动脉粥样硬化的衰减载脂蛋白E基因敲除小鼠通过基于网络的药理机制的预测田七皂苷

抽象

这项研究调查了田七皂苷（PNS）减少载脂蛋白E基因敲除（ApoE KO）小鼠动脉粥样硬化病变的形成，并阐明了网络药理学方法的潜在机制。ApoE KO小鼠动脉粥样硬化（AS）的药效学研究表明，PNS具有明显的抗AS作用。然后，我们用网络药理学方法探讨了其抗AS作用的可能机制。从TCMSP公共数据库和SymMap中收集了PNS的主要化学成分及其靶点。用v11.0建立PNS的蛋白质相互作用。利用STRING分析基因本体（GO）功能和KEGG途径，探讨PNS抗AS作用的可能机制。结果表明，DSLHG调控的27个潜在靶点与AS有关，包括ACTA2、AKT1、BCL2和BDNF。从机制上讲，PNS的抗AS作用是通过干扰多种信号途径发挥的，如AGE-RAGE信号途径、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号途径等。网络分析表明，PNS可通过影响多靶点和多途径产生抗AS作用，为阐明PNS抗AS机制提供了新的依据。

1.简介

动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种多年形成的多因素疾病，在许多疾病的后期临床症状变得明显。炎症(1个]和脂质代谢失代偿[2个与AS的发病机制有关。人口研究结果显示，采用中医药可预防心血管疾病[三–5个]。田七皂苷(PNS)是一种重要的化学成分，主要来源于豆科植物的根田七,我国几千年来一直作为补血止血药使用。

到目前为止，在PNS中至少鉴定出27种皂苷，以及人参皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rd(结构见图)1个)是主要的有效成分，亦是心血管疾病研究的课题[6个]。已有研究表明，PNS可通过降低氧化应激和抑制炎症级联而减轻心肌缺血损伤[7个]. 另一项研究表明，三七总皂甙能减轻氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）对人脐血管内皮细胞（HUVECs）的损伤[八]。载脂蛋白E是脂蛋白在LDLR基因家族的摄取通过许多受体的重要配体，和ApoE引线的缺乏胆固醇酯富集颗粒的积累[9个]. ApoE KO小鼠在含脂肪的饮食中出现严重动脉粥样硬化，很快成为动脉粥样硬化研究的有力工具[10个]。考虑到PNS的生物利用度在活的有机体内，我们研究了PNS是否阻止或减少ApoE-KO小鼠动脉粥样硬化病变的形成，研究了PNS发挥抗as作用的机制，并建立了相关靶点之间的相互作用网络。并对其潜在机制进行GO功能分析和相关通路富集分析。

2.方法

2.1。药物和抗体

PNS购自昆明制药公司(KPC) Pharmaceuticals, Inc. (Item)。不。SKQ2017001;中国云南省昆明市)。三七皂苷R1(百分比:9.8%;PubChem CID: 441934)，人参皂苷Rb1(百分比:32.1%;PubChem CID: 9898279)、人参皂苷Rg1(比例:30.8%;PubChem CID: 441923)、人参皂苷Re(百分比:4.3%;PubChem CID: 441921)和ginsenoside Rd(百分比:8.3%;PubChem CID: 11679800)是主要的有效成分(图1个). 这些主要成分的总浓度为85.3%（辅料）。辛伐他汀（Zocor；20毫克/粒）购自默克制药有限公司（中国浙江省杭州市）。山羊抗兔IgG H&L（项目。编号ab6721）从Abcam（美国马萨诸塞州剑桥）购买。使用的次级抗体是通用的两步免疫组化试剂盒（项目）的一部分。没有，PV。6000；ZSGB Biological Technology；OriGene Technologies，Inc.，美国马里兰州洛克维尔）。DAB工具包也从ZSGB Biological Technology购买。小鼠IL-1β酶联免疫试剂盒(项目。不。EM001-48)购自ExCell(中国上海)。小鼠基质金属蛋白酶MMP-9, ELISA试剂盒。不。和小鼠组织金属蛋白酶抑制剂-1，和TIMP-1 ELISA试剂盒(项目)。不。MU30070)购自BiosWamp(北京，中国)。油红O溶液购自Sigma Chemical(美国密苏里州圣路易斯)。

2.2。动物分组与治疗

本研究经中国医学科学院中国美院（中国，北京）西苑医院的动物护理和使用委员会。A total of 15 male apolipoprotein E knockout (ApoE-KO) mice and 3 male wild-type mice (strain: C57BL/6J; weight: 22 ± 2.5 g; age: 8 weeks) were purchased from Changzhou Cavens Bioscience Co., Ltd. (Changzhou, Jiangsu, China). The mice were housed in humidity-controlled rooms (60 ± 10%) at 24 ± 1°C with a 12 h light/dark cycle. After a 7-day adaptation period, fifteen ApoE-KO mice were fed with an atherogenic high-fat diet (HFD; normal diet supplemented with 0.5% cholesterol, 10% yolk powder, and 5% pork lard) for 12 weeks. After that, these animals were randomized to receive simvastatin (20 mg/kg/d,n个 = 5), PNS (60 mg/kg/d (according to the literature [11个]和初步实验结果)，n个 = 5), or no drug (n个= 5) 8周。小白鼠接受HFD直到研究结束。以C57BL/6J雄性小鼠作为对照组(n个= 3)和正常饮食。饮食和水都是随意提供的。制备的pn数量如前所述[德意志北方银行]。在实验结束时，动物禁食过夜和牺牲。血液样品通过除去眼球收集，并得到从主动脉瓣膜组织样品。

2.3条。组织病理学分析

部分主动脉根部在10%福尔马林缓冲液中室温固定48小时，石蜡包埋，切片3小时μ米厚的部分。切片进行苏木精-伊红(H&E)染色和油红O染色。组织学图像记录与奥林巴斯(CX31)显微镜。使用Image Pro Plus(4.5版)进行定量形态测量分析，以确定斑块面积和内膜-中膜厚度(IMT)。

2.4。血清脂质测定及酶联免疫吸附试验(ELISA)

血液样本在室温下放置30 min，然后在1000 g下在4°C下离心10 min，然后在-70°C下储存以备日后生化分析。使用Roche Cobas 800全自动生化分析仪（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国）采集血液，测定总胆固醇（TC）、三酰甘油酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平。白细胞介素-1β（IL-1）水平β)、基质金属蛋白酶9 (MMP-9)和组织抑制金属蛋白酶-1 (TIMP-1)根据制造商的协议，使用市售的试剂盒进行测定。

2.5。网络药理学分析

主要化学成分及其PNS的目标是从中国传统医学系统药理学数据库（TCMSP）和分析平台（获得http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)和SymMap (http://www.symmap.org/)。的蛋白 - 蛋白相互作用网络数据库（STRING V11.0，https://string-db.org/)建立PNS的蛋白-蛋白相互作用并生成可视化图。然后，利用字符串资源分析了32个常见目标的基因本体(GO)功能和KEGG通路。

2.6。统计分析

采用SPSS 20.0版(SPSS Inc.， Chicago)进行统计分析。

采用单因素方差分析和事后Bonferroni检验比较处理。数据以均数±标准差表示被认为是统计学上的显著差异。

3.结果

3.1条。动物实验

3.1.1。PNS对动脉粥样硬化病变的影响

如图所示2个用H&E和油红O染色评价动脉粥样硬化的变化。与模型组（未治疗组）相比，PNS和辛伐他汀治疗改善了ApoE KO小鼠的动脉粥样硬化病变。未治疗组斑块面积和IMT较对照组明显增加( ,数字三). PNS组和辛伐他汀组斑块面积和IMT较未治疗组明显减少( ,数字三)。这些结果表明，PNS抑制斑块面积，IMT，并且在动脉粥样硬化病变的脂质沉积。

3.1.2条。三七总皂苷对血脂的影响

如图所示4个与对照组相比，未治疗组的TC、TG和LDL-C水平显著升高( )。与未治疗组相比，PNS组和辛伐他汀组的TC、TG和LDL-C水平显著降低（均 )。此外，与对照组相比，未治疗组的HDL-C水平显著降低( ;数字4个)。与未治疗组相比，PNS和辛伐他汀显著增加HDL-C水平(两者均有) )。辛伐他汀与PNS无显著差异。这些结果表明，PNS改善了hfc诱导的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平的变化。

3.1.3条。三七总皂甙对MMP-9、TIMP-1和IL-1水平的影响β

斑块纤维帽因子MMP-9和TIMP-1在斑块破裂和糜烂的各个阶段起着关键作用[13个]. 如图所示5个、MMP-9、TIMP-1和IL-1β与对照组相比，未治疗组的水平显著升高( )。与未处理组相比，PNS组和辛伐他汀组的MMP-9、TIMP-1和IL-1水平明显降低β（全部 )。辛伐他汀与PNS无显著差异。提示PNS具有抗炎作用，调节斑块纤维帽因子。

3.2。网络药理学结果

3.2.1之上。复合-目标-疾病和PPI网络建设

如图所示6个，通过对网络的分析，筛选出人参皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、人参皂苷Re、人参皂苷Rg2等6个成分，共涉及54个药物靶点。该化合物-靶标-疾病网络由54种活性药物和517种疾病靶标组成。然后，将27个与活性成分和AS相关的靶基因导入到字符串数据库中，用于构建PPI网络(图1)7个)。

3.2.2条。基因本体论与京都基因与基因组百科全书信号通路分析

对27个靶点进行基因本体论(GO)分析。PNS预测关键目标的GO分析结果如图所示八，其中列出了价值和增加目标富集。结果表明，这些靶点主要与细胞因子受体结合、细胞因子活性、蛋白酶结合等生理机制有关。为了确定相关的信号通路，我们使用KEGG pathway进行pathway enrichment analysis。126条KEGG信号通路显著富集( )。前十名的路径都比较低数值和增加的基因富集列于图中9个包括年龄愤怒信号通路，流体剪切应力和动脉粥样硬化，以及TNF信号通路。结果表明，PNS具有多种抗AS的途径和机制。

4。讨论

我们的研究表明，PNS在ApoE KO小鼠中能显著减弱病变的形成，降低血脂，抑制炎症因子。总之，PNS可抑制动脉粥样硬化的发展。在此基础上，运用网络药理学方法探讨其抗AS作用的可能机制。

辛伐他汀是一种降血脂剂，用于治疗高胆固醇血症和降低心脏病风险。研究[14个,15个]报道辛伐他汀主要通过抑制小鼠胆固醇合成来抑制AS。在本研究中，HFD可促进ApoE KO小鼠主动脉的斑块形成、IMT和脂质含量。PNS治疗与辛伐他汀相似，可减轻动脉粥样硬化病变，其表现为动脉粥样硬化斑块面积和IMT显著减少。一个多世纪以来，许多研究证实了高脂血症与[16个,17岁]。高水平的TC、TG和LDL-C被认为有助于动脉粥样化特性的发展[18岁]。目前的研究表明，AS可以通过降低TC，TG得到明显缓解，LDL-C水平[19个,20个]。此外，增加主要的HDL蛋白的表达可能介导了对AS的保护。21岁,22个]。因此，TC、TG、LDL-C低水平和HDL高水平均可改善AS。以前的研究已经报道过PNS通过调节脂质来预防AS [23个]. 本研究的结果与先前的研究一致，表明PNS可以减少斑块的形成和脂质的调节。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类依赖于锌的细胞内肽酶，它可分解细胞外基质(ECM)的所有结构成分，并活化细胞因子，从而进行组织重构[24个]。临床研究表明，血清MMP-9水平可能是斑块破裂导致急性冠脉综合征的早期标志物[25个]。AS中涉及炎症和纤维化的病理性斑块破裂过程可由MMP-9和TIMP-1调控[26个]。本研究通过PNS调控MMP-9和TIMP-1的表达，揭示斑块对其产物的脆弱性。在过去的二十年中，越来越多的证据揭示了AS这一慢性炎症性疾病的主要发病机制[27个]，是炎症[28个,29个]。细胞因子在参与动脉粥样硬化斑块形成的所有步骤的复杂炎症反应中具有关键作用[30个]。il - 1β一种促动脉粥样硬化细胞因子，促进巨噬细胞的迁移，影响几乎所有参与动脉粥样硬化的细胞[31个]. 实验研究表明，致动脉粥样硬化细胞因子敲除小鼠显示动脉粥样硬化发生减少[32个,33个]。本研究发现，PNS可降低IL-1的表达β提示PNS在AS中具有抗炎作用。

通过对PNS复合靶通路网络的分析，发现PNS的主要成分可以作用于多种通路。血管内皮细胞受到流体剪切应力的作用，从而调节血管的病理生理。低流量区、各种血流紊乱指标、血流方向与动脉粥样硬化的相关性最好[34个]。

我们发现PNS可以调节流体剪切应力，动脉粥样硬化通路与这些结果一致。为活血汤在动脉粥样硬化治疗中的临床应用奠定基础，为中医临床研究提供策略和方法。

5.结论

PNS可减轻动脉粥样硬化病变。网络药理学预测的信号通路为今后验证PNS抗as作用的关键机制提供了思路。因此，本研究增强了PNS在动脉粥样硬化疾病中的治疗潜力。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章和补充信息文件中。

利益冲突

没有要申报的利益冲突。

作者的贡献

Fu CG和Gao ZY构思并设计了该研究。Long LZ, Yu ZK, Qu H, Wang N, Guo M, Zhou XZ, Fu CG, and Gao ZY进行了实验。龙丽珠、余志克、瞿赫等人撰写了这篇论文，并对这篇论文做出了同样的贡献。实验工作在Pullo生物技术公司的实验室完成。

致谢

国家自然科学基金项目青年基金(81603483、81303150)和中国中医科学院苗圃计划(no. 81603483、81303150)资助的课题。xyky - mp - 2013 - 31)。

补充材料

补充1：色谱分析证书。(补充材料)

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