺失的条件下，自噬抑制剂的存在会增加survivin蛋白的半衰期，但在血清可用的条件下则不会。因此，survivin水平的升高可能是在血清缺失条件下抑制舒林酸诱导的细胞凋亡的一个因素。这些结果表明，细胞是否因自噬诱导而存活或死亡取决于调节自噬和凋亡过程的因子的平衡。

1.介绍

自噬是一种进化上保守的过程，它将受损/不需要的细胞物质，如细胞器、蛋白质聚集物和大分子，分解成氨基酸，供细胞循环利用以满足其代谢和生存需要[1，2]．它在所有细胞中都是活跃的，并可被许多细胞应激诱导，包括营养剥夺和氧化应激。自噬是由双膜空泡和自噬体的形成开始的，自噬体隔离细胞质物质，随后与溶酶体融合降解其内容物。自噬小体的形成需要atg4切割微管相关蛋白轻链3b (LC3b)形成胞质LC3b- i [3.]．LC3b-I通过atg7和atg3酶与脂质部分结合，生成LC3b-II，在Atg12-Apg 5-Atg16蛋白复合物的帮助下进入自噬体膜[4，5]．总的来说，整个复合体还负责液泡的伸长和曲率，以产生成熟的自噬小体[6，7]．western blotting检测LC3b-II是一种常用且被广泛接受的自噬诱导检测方法。已知通过自噬过程降解的蛋白的降解，如p62，被用来监测自噬通量[8]．在本研究中，这些检测方法被用来监测自噬及其抑制。

虽然自噬的促生存功能是众所周知和明确的，但最近的研究表明，自噬诱导也可能触发凋亡无关的细胞死亡，或“自噬细胞死亡”。目前尚不清楚自噬何时何地是促生存的，何时何地是促死亡的[9，10]．自噬也被报道影响细胞对凋亡的易感性。自噬和细胞凋亡之间的联系尚不清楚，目前是一个深入研究的领域。许多研究表明，自噬可以通过抑制凋亡来确保细胞存活(例如，在[11，12])。然而，最近的一些研究表明，自噬有时会导致并与凋亡相关(例如，[13，14])。

Sulindac硫化物是非甾体抗炎药(NSAID)，具有促凋亡、抗癌和抗炎活性。硫代舒林酸可诱导胃肠道癌细胞凋亡。结肠癌HT-29细胞的自噬抑制被报道使这些细胞对硫代舒林酸诱导的凋亡敏感[15]．相反，我们最近对胃癌AGS细胞的研究表明，抑制自噬与抑制sulindac硫化物下调survivin导致凋亡增加有关[16]．自噬在一种情况下是促进细胞凋亡的，而在另一种情况下是抗细胞凋亡的，其机理和原因尚不清楚。在这里，我们研究了自噬对不同情况下HT-29细胞对舒林酸硫的凋亡反应的影响:在血清剥夺和正常血清条件下。我们还研究了survivin在这些条件下凋亡中的作用。

2.材料和方法

2．1．细胞培养与处理

HT-29在McCoy 's 5A修饰培养基(ATCC, Manassas, VA, USA)中培养，培养基中添加10%胎牛血清(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA, USA)和1%抗生素(青霉素G、双霉素B和链霉素;Mediatech Cellgro, Hernodon, VA, USA)。对于所有的试验，细胞处理0.3 mM舒林酸硫化物。这种高浓度的舒林酸硫化物被利用是因为结肠黏膜细胞通常暴露于高浓度的非甾体抗炎药。因此，这个浓度更能代表生理价值。

2．2．核转染

使用了一种商业可用的3种靶向sirna池，设计用于沉默人类Atg7 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)。使用RNAiMax转染试剂(Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)将10 nM的sirna转染到HT-29细胞中，转染浓度为70%。只使用转染试剂而不使用任何siRNA的模拟转染，以及转染10 nM的商业可用短RNA (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)而不沉默哺乳动物mrna作为对照。将非沉默对照RNA偶联到绿色荧光染料上，用荧光显微镜监测转染效率。计数每500个总细胞中荧光细胞的百分比，以确定转染效率。在转染24小时后:(1)进行自噬抑制实验，细胞分别在含血清和无血清培养基中孵育，孵育时间如图所示。在这些时间收集细胞裂解液进行LC3的western blot分析βII和β肌动蛋白水平，p62和β肌动蛋白水平存在100μg / mL放线菌酮(CHX)10毫米3-MA;(2)细胞凋亡检测:细胞在无血清培养基中培养过夜，然后用0.3 mM舒林酸硫醚处理过夜，在含5%胎牛血清的培养基中过夜，然后用0.3 mM舒林酸硫醚处理过夜，然后用0.3 mM舒林酸硫醚处理过夜。细胞凋亡的测定方法如下:(3) survivin半衰期测定:细胞在无血清培养基和含5%胎牛血清培养基中孵育过夜，按如下方法处理;(4) survivin mRNA表达检测，细胞在无血清培养基和含5%胎牛血清的培养基中培养，培养时间如下所示，总RNA和实时定量PCR如下所示。

2．3.细胞凋亡检测

将等量的HT-29细胞接种在6孔培养板的每孔中，并放置过夜。然后细胞在含5%胎牛血清和不含血清的培养基中孵育过夜。载体(DMSO)和sulindac硫化物被添加到培养基中，持续时间如图所示。通过比较含有相同数量HT-29细胞的样品中caspase-3的活化程度来确定细胞凋亡。采用比色CaspACE测定系统(Promega, Madison, WI, USA)，按照制造商的说明测量caspase-3活性。annexin V结合试剂盒(Abcam Inc.， Cambridge, MA, USA)也被用于检测凋亡诱导，遵循制造商的说明。通过计数500个细胞中荧光标记(膜联蛋白V结合)细胞的百分比来确定细胞凋亡%。

２.４.Western Blot分析和蛋白信号定量

如前所述制备细胞裂解液[17]．150年μ用12% SDS-PAGE分离，转移到硝基纤维素膜上。用脱脂乳阻断细胞膜，用兔多克隆抗lc3孵育β兔多克隆抗p62抗体和兔多克隆抗atg7抗体(均为Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)在4°C过夜。的anti-LC3β在这些检测中使用的抗体可以识别LC3β我和LC3β二世形式。该抗体用于确认LC3β我出现在样本中，那个LC3βII型转化仅在诱导自噬的条件下观察到。然后用过氧化物酶结合的山羊抗兔二抗(Sigma, St. Louis, MO, USA)洗涤膜并孵育1小时。相同的膜被剥夺了Re-blot温和的解决方案(美国微孔,泰梅库拉,CA)根据制造商的指示,然后用鼠标单克隆抗体anti-beta-actin孵化1小时,洗,1小时孵化与过氧化物酶共轭goat-anti-mouse二级抗体(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。利用密度测量软件测量蛋白质信号，并归一化至-肌动蛋白水平，如前所述[17]．所有蛋白信号数据均经三次重复实验取平均值。

2．5．RNA分离、逆转录和实时定量PCR分析

使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen Biosciences, Valencia, CA, USA)，按照制造商的说明从HT-29细胞中分离总RNA。0.3μ使用25个单位的MuLV逆转录酶(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)对每个样本的RNA进行逆转录。5μ在随后的qPCR反应中使用逆转录(RT)混合物的L。QPCR采用M. W. Pfaffl for Real-time RT-PCR方法[18]．该方法考虑了放大效率的影响，公式如下:

Target为survivin PCR产物，以beta-actin为参照，所有survivin PCR产物均归一化。指以标准稀释曲线斜率为基础的放大效率。使用IQ SYBR Green Supermix (Biorad, Hercules, CA,USA)和survivin PCR引物对iCycler (Biorad, Hercules, CA,USA)进行实时PCR分析[18]．PCR反应条件为:95℃预孵育10分钟(1X);95°C变性1分钟，51°C再退火30秒，72°C延伸30秒(40X)。在退火阶段采集荧光发射数据。为了计算统计学意义，所有样本进行了3个重复。

2．6．蛋白质和mRNA稳定性测定

以上描述了p62蛋白在siRNA转染细胞中的稳定性。为了确定p62蛋白在3-MA存在下的降解情况，将未转染的HT-29细胞置于含5%胎牛血清的培养基中，以及含10 mM 3-MA的无血清培养基中孵育30分钟。100μg/mL CHX的添加时间如图所示，在此期间提取蛋白进行western blot和蛋白定量分析p62和β肌动蛋白水平的每个样品。

测定HT-29细胞中survivin蛋白半衰期，100μg/mL CHX，在许多出版物中常用来抑制各种培养细胞中的蛋白质合成，也被选择用于本研究。用这种浓度的CHX处理细胞，持续时间如图所示。为了研究3-MA对survivin半衰期的影响，细胞在无血清培养基和含5%胎牛血清的培养基中培养过夜，用10 mM 3-MA预处理30分钟，然后在指定的时间内加入CHX。对照组为对照药+ CHX。为了研究Atg7沉默对survivin蛋白半衰期的影响，转染Atg7 siRNA后24小时，细胞在无血清培养基和含5%胎牛血清的培养基中培养过夜，然后与CHX孵育相同时间。转染对照RNA的细胞作为对照。研究蛋白酶体抑制剂对survivin半衰期的影响μM MG-132单独，和10毫米3-MA + 10μ用MG-132治疗30分钟，然后用CHX治疗。然后分离蛋白提取物进行western blot分析和蛋白定量，如前所述。

为了检测3-MA对survivin mRNA稳定性的影响，将细胞在无血清培养基和含5%胎牛血清培养基中培养过夜，用10 mM 3-MA预处理30分钟，然后用1μ添加M放线菌素D (actD)阻断mRNA转录0、1、3、6、12小时。对照纳入Vehicle + actD治疗。为了研究Atg7沉默对survivin mRNA稳定性的影响，转染Atg7 siRNA后24小时，细胞在无血清培养基和含5%胎牛血清的培养基中培养过夜，然后用actD孵育相同时间。转染对照RNA的细胞作为对照。在此期间，利用上述基因特异性引物，通过实时定量PCR检测总RNA和survivin mRNA的稳定性。

2.7。统计分析

所有数据进行统计分析，重复3个重复。学生的两组数据比较采用-检验。采用单因素方差分析和Bonferroni校正来比较三组或三组以上的数据。值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

3．1.血清剥夺增强Sulindac硫化物诱导HT-29细胞凋亡的作用

比较了在含5%胎牛血清培养基中培养的HT-29细胞和在不含血清培养基中培养的HT-29细胞中舒林酸硫醚诱导凋亡的程度。在含胎牛血清的培养基中，在整个研究期间(长达96小时)，载体处理并没有增加HT-29细胞的基础数量的凋亡(图)1）.从治疗24小时开始，Sulindac硫化物治疗逐渐增加了细胞凋亡，到治疗96小时时，大约增加了12倍(图)1）.在不含血清的培养基中，在整个研究期间，载体治疗导致少量的细胞凋亡(图)1）.Sulindac硫化物处理逐渐增加细胞凋亡，从治疗约12小时开始，到治疗48小时时增加约30倍(图)1）.为了支持这些数据，annexin V结合分析显示sulindac硫化物诱导1.50.12%的细胞凋亡，11.6在含血清培养基处理96小时后，细胞凋亡率为2.1%，但诱导细胞凋亡率为1.60.21%凋亡细胞，43.5无血清培养基处理48小时后，细胞凋亡率为3.7%。因此，血清剥夺显著增强HT-29细胞对舒林酸诱导的凋亡的敏感性。

3．2．在无血清培养基中抑制自噬降低了Sulindac硫化物诱导的细胞凋亡，但在含血清培养基中促进了Sulindac硫化物诱导的细胞凋亡

为了检验自噬是否是影响在硫代舒林酸存在下HT-29细胞凋亡能力的一个因素，首先在无血清培养基和含血清培养基中检测了自噬诱导。在含血清的培养基中，HT-29细胞发生了基本量的自噬，这可以通过胞质液泡的存在来说明(图)2(一个)）.添加3-MA和转染Atg7 siRNA降低了含血清培养基中自噬的基础量。在无血清培养基中，HT-29细胞的自噬增加，可见大量胞质空泡的存在(图)2(一个))， LC3的大量截断β我形成(双线的顶部带，图2 (b)) LC3β二(双线的底部带，图2 (b))， p62蛋白随时间的显著降解(图2 (c)）.在无血清培养基中加入3-MA可抑制LC3βII转化和p62蛋白降解(图2 (b)和2 (c)、职责)。转染对照RNA并没有降低HT-27细胞中Atg7的表达(图)2 (b))，且未抑制自噬诱导(图2 (b)和2 (c)）.相比之下，转染Atg7 siRNA可降低HT-29细胞中Atg7的表达(图)2 (b))和抑制自噬诱导(图2 (b)和2 (c)）.

接下来，研究了在无血清培养基和含血清培养基中抑制自噬对硫舒林酸诱导凋亡的影响。在无血清培养基中，3-MA处理和Atg7 siRNA转染在有sulindac硫化物存在的情况下显著降低caspase-3的激活(图)3.顶图)。相比之下，在含血清的培养基中，3-MA处理和Atg7 siRNA转染在有sulindac硫化物存在的情况下，与只有sulindac硫化物相比，caspase-3的激活显著增加(图)3.,底部图)。综上所述，这些结果表明，抑制自噬可以增强或减少硫代舒林酸诱导的细胞凋亡，这取决于癌细胞周围营养物质的可用性。

3．3.Sulindac Sulindac硫诱导的凋亡程度与Survivin稳定性的大小相对应，这是在营养缺乏条件下自噬抑制改变的

我们之前的研究表明，凋亡抑制剂survivin的下调是nsaid诱导癌细胞凋亡的关键因素，而sulindac硫化物下调survivin mRNA的表达[17]．因为硫代舒林酸诱导的细胞凋亡在无血清培养基中比在含血清培养基中增强(图)1)，在无血清培养液和含血清培养液中检测硫舒林酸对survivin mRNA的下调程度。结果显示，不管培养基中血清含量如何，sulindac硫化物均以相同的速率下调survivin mRNA的表达(图)4）.因此，舒林酸硫诱导的凋亡程度并不是因为在无血清培养基和含血清培养基中，舒林酸硫对survivin mRNA表达的调节存在任何差异。

检查是否存活素是一个因素影响的能力以HT-29细胞凋亡抑制自噬时,存活素mRNA表达和稳定,半衰期和蛋白质在血清检查血清中自由媒体和媒体在没有和自噬抑制剂的存在。在无血清或含血清培养基中，3-MA和Atg7 siRNA不改变survivin mRNA的表达或稳定性。相反，survivin蛋白的半衰期受血清含量和自噬抑制剂的影响:在环己亚胺(CHX)存在下，survivin蛋白的半衰期在无血清培养基中约为1.5小时，在含血清培养基中约为2小时(图)5）.添加3- ma延长了survivin蛋白在无血清培养基中的半衰期至约3小时，但没有改变survivin蛋白在含血清培养基中的半衰期(图)5）.在无血清培养基中，Atg7 siRNA也将survivin蛋白半衰期延长到大约2.5小时，而在含血清培养基中则不能(图)5）.

我们之前发现survivin蛋白在吲哚美辛等非甾体抗炎药存在时通过泛素蛋白酶体降解[17]．因此，我们检测了蛋白酶体抑制剂MG-132对survivin蛋白半衰期的影响，无论自噬抑制剂是否存在。结果显示，MG-132单独将survivin蛋白半衰期延长至约2小时，在无血清培养基中延长至约3小时(图)6）.在无血清培养基中，3-MA与MG-132联合可将survivin蛋白半衰期延长至4小时以上(图)6)，但在含血清培养基中不增加存活蛋白半衰期超过3小时。因此，无论培养基中血清含量如何，survivin蛋白都可通过蛋白酶体降解。然而，在无血清培养基中，survivin蛋白降解的调节似乎更为复杂。

4.讨论

我们选择HT-29结肠癌细胞作为这些研究的模型，因为(1)我们和其他人表明sulindac硫化物诱导这些细胞凋亡[15，19]．(2)自噬影响硫舒林酸诱导这些细胞凋亡的能力[15]．(3)血清剥夺诱导自噬[20.，我们的研究结果证实，在无血清培养基中HT-29细胞的自噬显著增加。因此，HT-29细胞是在不同血清条件下检测自噬对舒林酸诱导的细胞凋亡影响的合适模型。

目前，对自噬的普遍看法是，它是促生存的，因为它可以保护细胞免受长期饥饿和其他压力，以及旨在杀死癌细胞的抗癌药物的治疗。许多已发表的研究表明，从这种生存机制中释放癌细胞，通常通过抑制剂抑制自噬，可以触发细胞凋亡，增强其对抗癌药物的敏感性。这在胃肠道间质瘤中表现出来[21]、胰腺腺癌[19和淋巴瘤[22),等等。一些出版物也认为自噬可以促进细胞死亡，并且自噬本身是细胞死亡的一种形式(在[9，23])。我们的结果表明，自噬可以支持HT-29结肠癌细胞的前生存或前死亡结果，这取决于它们同时接受的应激刺激和它们的物理环境。与有血清且自噬最小的条件相比，在血清缺失的条件下，Sulindac硫化物诱导HT-29细胞的凋亡显著增加，自噬显著增加。对这些结果的一种解释是，在这些细胞中，自噬并不是硫代舒林酸诱导的凋亡的影响因素，而是由血清剥夺引起的其他因素。进一步的研究表明，自噬与硫代舒林酸诱导的细胞凋亡之间存在明显的联系，因为通过3-MA和Atg7 siRNA处理抑制自噬导致在血清缺失的条件下舒林酸硫诱导凋亡的能力降低，而在有血清的条件下舒林酸硫诱导凋亡的能力增强。

自噬与其他类型的细胞死亡(如凋亡和坏死)之间的联系尚不清楚，目前仍是一个研究热点。我们的研究表明，自噬通过共同的分子因子影响细胞凋亡，这些因子可以调节这两个过程。这些结果表明，在一定条件下，3-MA和Atg7 siRNA抑制自噬对凋亡抑制因子survivin的半衰期有显著影响。我们之前确定非甾体抗炎药对survivin水平的调节是结肠癌细胞诱导凋亡的关键因素[24]．Survivin也调节自噬[25，26]．在目前的研究中，survivin蛋白的稳定性解释了HT-29细胞在不同条件下对舒林酸诱导的凋亡敏感性的差异。血清剥夺使survivin半衰期从约2小时降低到约1.5小时，这有助于硫代舒林酸在无血清培养基中诱导凋亡的可能性大于含血清培养基。在无血清培养基中抑制自噬可使survivin半衰期从约1.5小时增加到约3小时，这有助于抵抗舒林酸硫代诱导的细胞凋亡。在含血清的培养基中，抑制自噬并不影响survivin的半衰期。这可能允许在硫代酸存在时诱导细胞凋亡，硫代酸可下调survivin mRNA水平[17，27]．图中显示了自噬抑制如何影响survivin和sulindac硫代化合物诱导的细胞凋亡的模型7．

自噬影响survivin半衰期的机制尚不清楚，需要进一步研究。之前，我们发现survivin蛋白在NSAIDs存在时被泛素蛋白酶体降解[17]．在这里，我们发现蛋白酶体抑制剂MG-132延缓了survivin蛋白的降解，而与MG-132联合使用的3-MA在无血清培养基中进一步延缓了survivin蛋白的降解。这些结果可能意味着survivin蛋白通过蛋白酶体和自噬的结合被降解，或者当自噬被抑制时，survivin与另一种蛋白的物理相互作用阻止了survivin在无血清培养基中的蛋白酶体降解。据报道survivin与Beclin 1发生物理作用[25]，而由Beclin 1调控的分子网络同时调控自噬和凋亡[26]．survivin蛋白的稳定性是否受到自噬相关蛋白(如Beclin 1和/或其他尚待鉴定的蛋白)的直接物理关联的影响，尚待确定。

5.结论

目前的研究结果表明，在HT-29结肠癌细胞中，血清剥夺对自噬的刺激增强了对舒林酸硫代诱导的凋亡的敏感性，而在血清可用的条件下，基础自噬抑制了舒林酸硫代诱导的凋亡。这表明，自噬可以支持细胞的促生存或促死亡结果，这取决于它们所接受的应激刺激和它们的物理环境。自噬诱导对survivin半衰期有显著影响，不同条件下HT-29细胞对舒林酸诱导的凋亡的敏感性与survivin半衰期降低有关。这表明，调控自噬和凋亡过程的因子，如survivin的修饰，可以决定癌细胞对凋亡刺激的易感性。

承认

这项工作是由退伍军人管理局绩效评估奖和SCIRE给s - k的小额拨款资助的。邱。

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