培养法和PCR的检测幽门螺杆菌在伊拉克巴士拉省饮用水

文摘

幽门螺杆菌世界卫生组织认可的是消化性溃疡的主要原因,慢性胃炎、胃癌,尽管人类感染的来源不清楚。一个问题在理解人类污染的来源是很难孤立生物体从环境中。然而,结合PCR结果与471年培养饮用水样品可以提供更准确的图片幽门螺旋杆菌检测。78年该方法假定幽门螺旋杆菌殖民地266的自来水样本获得的初步检测修改哥伦比亚琼脂(MCUA)偏依靠脲酶积极性率为29.3%。然而,只有11人被证实通过革兰氏染色法和生化测试减少利率至4.13%而只有3(1.46%)从205年反渗透(RO)水样。此外,只有6(54.5%)的11个隔离从自来水和1(33.3%)的3 RO隔离被16 srrna PCR证实。因此PCR确认率下降到2.2%。此外,只有100(4%)的自来水样本为阴性幽门螺旋杆菌文化方法幽门螺旋杆菌积极通过16 srrna。巴士拉省的水样收集来自24个地区2009年2 - 12月间。的直接经济复苏幽门螺旋杆菌从饮用水是惊人的和科学的激动人心的流行病学的调查。

1。介绍

幽门螺杆菌被公认为胃炎和消化性溃疡的主要原因和胃mucosa-associated淋巴组织(麦芽)胃淋巴瘤(1]。的机制幽门螺旋杆菌致病性的影响还不清楚,但被认为是细菌与宿主相互作用相关的由毒力基因,它是可能的,这些影响是增强细菌的侵袭性(2- - - - - -5]。幽门螺旋杆菌改变从正常的螺旋状杆菌形成球菌样的形式暴露在水或其他不利条件(6]。因此一直在尝试开发人工媒体实现传统文化复苏的结果比那些来自哥伦比亚血琼脂(7,8]。聚合酶链反应(PCR)方法也被用来检测幽门螺旋杆菌作为其16 srrna明确分化的基因序列分析幽门螺杆菌属密切相关弯曲杆菌属和其他幽门螺杆菌物种(9]。的存在幽门螺旋杆菌饮用水中由PCR检测到几个国家的报道(10- - - - - -12]。赫加蒂et al。13还演示了呼吸的存在幽门螺旋杆菌从我们地表水。的流行疾病归因于H。幽门在伊拉克不可用,尽管其共性。

巴士拉城位于巴士拉省,有大约三数百万人口;其供水主要来源于三个来源,阿拉伯河,底格里斯河,Bada湖。水从这些来源是在22日处理工作,通过管网约13000公里。

自1980年代以来一直在伊拉克一般水质明显恶化,反映国家的环境退化造成的连续的武装冲突。

本研究的目的是隔离幽门螺旋杆菌在伊拉克巴士拉,从饮用水,在哥伦比亚尿素改性琼脂(MCUA)和惠普媒体使用mdc方法(7),然后由常规生化检测和确认16 srrna PCR。

2。方法

2.1。样本收集和培养

266的自来水样本和205样本油轮提供反渗透(RO)收集24区覆盖超过90%的巴士拉省期间从2008年2月到2009年12月。500毫升水样品中每个收集氯浓度使用无菌玻璃烧瓶和检查o甲苯胺。样本1 - 2小时内转移。0.22实验室和过滤μ微孔过滤膜。每个膜然后沉浸到2毫升的大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB) 1 h。后,每个2毫升TSB被放置在较低的部分斜MCUA管。每个管倾斜几次允许添加的肉汤的上部偏上传播细菌。斜MCUA管,孵化microaerophically 37°C 1 - 2天,之后颜色变化从固相的橙色,粉色,表明脲酶活性。由此产生的系统是一个简单的monophasic-diphasic文化设置(mdc)、双相的固体液体环境的下部试管和一个单相固体上面7]。从底部和上部的部分斜MCUA管亚文化是MCUA和惠普媒体净化的盘子。

没有控制用于隔离的菌株也在PCR在伊拉克为我们遥不可及。

2.2。幽门螺旋杆菌的主要诊断

疑似纯化殖民地是根据革兰氏染色法和文化特征。

2.3。生化试验

生化测试包括生产过氧化氢酶、氧化酶、脲酶和H₂年代,硝酸盐减少,增长在3.5%氯化钠,甘氨酸和1%的速度增长,在不同的温度下生长。

2.4。抗生素敏感性试验

Piddock的方法(14)是用于测试的敏感性14的隔离幽门螺旋杆菌从饮用水7种抗生素卡那霉素30μg,红霉素15μ10 g,四环素30毫克,氨苄青霉素μ5 g,利福平μ30 g,阿莫西林μ30 g和庆大霉素μg (Bioanalyse、土耳其)。

2.5。16 srrna标识隔离

所有隔离从自来水和RO水生化测试样品给了积极的结果幽门螺旋杆菌和(100)样品幽门螺旋杆菌消极的文化方法进一步证实了使用专门设计的引物的识别幽门螺旋杆菌基于16 srrna序列(15]。的引物500个基点的产物16 srrna序列由正向引物序列:5 GCT亚美大陆煤层气有限公司AGA柠檬酸GCC答GTC C3和反向一:5 TGG CAA柠檬酸GCG柠檬酸GGT AAT G3。

2.6。制备细菌基因组DNA

基因组DNA从每个隔离后由涡暂停殖民地的铂环量1毫升phosphated-buffer盐水(PBS) 7.6,离心法,享年14000岁g为2分钟,煮1毫升蒸馏水的小球1分钟(16]。样本然后在12000离心机g 4分钟在4°C和上层清液储存在无菌瓶−70°C,直到他们被用作PCR模板。从水中基因组DNA样本,已培养但没有给隔离幽门螺旋杆菌,被离心法制备1毫升的液体部分偏MCUA管为14000g为2分钟,洗1毫升的PBS完成同样的步骤幽门螺旋杆菌隔离。浓度和纯度测定spectrophotometrically OD_260年和OD_280年分别排除任何可能的污染,和0.8%琼脂糖凝胶电泳。

2.7。PCR扩增16 srrna幽门螺旋杆菌

在25日进行了放大μ12.5 L的反应混合物μL掌握混合,0.5μL底漆,0.5μL反向引物5μ6.5 L DNA样本,μL蒸馏水和25μL矿物油。16 srrna PCR条件包括:变性步骤5分钟在95°C,紧随其后的是39周期为1分钟在94°C,退火55°C 1分钟和扩展为2分钟72°C,和一个额外的扩展步骤7分钟的72°C。PCR产品在2%琼脂糖电泳。

2.8。幽门螺旋杆菌尿素基因,PCR扩增

所有隔离由16 srrna确认已经测试的尿素基因的存在幽门螺旋杆菌。尿素序列的引物对411年英国石油公司产品所代表的正向引物序列:5 GCC AAT GGT AAA GCC TTA GTT3和反向一:5 CTC CTT AAT TGT TTT TAC 3 (17]。在25日进行了放大μ12.5 L的反应混合物μL掌握混合,0.5μL底漆,0.5μL反向引物5μ6.5 L DNA样本,μL蒸馏水和25μL矿物油。对尿素基因PCR条件包括:变性步骤在95°C 5分钟,其次是35周期为1分钟在94°C,退火在45°C。1分钟,在72°C扩展1分钟和一个额外的扩展步骤7分钟的72°C。PCR产品在2%琼脂糖电泳。

3所示。结果

3.1。文化的结果

的471个水样,14(2.76%)的隔离幽门螺旋杆菌被孤立的从14个样本地区培养法和被生化测试。它们包括11 (4.13%)幽门螺旋杆菌被孤立和诊断从266年的自来水样本和3人(1.46%)从205年RO样本。

修改后的哥伦比亚尿素琼脂使用mdc方法初步揭示的存在幽门螺旋杆菌水样,与变化的颜色偏MCUA管从橙粉色发生在同一时间从而使额外的存在的证据幽门螺旋杆菌在样品(图1)。

惠普介质隔离率在接种是14/471(2.76%)的隔离幽门螺旋杆菌,在MCUA中是6/471(1.2%)隔离包括14个隔离的幽门螺旋杆菌。

MCUA介质,孤立的殖民地幽门螺旋杆菌小到中等大小,圆形的,奶油的颜色,同时,在惠普的介质中,孤立幽门螺旋杆菌是规模较小,圆形,透明。MCUA和惠普媒体显示改变颜色从黄色/橙色,红色。

所有幽门螺旋杆菌分离株革兰氏阴性螺旋coccobacilli和共享特征过氧化氢酶,脲酶和氧化酶生产,但略有不同(表对其他测试1)。集体3隔离正在积极在硝酸盐还原,2能够增长42°C,和9底片在这两个特征。

3.2。抗生素敏感性

为幽门螺旋杆菌隔离从饮用水、四环素被发现最有效的抗生素,71%的测试隔离是对四环素敏感后跟卡那霉素和庆大霉素36% 57%,氨苄青霉素14%。利福平,阿莫西林被证明是最有效的(7%)幽门螺旋杆菌从饮用水孤立,而红霉素是一个非有效的抗生素,如(图所示2)和参考解释图表区大小的。

3.3。PCR结果

11中只有6名(54.5%)幽门螺旋杆菌形态学和生化鉴定分离自来水被发现港口16 srrna基因和3 R。O隔离只有一个(33.3%)隔离了16 srrna基因PCR阳性结果。因此离开了传统认为隔离是假阳性的50%。从the100阴性样品幽门螺旋杆菌通过培养,只有4 (4%)、16 srrna给了积极的结果。

PCR产品16 srrna引物给乐队基于琼脂糖凝胶对应500碱基对的产品相比,分子的阶梯,从而确定隔离幽门螺旋杆菌如(图所示3)。

3.4。幽门螺旋杆菌尿素基因,PCR扩增

所有的隔离幽门螺旋杆菌已证实了16 srrna,没有给出具体结果尿素(图4),只有取得了100个基点的产品也更大。

4所示。讨论

自然栖息地的幽门螺旋杆菌是在人类胃,其他的来源吗幽门螺旋杆菌和它的传播方式是未知的18]。在这项研究中,幽门螺旋杆菌从饮用水文化孤立和诊断方法和生化和PCR测试。第一个迹象的存在幽门螺旋杆菌水来自AL-Sulami et al。810隔离标识为)幽门螺旋杆菌通过生化测试。发现已经被研究证实使用相同的方法和传统的结合和PCR测试确定恢复幽门螺旋杆菌。

低复苏的病原体并不奇怪考虑各种因素影响其生存在水里。主,隔离有78 urease-positive隔离从266年获得自来水样品和43 urease-positive的RO水样本。人数减少到11和3隔离,分别让他们常规测试后离开67年和40的假阳性。Urease-negative隔离并没有考虑。其他细菌主要是假单胞菌。

到目前为止没有发表论文证明的可行性球菌样的形式或球菌样的形式转换的可能性螺旋杆菌形式。我们的研究结果表明,一些幽门螺旋杆菌仍然是可行的,表现为螺旋杆菌革兰氏染色涂片后殖民地MCUA;其他人没有,只可以通过PCR检测。

基于的假设幽门螺旋杆菌在饮用水球菌样的(6),结果含蓄地表明一些球菌样的形式的变换的可能性螺旋杆菌形式。

很难比较与出版我们的数据,因为每个作者使用不同的方法来检测细菌,和所有试图文化有机体直接从水样(18,19一直不成功。这可能是由于这一事实被其他微生物过度生长在富媒体导致的困难隔离幽门螺旋杆菌从水,缺乏经济复苏的另一个原因幽门螺旋杆菌从环境的挑剔的性质幽门螺旋杆菌一个多态性现象。在这种情况下,有机体不会被传统文化恢复技术;因此在我们的研究中,我们开发了一个不同的协议来培养幽门螺旋杆菌从水。这种方法的重要性是提供一个成功的文化方法的可能性幽门螺旋杆菌。

一般来说,高配置文件的测试对这些隔离的抗生素是明显的幽门螺旋杆菌抗四环素的29%的隔离,也卡那霉素幽门螺旋杆菌43%的阻力小于Al-Sulami et al。8)60%的结果。阿莫西林代表活跃这种细菌的抗生素治疗无效的阻力的93%的隔离。

4.1。16个srrna幽门螺旋菌PCR的检测

在这项研究中,这是第一个使用16 srrna放大和确认报告幽门螺旋杆菌从环境样品分离在伊拉克。16 srrna被选作检测幽门螺旋杆菌因为它表现出高度的功能和进化所有细菌内同源性(9]。只有7个隔离,14形态学和生化鉴定幽门螺旋杆菌经16 srrna作为16 srrna他们给了积极的结果。假阳性分离株的流行通过常规测试表明特异性的方法。与此同时,100年饮用水样品没有幽门螺旋杆菌被培养法检测4 16 srrna样品产生积极的结果。这意味着细胞幽门螺旋杆菌没有检测到文化可以通过PCR方法,因此,MDCS提供的机会同时检测可栽培的和nonculturable形式。

16 srrna基因的PCR产物扩增结果显示500个碱基对的序列的基因编码16 srrna分子,这结果同意的15]。PCR产物的大小决定通过比较它与DNA阶梯,它包含已知大小的DNA片段(1500 - 100)碱基对。我们的结果可能揭示证据支持额外的水传播,源自这样一个事实:有一个直接的复苏幽门螺旋杆菌从自来水和R。与此同时PCR证实了阿水。

4.2。幽门螺旋杆菌尿素基因PCR的检测

尿素的基因型是预计将出现在所有幽门螺杆菌积极的压力。然而,我们的研究是无法检测尿素基因的分离幽门螺旋杆菌已经证实了16 srrna。这个结果同意Tiveljung et al。20.)使用尿素基因,无法检测幽门螺旋杆菌应变视为正常的控制。

结论

的隔离幽门螺旋杆菌从饮用水、自来水和R。啊,通过培养法和顺向生化试验和PCR鉴定代表一个明确信号这种危险的存在,但虚幻的病原体在我们可消耗的水。,当然,会影响我们寻找一个更好的流行病学的理解和控制措施。

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