萃取物的馏分Pluchea odorata将指示细胞可塑性诱导的性质与抑制肿瘤表型的性质分离

摘要

介绍．一些研究表明，抗炎药物具有良好的抗肿瘤特性。的提取Pluchea odorata(菊科)，用于伤口愈合和抗炎症条件，进行了分离，并分离了与抗肿瘤和伤口愈合作用相关的特性。方法．使用硅胶、Sephadex色谱柱和不同的溶剂体系，多达6个分馏步骤，洗脱馏分通过薄层色谱、凋亡和增殖分析。用免疫印迹法研究了调节细胞迁移的癌基因和蛋白的表达情况。结果．序列分离增强了抗肿瘤活性，抑制了JunB、c-Jun、c-Myc和Stat3的癌基因表达。此外，可以从抑制迁移标志物MYPT、ROCK1和paxillin的另一个组分(F4.3.7)中分离出一个组分(F4.6.3)，该组分可诱导或维持迁移标志物MYPT、ROCK1和paxillin的表达。结论．伤口愈合形成疤痕或特定组织，因此，促进细胞迁移的化合物支持这一过程。相反，成功的抗肿瘤治疗可以对抗肿瘤进展，因此，抑制细胞迁移是必须的。

1.介绍

药物发现是生物医学研究和临床进展的持续需要。特别是生物多样性巨大的地区，如中美洲的热带雨林，在发现新的药物先导化合物方面非常有希望。因此，我们选择了一种民族医学的方法来发现药物，并专注于玛雅人的传统疗法，预先选择对健康有效果的植物。

传统的药用植物经常使用数百年[1，这就是为什么对人体没有或只有很小的毒性作用的原因。特别是在非洲和中南美洲，巫医、巫医或草药医生建议使用传统药物，他们通常将使用这种治疗植物作为秘密[2］．尽管这些植物已经被使用了很长时间，但我们对其“活性原理”和/或靶向细胞机制知之甚少，因此，这些疗法在药物开发方面有很大的潜力。我们的目标是分离和分离玛雅治愈植物的独特属性Pluchea odorata与抗癌治疗有关。p . odorata美国、墨西哥、伯利兹、危地马拉、巴拿马、开曼群岛、瓜德罗普、牙买加、波多黎各、圣卢西亚、委内瑞拉和厄瓜多尔(美国农业部种质资源信息网，2004年11月9日，http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?104497)，玛雅人仍然用它来治疗普通感冒、发烧、流感、感冒、头痛、高血压、神经痛、眼炎、麻痹、肺炎、蛇咬、肿胀、炎症和皮肤擦伤[3.］．这种药液的制备方法是将两把叶子放在一加仑水中煮沸，然后经常涂抹在患处，直到炎症消退[4］．此外，这种植物被描述为解毒剂，收敛，发汗，和止血[5，以及传统上由母亲在产后使用，以减少感染风险和组织恢复的传播[3.］．Gridling等．［6和Bauer等．［7]描述了二氯甲烷提取物在HL60和MCF-7细胞中的强抗肿瘤作用和在HUVECs(人脐静脉内皮细胞)中的抗炎反应。

药物是在标准化条件下制备的，通常只含有一种有效成分。相比之下，民族药物学疗法是大量化合物的混合物，这些化合物在许多情况下是未知的，它们的组成和活性取决于生长区域和收集时间。这使得它们难以应用和交易。此外，植物提取物也可能含有具有系统毒性的化合物或抵消活性成分的预期效果。另一方面，植物提取物中的一些不同化合物可以协同作用。本文将举例说明这一现象。一个常见的终止原因先天的成功的治疗各种癌症和其他疾病的方法是获得耐药性。然而，到目前为止，还没有报道复杂的植物混合物在患者中诱导治疗耐药性，最有可能是因为几个不同的积极原则针对不同的细胞内和细胞间信号通路，从而防止有机体发展“逃逸机制”。因此，开发复合提取物应被视为一种治疗癌症的策略。这些混合物的标准化程序必须单独制定，以提供有效和安全的治疗方法，并且不会出现批次之间的差异。分馏和陪同测试在生物分析和适当的分析是一个可行的概念标准化和补救措施等新兴沿着程序可以通过国家机构(即Avemar,我们2004014406 (A1):“使用发酵小麦胚芽提取物抗炎剂”Hidvegi和Resetar)。

在这里，我们描述了二氯甲烷萃取物的分馏方法p . odorata，通过生物分析和可标准化的分析，不断对其活性进行控制。这导致了分数引起明显的细胞反应，指示伤口愈合或抗肿瘤特性。

2.材料和方法

2．1．植物材料

植物的地上部分(叶、茎、花)Pluchea odorata(l)卡斯。在危地马拉的Departamento Petén，靠近Lago Petén Itzá的西北海岸，San José，在从San José到La Nueva San José公路以北1公里的一个有4年历史的次生植被区域内(16°N, 89°W).凭证标本(腿。G. Krupitza & R. O. Frisch, no . 1-2009, 08。04.通过Björn Feistel (Finzelberg GmbH & Co. kg, Andernach, Germany)用二氯甲烷提取6公斤风干的植物材料，并将提取液保存在4°C的干燥器中，直至使用。

2．2.植物萃取与分馏

用二氯甲烷提取植物基本上如前所述[6，7］．用二氯甲烷提取6000 g干植物材料，得到220 g干提取物(由德国Andernach的Finzelberg GmbH & Co. KG提取)。

采用真空液相色谱(VLC)对大量提取液进行分离。将36 g二氯甲烷提取液在二氯甲烷中重新溶解，与70 g硅胶混合蒸发干燥，在砂浆中研磨得到均质粉末。用12 × 40 cm的硅胶柱填充900g硅胶，置于硅胶提取物顶部，用海砂压实样品。通过减压使流动相通过。收集的馏分经薄层色谱(TLC)检查后，将条带相似的馏分进行重组，得到3个组合馏分(F1.1-F1.3;表格1)．

F1.1的VLC分馏．从粗提物中提取F1.1 10g，溶解在二氯甲烷中，与20g硅胶混合，蒸发干燥，在砂浆中精炼，涂抹在5 × 60 cm硅胶柱上。用表中所示的流动相洗脱化合物2通过施加减压。收集馏分进行薄层色谱检查，将相似馏分重组，得到9个组合馏分(F2.1-F2.9)。

F2.6的柱层析(CC)分馏(小于2g的残渣用CC分馏)。将F1.1分馏得到的1.6 g F2.6溶于二氯甲烷中，与3 g硅胶混合，蒸发干燥，置于5 × 50 cm硅胶柱上，流动相洗脱，如表所示3.．收集的馏分经薄层色谱(TLC)检查，将带型相似的馏分重组，得到10个组合馏分(F3.1-F3.10)。

F3.3的CC馏分。从F2.6中提取1.08 g F3.3，溶解于二氯甲烷中，置于2 × 30 cm硅胶柱上。流动相使用如表所示4．通过薄层色谱对组分进行检测，将带型相似的组分进行重组，得到12个组合组分(F4.3.1-F4.3.12)。

F4.3.7的CC馏分。146 mg F4.3.7溶于二氯甲烷，应用于80 × 1.5 cm硅胶柱，用1升溶剂(氯仿:甲醇:水，95:1.5:0.1)分馏。分数收集在试管中，每分钟10滴，每30分钟更换试管。然后用300ml甲醇洗涤柱。将带型相似的组分进行重组，得到12个组分(F5.3.7.1-F5.3.7.12;参见图3 (c))．

F3.6的CC分馏。从F2.6中提取0.32 g F3.6，溶解于甲醇中，应用于3.5 × 40 cm的Sephadex色谱柱(2.5 × 40 cm for 3.6)。以甲醇为流动相，收集馏分，薄层色谱检查，将带型相似的馏分重组，得到4个组合馏分:F4.6.1 (9 mg)、F4.6.2 (5 mg)、F4.6.3(207 mg)， F4.6.4 (55 mg)。

F4.6.3的CC馏分。将F3.6中提取的F4.6.3(非常油性)20mg溶于二氯甲烷中，与硅胶混合，涂在一个2.5 × 15 cm二氯甲烷条件硅胶柱上。用二氯甲烷:乙酸乙酯(50:50)洗脱成功。将带型相似的组分进行重组，得到6个组合组分(F5.6.3.1-F5.6.3.6;参见图4 (b))．

2．3.薄层色谱法

采用薄层色谱法进行控制。固定相和流动相如表所示5．五种溶剂体系的流动相不同。在紫外线下检测底片₂₅₄、紫外₃₆₆，在可见光下，喷涂前后用茴香醛硫酸试剂(ASR)。ASR由0.5 mL茴香醛、10 mL冰醋酸、85 mL甲醇和5 mL H组成₂所以₄(硫酸)。将喷涂板在100°C下加热5分钟，然后在紫外线下检测化合物_254365年和可见光。除非另有说明μL提取液或馏分溶液应用于平板。

2．4．细胞培养

HL-60(人早幼粒细胞白血病细胞)细胞购自美国型培养收集(ATCC)。细胞在添加10%热灭活胎牛血清(FCS)、1%谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中生长。培养基和补充剂均来自Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)。细胞保存在37°C含5% CO的潮湿环境中₂．

2．5．扩散分析

扩散分析(8，9，分析其对HL-60细胞增殖的抑制作用p . odorata．提取液和馏分在乙醇中溶解(最终浓度为0.2%)。HL-60细胞以1 × 10的浓度接种于24孔板中⁵细胞每毫升RPMI培养基允许对数增长的时间内与植物提取物或馏分处理。对照品用溶剂处理。24和48小时后，使用Sysmex Cell Counter (Sysmex Corp.，神户，日本)测定细胞数。实验进行了三次。应用以下公式计算细胞分裂进展百分率与对照组比较:

2．6．细胞凋亡检测

通过Hoechst 33258 (HO)和碘化丙啶(PI)双染色(Sigma, St. Louis, MO, USA)测定细胞死亡(早期或晚期凋亡或坏死)的数量和类型[10- - - - - -12］．因此，HL-60细胞以1 × 10的浓度接种于24孔板中⁵细胞每mL RPMI培养基。用提取物或提取物处理细胞p . odorata。细胞分别孵育8、24、48和/或72小时，视实验情况而定。在每个时间点，100μ将每孔的L细胞悬浮液转移到96孔板的单独孔中，以最终浓度为5加入Hoechst 33285和碘化丙啶μg / mL和2μ分别g / mL。37℃孵育1小时后，使用配备DAPI过滤器的Axiovert荧光显微镜(Zeiss, Jena, Germany)检查并拍照。根据HOPI染色显示的形态学特征，通过肉眼检查照片评估细胞死亡的类型和数量。实验进行了三次。

2.7。西方墨点法

制备溶菌产物。将HL60细胞以1 × 10的浓度接种于组织培养瓶中⁶细胞每mL RPMI培养基。p . odorata分数F1、F4.6.3和F4.3.7采用western blot分析。将HL60细胞与40μg/mL F1或10μg/mLp . odorata表示时间的分数。在每个时间点，4 × 10⁶收集细胞，置于冰上，离心(1000 rpm, 4°C, 4分钟)。弃上清(培养基)，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.2)洗涤2次，离心(1000 rpm, 4℃，4 min)。细胞颗粒在含有150 mM NaCl、50 mM Tris (pH 8.0)、1% Triton-X-100、1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和1 mM蛋白酶抑制剂鸡尾酒(PIC)的缓冲液中溶解(Sigma, Schnelldorf，德国)。然后在4°C, 12000 rpm离心20分钟。上清转移到1.5 mL试管中，在−20°C下存储，以便进一步分析。

凝胶电泳(SDS-PAGE)和印迹。将等量的蛋白样品(裂解液)与十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液(1:1)混合，并加载到10%聚丙烯酰胺凝胶上。蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)在120伏特下分离约1小时。为了使蛋白质易于被抗体检测，他们从凝胶电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF) Hybond膜(Amersham, Buckinghamshire, UK)在95伏特下80分钟。膜干燥30分钟，以固定膜上的蛋白质。用甲醇湿润膜。用Ponceau S (Sigma, Schnelldorf, Germany)对膜进行染色，以检查等样量。

蛋白质检测。用PBS或TBS (Tris缓冲盐水，pH 7.6)洗涤后，用PBS或TBS牛奶(5%脱脂奶粉，PBS含0.5% Tween 20或TBS含0.1% Tween 20)在室温下封闭膜一小时。然后用PBS/T (PBS含0.5% Tween 20)或TBS/T (TBS含0.1% Tween 20)冲洗膜，每5分钟更换洗液4 - 5次。然后每个膜用一抗(1:50 0)在封闭溶液中(根据数据表TBS-， PBS-milk或TBS-， PBS-BSA)，在4°C轻轻摇晃过夜。再用PBS/T或TBS/T洗涤膜，用1:2000稀释的第二种抗体(过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG或抗小鼠IgG)在室温下孵育1小时。清洗膜后，使用增强化学发光(ECL) +检测试剂盒(Amersham, UK)(2秒到10分钟)开发化学发光，并将膜暴露于Lumi-Imager F1 (Roche)中以增加次数。

2.8。抗体

小鼠腹水抗乙酰化单克隆α微管蛋白(6-11B-1)和βactin (AC-15)抗体来自Sigma (St. Louis, MO, USA)。单克隆鼠标α微管蛋白(DM1A),β-微管蛋白(H-235)、Cdc25A (F-6)和兔paxillin (H-114)、ROCK-1 (C8F7)、c-Jun (H-79)、Jun b(210)均来自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)。单克隆兔cleaved caspase 8 (Asp391) (18C8)和phospho-Stat3 (Tyr705)(D3A7)抗体以及多克隆兔cleaved caspase 3 (Asp175)、人特异性cleaved caspase 9 (Asp330)、phospho-Chk2 (Thr68)、Chk2、phospho-myosin light chain 2 (MLC2-Ser19)、myosin light chain 2、Stat3和MYPT1均来自Cell Signaling (Danvers, MA, USA)。多克隆兔phospho-Cdc25A (Ser177)抗体来源于Abgent (San Diego, CA, USA)，多克隆兔phospho-MYPT1 (Thr696)来源于Upstate (NY, USA)，小鼠单克隆γH2AX (pSer139) (DR 1017)来自Calbiochem (San Diego, CA, USA)，小鼠单克隆c-Myc Ab-2 (9E10.3)来自Thermo Fisher Scientific, Inc. (Fremont, CA, USA)。二抗过氧化物酶偶联抗兔IgG和抗鼠IgG购自Dako (Glostrup, Denmark)。

2.9。统计分析

统计分析使用Excel 2003软件和Prism 5软件包(GraphPad, San Diego, CA, USA)。用均数±标准差和学生数表示采用-检验比较对照组和处理组之间的差异。设置显著性水平为．

3.结果与讨论

的二氯甲烷提取物p . odorata显示出较强的抗肿瘤活性(图1(一))．因此，我们对该提取物进行了分离，并通过检测细胞凋亡率和/或增殖率的生物测定来持续监测其活性，以接近其活性原理。在第一轮中，将粗提物分为三个不同的部分，其中F1.1部分表现出最强的抗增殖和促凋亡活性(图)1 (b)和1 (c))．40μg F1.1/mL诱导caspase 3降低β肌动蛋白和α-微管蛋白水平，因此也降低了乙酰化水平α-微管蛋白在处理4 h内检测到(图1 (d))．这表明，总体蛋白下降是由于caspase 3的早期激活和随后的细胞死亡。

F1.1进一步加工得到F2.1-F2.9馏分。F2.6几乎和F2.7一样活跃(图2(一个))，但所含的组分比前者多10倍(分别为1.9 g和0.2 g)。因此，对F2.6进行进一步处理，得到F3.1-F3.10馏分(图3)2 (b)和2 (c))．

10μg/mL F3.4-F3.6对HL60细胞具有较强的抑制增殖作用，抑制细胞生长达100%。TLC分析表明，F3.3和F3.6均含有明显的主化合物，因此对F3.3和F3.6进行了进一步的分离。此外，F3.2也进行了处理，然而，这只产生了几个低活性馏分(数据未显示)。(我)F3.3的细分在硅胶柱上得到有效的抗增殖和促凋亡组分F4.3.7(图3(一个)和3 (b))．F4.3.7进一步分离，使强细胞毒活性组分分解为许多低活性组分(F5.3.7.1-F5.3.7.12;数字3 (c))，其活性总和接近前驱体的活性。(2)F3.6的子处理取得了分数F4.6.1-F4.6.4。F4.6.3非常油腻，最利于凋亡(图)4(一))．进一步分离后，F4.6.3活性还可分解为几个低活性组分(F5.6.3.1-F5.6.3.6;数字4 (b))．

因此，我们回到F4.3.7和F4.6.3，并继续对这两个不同的高活性组分进行分析。F4.3.7和F4.6.3的TLC图谱明显不同，说明它们含有不同的化合物(图)5(一个))．为了区分这两种不同的部分类型，我们研究了与细胞凋亡和细胞周期阻滞相关的蛋白的翻译后修饰和表达水平。F4.3.7轻微诱导Chk2磷酸化并激活，而F4.6.3则没有(图)5 (b))．Chk2在Ser177位点磷酸化Cdc25A，并将其标记为蛋白酶体降解[13，14］．然而，用F4.3.7处理HL60细胞可导致Ser177去磷酸化和蛋白稳定。尽管Ser177磷酸化，F4.6.3仍然稳定Cdc25A。这表明Cdc25A在这种情况下不受Chk2活性的调控。此外，Cdc25A的稳定表明细胞周期活动增加[15］．但细胞增殖受到抑制。

在寻找减少增殖的分子原因时，我们发现分馏步骤富集了纺锤体毒素或间接微丝靶向活性。这反映在诱导α-微管蛋白乙酰化，这是微管蛋白微丝聚合状态的指标[16，17]， F4.3.7和F4.6.3处理后2 h内(图5 (c))．之后，caspase 3被激活。同时，H2AX在处理后发生磷酸化，表明DNA损伤可能是由于caspase-3诱导的DNA片段因子(DFF;［18])，因为caspase 3活化和H2AX磷酸化同时发生[19］．显然，细胞凋亡的分子发生比研究的细胞周期调控因子的协调表达更快。有趣的是，caspase 3的激活与caspase 8的激活同时发生，而与caspase 9的激活不一致，这说明凋亡通路是被激活的，而不是被激活的。与F4.3.7和F4.6.3相比，F1.1更明显地将caspase 3加工成活性片段。这很可能是由于使用了4倍高的F1.1浓度(40μg/mL)，也引起降解α微管蛋白和β-肌动蛋白是细胞迅速死亡的结果。

Chk2的活化水平较低或不存在，表明粗提物中存在一种基因毒性活性[6和其他子馏分[7，在所描述的分馏过程中被消除。避免遗传毒性可能是有益的，因为它减少了DNA损伤和可能导致继发性恶性肿瘤的后续突变。Cdc25A，一种分类癌基因[20.，21因此，我们也研究了其他癌基因的表达，这些癌基因与肿瘤的生长和进展有关。F4.6.3对c-Myc的抑制作用显著，而对c-Jun的抑制作用较小。更有效的F4.3.7还抑制了Stat3 Tyr705的磷酸化，从而抑制了其功能，这是已知的在肿瘤进展中发挥作用的[22］．该组分进一步抑制JunB、c-Jun和c-Myc比F4.6.3更有效。

自p . odorata也被用作伤口愈合药物，这一特性还涉及组织再生和被称为“上皮向间质转化”(EMT)过程的调节[23，24］．EMT最显著的特征是获得移动表现型[25，26］．如果EMT是短暂的且受到严格调控，那么它对机体是有益的，因为它有助于急性炎症和组织修复[27- - - - - -29］．相反，EMT的慢性状态发生会导致诸如癌症进展等疾病[30.］．癌细胞的移动性是血管内和外渗、组织浸润和转移扩散的先决条件[23，31，它是由蛋白质介导的，使细胞可塑性和运动。因此，癌细胞中运动相关基因产物的改变，如帕罗西林[32，33], ROCK1 [34]， MLC2用于形成应力纤维[35]及MYPT [36，是运动能力增加的指标，因此癌症进展。此外，白血病细胞如分化的HL60附着在ECM和血管细胞上，并通过血管壁转移，侵入组织[37- - - - - -39，并加剧了疾病的发展。因此，尽管HL60细胞通常在悬浮状态下生长，但它们拥有一系列促进细胞运动的蛋白质。F4.3.7治疗可导致ROCK1抑制低于本构和可检测水平，而F4.6.3则不是这样(图)5 (d))．此外，MYPT表达在F4.3.7治疗后降低。Paxillin在F4.6.3处理后上调，在F4.3.7处理后略有上调，这也是MLC2磷酸化的情况。自p . odorata成功用于组织恢复和皮肤瘀伤的愈合，增加细胞(成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞等)的流动性是关闭组织破坏所需的。然而，这种特性在整个癌症治疗过程中都是有害的，消除这种活动可能对实现这一目的是有益的。因此，未来的研究需要解决F4.3.7是否有利于癌细胞的治疗，而F4.6.3表现出先进的伤口愈合特性。

4.结论

纺锤体损伤活性随着分数的增加而增强，这反映在增加α-微管蛋白乙酰化，然后激活caspases 8和3，形成典型的细胞核凋亡形态。两组分对凋亡的影响和凋亡调节因子激活的调控是相似的。与早期工作相比，Chk2的基因毒性成分被消除。

重要的是，F4.6.3诱导了迁移标记，而F4.3.7抑制了迁移标记的表达或不干扰其组成表达。这一特性暗示了F4.3.7对肿瘤进展的抑制作用，这也反映在癌基因Jun家族的下调和Stat3活性的抑制上。

这些发现可以为(1)在F4.6.3情况下支持伤口愈合或(2)在F4.3.7情况下干扰肿瘤进展的治疗方法的发展提供基础。

致谢

作者要感谢Toni Jäger准备了这些数据。这项工作得到了G. Krupitza创新和跨学科癌症研究基金的支持。

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