ECAM 以证据为基础的补充和替代医学 1741 - 4288 1741 - 427 x Hindawi出版公司 701927年 10.1155 / 2012/701927 701927年 研究文章 分离提取的 Pluchea odorata分离一个属性指示性的感应细胞从一个抑制肿瘤表型可塑性 Seelinger Mareike 1 Popescu Ruxandra 2 Seephonkai Prapairat 2 Singhuber 朱迪思 2 Giessrigl Benedikt 1 昂格尔 克里斯汀 1 鲍尔 Sabine 1 瓦格纳 卡尔 3 Fritzer-Szekeres 莫妮卡 4 Szekeres 托马斯。 4 迪亚兹 刘若英 5 图坦卡蒙 福斯特M。 5 弗里希 理查德。 5 Feistel 比约恩 6 科普 林 2 Krupitza Georg 1 Taranalli Ashok D。 1 临床病理学研究所 维也纳医科大学 Waehringer Guertel 18 - 20 1090年维也纳 奥地利 meduniwien.ac.at 2 生药学部门 生命科学学院 维也纳大学 AlthanstraBe 14 1090年维也纳 奥地利 univie.ac.at 3 营养科学系的 生命科学学院 维也纳大学 1090年AlthanstraBe 14日维也纳 奥地利 univie.ac.at 4 临床医学和化学研究所实验室诊断 维也纳医科大学 Waehringer Guertel 18 - 20, 1090年维也纳 奥地利 meduniwien.ac.at 5 人种生物学研究所 盐湖戴安娜 Peten圣何塞 危地马拉 6 Finzelberg GmbH & Co .公斤 科布伦茨街48-54 56626年Andernach当地 德国 2012年 13 3 2012年 2012年 29日 09年 2011年 06 12 2011年 2012年 版权©2012 Mareike Seelinger et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

介绍。几项研究表明,抗炎药物表现出优秀的anti-neoplastic属性。的提取 Pluchea odorata(菊科),用于伤口愈合和炎症条件下,分离和属性关联anti-neoplastic和伤口愈合分离效果。 方法。六个分离步骤使用硅胶,交联葡聚糖列,和不同的溶剂系统被使用,并筛选了分数被薄层色谱分析,细胞凋亡和增殖化验。致癌基因的表达和蛋白质调节细胞迁移研究在治疗后免疫印迹HL60细胞最活跃的分数。 结果。顺序分离富集anti-neoplastic活动抑制癌基因表达JunB, c-Jun,原癌基因,Stat3。此外,一小部分(F4.6.3)诱导或保持流动性的表达标记MYPT ROCK1,和桩蛋白可能与另一个分离馏分(F4.3.7),抑制这些标记。 结论。伤口愈合形成瘢痕或特定的组织,因此,化合物增强细胞迁移支持这一过程。相比之下,成功的anti-neoplastic抗肿瘤治疗进展,因此,抑制细胞迁移是强制性的。

 1。介绍

药物发现是一个常数需要生物医学研究和临床进展。尤其是mega-biodiversity中美洲的热带雨林等领域非常有前途的新药物的发现铅的化合物。因此,我们选择一个ethnomedical药物发现方法,关注传统疗法的玛雅预选植物具备健康的影响。

传统医学的植物通常是用于数百年( 1),这就是为什么没有或只有小毒性作用在人类可以预期。特别是在非洲,中美洲和南美洲,传统医学被巫师建议,抑或,或者草药医生,经常保持使用治疗植物的秘密( 2]。尽管使用这些植物时代以来,人们很少知道“活动”原理和/或有针对性的细胞机制,因此,这些补救措施有一个药物开发潜力巨大。我们针对不同属性的分离和隔离的玛雅愈合 Pluchea odorata相关抗癌治疗。 p . odorata生长在美国、墨西哥、伯利兹、危地马拉、巴拿马、开曼群岛、瓜德罗普、牙买加、波多黎各、圣卢西亚、委内瑞拉和厄瓜多尔(种质资源信息网络,美国农业部,2004年11月9日, http://www.ars-grin.gov/cgi-bin/npgs/html/taxon.pl?104497),仍然是玛雅人用来治疗感冒、发烧、流感、感冒,头痛,高血压、神经痛、眼炎,麻痹,肺炎,蛇咬,肿胀,皮肤炎症和瘀伤( 3]。的医疗解决方案是由沸腾两把叶子在一加仑的水,然后经常应用于受灾地区,直到炎症消退( 4]。进一步描述的植物是解药,涩,发汗剂、止血剂 5),以及传统的母亲分娩后减少感染的风险和运输组织恢复( 3]。Gridling等 。( 6)和鲍尔et al 。( 7)描述一个强大的anti-neoplastic效应的二氯甲烷提取MCF-7和HL60细胞和抗炎反应HUVECs(人类脐静脉内皮细胞)。

药品准备标准化的条件下,通常只包含一个活动原则。相比之下,ethnopharmacologic补救措施是大量的化合物的混合物,在许多情况下未知的,和他们的组成和活动根据不同集合的增长领域和时间。这使得它们难以应用程序和交易。此外,植物提取物也可以包含化合物系统有毒或抵消预期效果的积极原则(s)。另一方面,一些不同的化合物在植物提取物可以把。目前的工作将给这种现象的例子。一个共同的理由终止 先天的成功的治疗各种癌症和其他疾病的耐药性。然而,迄今为止还没有报道,复杂植物混合物诱导治疗抵抗患者,最有可能因为几个不同的活跃的原则目标同时各种内部和细胞间的信号通路,从而防止微生物产生一种“逃避机制。“因此,复杂的提取的发展应考虑作为一个策略来治疗癌症。标准化程序这些混合物必须单独开发提供治疗是有效和安全的每一批,不表现出变化。分馏和陪同测试在生物分析和适当的分析是一个可行的概念标准化和补救措施等新兴沿着程序可以通过国家机构(即。Avemar,我们2004014406 (A1):“使用发酵小麦胚芽提取物抗炎剂”Hidvegi和Resetar)。

在这里,我们描述的二氯甲烷提取分离方法 p . odorata,这是不断由bio-assays关于其活动控制和分析,可以标准化。这导致分数导致不同的细胞反应表明伤口愈合或anti-neoplastic属性。

 2。材料和方法 2.1。植物材料

天线部分(叶、主茎花期) Pluchea odorata(l)卡斯。收集在危地马拉,Peten Departamento Peten Lago西北海岸附近的红玫瑰,在圣何塞的四岁的次生植被~ 1公里路的北从圣何塞La Nueva圣何塞(16° 59 ′ 30. ′ ′ N, 89° 54 ′ 00 ′ ′ 凭证标本(腿W)。g . Krupitza & r·o·弗里希Nr。1 - 2009, 08年。04。2009年,标本W)归档的自然历史博物馆,维也纳,奥地利。6公斤的风干植物材料与二氯甲烷提取了Bjorn Feistel (Finzelberg GmbH & Co .公斤,Andernach取名德国),和在黑暗中提取存储在一个除湿器在4°C到使用。

 2.2。植物提取和分离

植物提取与二氯甲烷是如前所述 6, 7]。6000克干植物原料提取与二氯甲烷导致220克干提取(萃取是由Finzelberg GmbH & Co .公斤,Andernach取名德国)。

真空液相色谱(VLC)是用于大量的分离提取。36克二氯甲烷提取再溶解在二氯甲烷、混合与70克硅胶和蒸发干燥,和地面砂浆中获得一个同质粉末。12×40厘米列挤满了硅胶900克、矽胶来提取上,覆盖着海砂压载水样本。流动相是通过应用程序的减压。检查后收集到的分数通过TLC,那些类似的乐队重组,这导致三个结合分数(F1.1-F1.3;表 1)。

二氯甲烷提取的用于VLC移动阶段。

流动相 关系 体积(左) 分数 残渣(g)
石油醚 4
石油醚:氯仿 9:1 5 F1.1 23.9
氯仿 12
氯仿:甲醇 9:1 9 定焦 10.8克
氯仿:甲醇 7:3 9
氯仿:甲醇 5:5 9
氯仿:甲醇 3:7 9 F1.3 1.6克
氯仿:甲醇 1:9 9
甲醇 9

VLC分馏的F1.1。F1.1 10 g,这是源自于粗提取液,在二氯甲烷溶解,混合着20克硅胶,蒸发干燥,精制在臼,和应用的5×60厘米硅胶柱。化合物筛选了与移动阶段表所示 2通过应用减压。收集分数被薄层色谱检测,和类似的分数被重组的九个分数(F2.1-F2.9)相结合。

用于VLC F1.1移动阶段。

流动相 关系 体积(左) 分数 残渣(g)
二氯甲烷:hexan 8:2 2 F2.1 1.63
二氯甲烷 2 F2.2 0.17
二氯甲烷:乙酸乙酯 8:2 1 F2.3 1.28
二氯甲烷:乙酸乙酯 6:4 1 F2.4
二氯甲烷:乙酸乙酯 4:6 1 F2.5 4.57
二氯甲烷:乙酸乙酯 2:8 1 F2.6 1.73
乙酸乙酯 1 F2.7 0.22
乙酸乙酯:甲醇 8:2 1 一生 0.04
乙酸乙酯:甲醇 6:4 1 F2.9 0.12

柱层析(CC)分馏F2.6(小于2 g的残渣被CC)分馏。1.6 g F2.6,通过分馏F1.1溶解在二氯甲烷,与3 g硅胶混合,蒸发干燥,放置在一个5×50厘米silicia凝胶柱和筛选了与移动阶段表所示 3。收集到的分数被薄层色谱检查和类似的乐队模式重组收益十分数(F3.1-F3.10)相结合。

用于CC F2.6移动阶段。

流动相 关系 体积(左) 分数 残渣(g)
二氯甲烷 100% 1 F3.1 0.02
二氯甲烷:乙酸乙酯 80:20 2 F3.2 0.05
F3.3 1.14
二氯甲烷:乙酸乙酯 60:40 1 F3.4 0.07
F3.5 0.05
二氯甲烷:乙酸乙酯 40:60 1 F3.6 0.32
F3.7 0.02
二氯甲烷:乙酸乙酯 20:80 1 F3.8 0.01
F3.9 0.03
乙酸乙酯 100% 1 F3.10 0.04

CC F3.3分馏。1.08克F3.3,来自F2.6,溶解在二氯甲烷和放置在一个硅胶柱2×30厘米。移动阶段如表中所示 4。分数被薄层色谱检测,和那些类似的乐队模式重组产生12分数(F4.3.1-F4.3.12)相结合。

用于CC F3.3移动阶段。

流动相 关系 卷(毫升) 分数 残渣(毫克)
二氯甲烷 100% 500年 F4.3.1 0.4
二氯甲烷:乙酸乙酯 90:10 500年 F4.3.2 3
F4.3.3 59
F4.3.4 91年
二氯甲烷:乙酸乙酯 80:20 500年 F4.3.5 256年
F4.3.6 65年
二氯甲烷:乙酸乙酯 60:40 500年 F4.3.7 146年
F4.3.8 8
二氯甲烷:乙酸乙酯 40:60 500年 F4.3.9 6
F4.3.10 111年
二氯甲烷:乙酸乙酯 20:80 500年 F4.3.11 63年
乙酸乙酯 100% 500年 F4.3.12 3

CC F4.3.7分馏。146毫克F4.3.7二氯甲烷溶解,应用于80×1.5厘米硅胶柱和分馏升溶剂(氯仿:甲醇:水,95:1.5:0.1)。分数是在收集管,每分钟十滴,每30分钟管被改变了。后来列与300毫升甲醇洗。分数被薄层色谱检测,和那些有类似的乐队模式重组导致12分数(F5.3.7.1-F5.3.7.12;参见图 3 (c))。

CC F3.6分馏。0.32 g F3.6,来自F2.6,是溶解在甲醇和应用的交联葡聚糖列3.5×40厘米(2.5×40公分3.6)。甲醇作为流动相,分数被TLC收集和检查,和那些类似的乐队模式重组产生四个结合分数:F4.6.1(9毫克),F4.6.2(5毫克), F4.6.3(207毫克),F4.6.4(55毫克)。

CC F4.6.3分馏。20毫克F4.6.3(油性),来自F3.6,溶解在二氯甲烷,与硅胶混合,和应用上2.5×15厘米二氯甲烷的硅胶柱。成功实现洗脱二氯甲烷:乙酸乙酯(50:50)。分数被薄层色谱检查和那些类似的乐队模式重组收益六个结合分数(F5.6.3.1-F5.6.3.6;参见图 4 (b))。

 2.3。薄层色谱法(TLC)

薄层色谱鉴别分馏的控制权。固定相及移动表中描述的阶段 5。5之间的流动相不同的溶剂系统。盘子被发现在紫外线下254年、紫外366年之前和之后,可见光,喷洒茴香醛硫酸试剂(ASR)。茴香醛ASR由0.5毫升、10毫升冰醋酸,85毫升甲醇和5毫升H2所以4(硫酸)。喷板在100°C加热五分钟,然后化合物被发现在紫外线下254365年和可见光。8,除非另有说明 μL提取或部分解决方案是应用于板。

固定相、移动阶段,和用于薄层色谱检测方法。

固定相 硅胶板60 F254(默克公司,达姆施塔特,德国)
流动相 薄层色谱系统1:氯仿:甲醇:水90:22:3.5
薄层色谱系统2:氯仿:甲醇:水90:3.5:0.2
薄层色谱系统3:二氯甲烷:乙酸乙酯80:20
薄层色谱系统4:二氯甲烷:乙酸乙酯85:15
薄层色谱系统5:氯仿:甲醇:水70:22:3.5
检测 紫外线254年,紫外线365年,可见光
茴香醛硫酸试剂(ASR)
2.4。细胞培养

HL-60(人类早幼粒细胞白血病细胞)细胞从美国购买类型文化集合(写明ATCC)。这些细胞被种植在RPMI 1640中补充heat-inactivated 10%胎牛血清(FCS) Penicillin-Streptomycin Glutamax 1%,和1%。媒介和补品都从生活中获得技术(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。细胞被保存在湿润的气氛在37°C包含5%的股份有限公司2。

 2.5。扩散分析

扩散分析( 8, 9)进行分析HL-60细胞的增殖抑制处理提取或分数 p . odorata。提取和分数都溶解在乙醇(最终浓度是0.2%)。HL-60细胞被播种在24-well板块1×10的浓度5细胞每毫升RPMI介质允许对数增长的时间内治疗与植物提取物或分数。控制处理溶剂。24和48小时后,细胞的数量决定使用Sysmex细胞计数器(Sysmex Corp .,神户,日本)。实验一式三份完成。比例的细胞分裂过程比未经处理的控制是通过应用下面的公式计算: C 48或72 h + 药物 - - - - - - C 24小时 + 药物 C 48或72 h - - - - - - 药物 - - - - - - C 24小时 + 药物 × One hundred. = % 细胞分裂 。

2.6。细胞凋亡检测

确定细胞死亡在33258年赫斯特(HO)和propidium碘(PI)双重染色(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)允许识别的数量和类型的细胞死亡(早期或晚期凋亡或坏死) 10- - - - - - 12]。因此,HL-60细胞被播种在24-well板1×10的浓度5细胞每毫升RPMI媒介。细胞治疗与分数或提取的 p . odorata。这些细胞被孵化8、24、48、和/或72小时,这取决于实验。100年,在每个时间点 μL细胞悬液的每个好转入单独的井的96孔板,和赫斯特33285年和propidium碘浓度被添加在最后5 μg / mL和2 μ分别g / mL。后一个小时的潜伏期在37°C,染色细胞检查和拍照Axiovert荧光显微镜(蔡司,耶拿,德国)配备DAPI过滤器。类型和数量的细胞死亡是评估通过视觉检查的照片根据形态特征揭示了霍皮人染色。实验一式三份完成。

 2.7。西方墨点法

制备溶菌产物。HL60细胞被播种在组织培养瓶1×10的浓度6细胞每毫升RPMI媒介。 p . odorata分数F1, F4.6.3 F4.3.7被西方的污点分析。与40 HL60细胞要么是孵化 μg / mL F1或10 μ克/毫升的另外两个之一 p . odorata分数的显示时间。在每个时间点,4×106细胞被收获,放在冰和离心机(1000 rpm, 4°C, 4分钟)。然后,上层清液(中)被丢弃,和颗粒与冷洗两次磷酸缓冲盐(PBS, pH值7.2)和离心机(1000 rpm, 4°C, 4分钟)。细胞颗粒细胞溶解在一个缓冲区包含150毫米氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0),液triton - x - 100 1%, 1毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF),和1毫米蛋白酶抑制剂鸡尾酒(PIC)(σ,Schnelldorf,德国)。后来溶解产物在12000转离心20分钟在4°C。上层清液转移到1.5毫升管和存储在−20°C进行进一步的分析。

凝胶电泳(sds - page)和印迹。等量的蛋白质样品(溶菌产物)和十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲(1:1)并加载到10%的聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质是由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(页面)120伏了大约一小时。制造蛋白质的抗体检测,他们从凝胶electrotransferred到聚乙二烯二氟化物(PVDF) Hybond膜(Amersham,白金汉郡,英国)在95伏80分钟。膜被允许干30分钟提供固定在细胞膜上的蛋白质。甲醇是用于湿膜。平等的示例加载被染色检查膜与朱红色年代(σ,Schnelldorf,德国)。

蛋白质检测。洗后用PBS或TBS(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水液pH值7.6),膜被封锁在PBS -或TBS-milk (PBS包含5%的脱脂奶粉0.5%渐变20或TBS含有0.1%渐变20)在室温下一个小时。然后膜洗了PBS / T (PBS含有0.5%渐变20)或TBS / T (TBS含有0.1%渐变20),改变每五分钟清洗解决方案4到5倍。然后每膜是孵化主要抗体(1:500)在屏蔽解决方案(根据数据表TBS, PBS-milk或TBS, PBS-BSA),在4°C /夜轻轻摇晃。随后膜再次用PBS / T或TBS / T和孵化与第二抗体(peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白或anti-mouse免疫球蛋白)稀释1:2000一小时在室温下。洗膜后,开发了化学发光增强化学发光(ECL)加上检测设备(英国Amersham)(两秒到10分钟),和膜暴露在Lumi-Imager F1(罗氏)增加。

 2.8。抗体

腹水anti-acetylated单克隆老鼠 α微管蛋白(6-11B-1)和 β肌动蛋白抗体(AC-15)来自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。单克隆鼠标 α微管蛋白(DM1A), β微管蛋白(h - 235), Cdc25A (F-6)和多克隆兔桩蛋白(h - 114), ROCK-1 (C8F7) c-Jun (h - 79),小君b(210)来自圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯、钙、美国)。兔单克隆裂解半胱天冬酶8 (Asp391) (18 c8)和phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7)抗体和兔多克隆裂解半胱天冬酶3 (Asp175),人类裂解半胱天冬酶9 (Asp330) phospho-Chk2 (Thr68)相关,phospho-myosin轻链2 (MLC2-Ser19),肌球蛋白轻链2,Stat3和MYPT1从细胞信号(丹弗斯、马、美国)。多克隆兔phospho-Cdc25A (Ser177)抗体Abgent(美国圣地亚哥,CA)多克隆兔phospho-MYPT1 (Thr696)从北部(美国纽约),鼠标单克隆 γ从Calbiochem H2AX (pSer139)(1017)博士(美国圣地亚哥,CA),和鼠标单克隆原癌基因Ab-2 (9 e10.3)从热费希尔科学,Inc .(弗里蒙特、钙、美国)。二次抗体peroxidase-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白和anti-mouse免疫球蛋白买来Dako(斯特鲁普、丹麦)。

 2.9。统计分析

统计分析、软件Excel 2003和棱镜5软件包(GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。的值被表示为平均值±标准偏差,和学生的 t 以及应用于控制样品和治疗组之间比较差异。将统计显著性水平 P < 0.05 。

 3所示。结果与讨论

的二氯甲烷提取 p . odorata展品强劲anti-neoplastic活动(图 1(一))。因此,我们分次提取,不断监控活动bio-assays测量细胞凋亡和/或扩散率接近活动原则。在第一轮的粗提取液被分成了三个不同的分数,分数F1.1表现出最强的anti-proliferative和proapoptotic活动(数据 1 (b)和 1 (c))。40 μg F1.1 /毫升诱导半胱天冬酶3和减少 β肌动蛋白和 α微管蛋白的水平,因此也乙酰化水平降低 α微管蛋白被发现(图4 h内治疗 1 (d))。这表明整个蛋白质减少是由于早期激活半胱天冬酶3和随后的细胞死亡。

抗增殖作用(a)二氯甲烷粗提取液,(b)分数F1.1 HL60细胞;1×105细胞被播种到24-well板/毫升、孵化和5,15,40岁 μg / mL提取或分数F1.1,扩散的百分比计算相对于溶剂处理控制在24小时内,(c)诱导的细胞凋亡F1.1:细胞生长所描述和孵化15 - 40 μ每个分数为72 h的g / mL。然后,细胞双染色与赫斯特33258和propidium碘和在显微镜下检查紫外线与DAPI过滤器。细胞核形态变化显示细胞死亡统计,和死细胞的百分比计算。实验进行了一式三份。星号表示的意义比未经处理的控制( P < 0.05 ),误差表明±SD。(d) 1×106细胞/ 40毫升孵化了 μ0.5 g / mL F1.1和收获后,2,4,8日和24小时的治疗,细胞溶解,总蛋白sds - page。与表示抗体进行免疫印迹分析。平等的示例加载被朱红色年代染色和确认 β肌动蛋白分析。

的分数F2.1-F2.9 F1.1进一步处理。F2.6那样活跃F2.7(图 2(一个)部分材料),但包含~ 10倍(1.9 g和0.2 g,职责)。因此,F2.6进一步处理的分数F3.1-F3.10(数字 2 (b)和 2 (c))。

(一)由F2.1-F2.9诱导HL60细胞的凋亡。1×105细胞/ mL被播种在24-well盘子和孵化10 μ每个分数为72 h的g / mL。然后,细胞双染色与赫斯特33258和propidium碘和在显微镜下检查紫外线与DAPI过滤器。细胞核形态变化显示细胞死亡统计,和死细胞的百分比计算。意义计算相比,控制(Co)。(b)的抗增殖效果F3.3 F3.6: 1×105细胞被播种到24-well板/毫升、孵化与2和图10所示 μ克/毫升的每个部分,扩散计算相对于溶剂的比例控制在24小时内处理。实验进行了一式三份。星号表示的意义比未经处理的控制( P < 0.05 )和误差表明±SD。(c)薄层色谱法(TLC) F2.6 F3.1-F3.10;流动相:TLC系统2。检测方法:与ASR可见光。

(一)F4.3.1-F4.3.12 HL60细胞的抗增殖作用;1×105细胞/ mL被播种到24-well盘子,孵化与5和10 μ克/毫升的每个部分,扩散计算相对于溶剂的比例控制在24小时内处理。(b)诱导的细胞凋亡F4.3.7和(c) F5.3.7.1-F5.3.7.12 HL60细胞;1×105细胞/ mL被播种在24-well板块和孵化(b) 5和10 μ克/毫升F4.3.7 24和48 h和(c)与2和5 μ克/毫升的每个表示分数24 h。然后,细胞双染色与赫斯特33258和propidium碘和在显微镜下检查紫外线与DAPI过滤器。细胞核形态变化显示细胞死亡统计,和死细胞的百分比计算。实验进行了一式三份。星号表示的意义比未经处理的控制( P < 0.05 ),误差表明±SD。

(一)诱导细胞凋亡;1×105HL60细胞/ mL被播种在24-well板块和孵化2和/或10 μF4.6.3 8 g / mL, 24和48小时或(b) 2和5 μ克/毫升F5.6.3.1-F5.6.3.6 24 h。然后,细胞双染色与赫斯特33258和propidium碘和在显微镜下检查紫外线与DAPI过滤器。细胞核形态变化显示细胞死亡统计,和死细胞的百分比计算。实验进行了一式三份。星号表示的意义比未经处理的控制( P < 0.05 ),误差表明±SD。

10 μ克/毫升F3.4-F3.6展出强大anti-proliferative属性HL60细胞抑制细胞增长了100%。薄层色谱分析表明,F3.3 F3.6,主要包含一个独特的化合物,因此F3.3和F3.6进一步分离。还F3.2处理,然而,这只是几个低活性分数(数据未显示)。

的subfractionation F3.3在硅胶柱产生了强有力的抗增殖和proapoptotic分数F4.3.7(数字 3(一个)和 3 (b))。进一步分离F4.3.7引起强烈的细胞毒性活动的分解成许多低活动分数(F5.3.7.1-F5.3.7.12;图 3 (c)),总之近似前体的活动。

的subprocessing F3.6取得了分数F4.6.1-F4.6.4。F4.6.3很油,是最pro-apoptotic(图之一 4(一))。在进一步分离,F4.6.3的活动也分解成几个低活性分数(F5.6.3.1-F5.6.3.6;图 4 (b))。

因此,我们回到F4.3.7 F4.6.3和持续的分析这两个不同的高度活跃的分数。F4.3.7 TLC模式和F4.6.3显然是不同于彼此证明,它们包含不同的化合物(图 5(一个))。描述两种不同的分数,转译后的修改和蛋白质的表达水平,相关细胞凋亡和细胞周期阻滞。F4.3.7略诱导相关的磷酸化,从而激活,而F4.6.3没有(图 5 (b))。相关的被证明使磷酸化Cdc25A Ser177和标签的蛋白酶体降解[ 13, 14]。然而,治疗HL60细胞F4.3.7 Ser177和蛋白质稳定的脱磷酸作用引起的。还F4.6.3稳定Cdc25A尽管Ser177磷酸化。这涉及Cdc25A并不受相关的活动在这个场景中。此外Cdc25A稳定建议增加细胞周期活动( 15]。然而,细胞增殖抑制。

(一)薄层色谱法(TLC) F4.6.3(左面板)和F4.3.7(右面板);流动相:TLC系统2;检测方法:紫外线254年。(b)分析细胞周期检查点监管机构,(c) apoptosis-related蛋白质,(d)致癌基因,(e)蛋白质所需的流动性;1×106HL60细胞/ 10毫升孵化了 μ分别g / mL F4.6.3和F4.3.7,收获后0.5,2,4,8,24小时的治疗。细胞细胞溶解和获得的蛋白质样品应用sds - page。免疫印迹分析表明抗体。平等的示例加载证实了朱红色年代的染色 β肌动蛋白或 β微管蛋白分析。

寻找减少核扩散分子原因,我们发现丰富的分离步骤主轴毒素或间接microfilament-targeting活动。这是反映在诱导 α微管蛋白乙酰化,这是一个指示器(微管蛋白的聚合状态微丝骨架的 16, 17),在治疗2 h F4.3.7和F4.6.3(图 5 (c))。此后,半胱天冬酶3成为激活。H2AX的磷酸化发生在治疗后与分数表明DNA损伤可能是由于caspase-3-induced DNase活动的DNA碎片因子(DFF;( 18),因为半胱天冬酶3激活和H2AX磷酸化同时出现( 19]。显然,细胞凋亡发生的分子发病速度比策划研究细胞周期调控因子的表达。有趣的是,激活半胱天冬酶3同意半胱天冬酶的激活8,但不激活半胱天冬酶9,表明外在凋亡通路成为激活而不是内在。半胱天冬酶3的signature-type处理到活性片段被F1.1更加突出比F4.3.7和F4.6.3。这是最有可能由于F1.1浓度高四倍(40 μg / mL),导致退化 α微管蛋白和 β肌动蛋白迅速出现细胞死亡的后果。

低或没有激活相关(职责)建议不会活动,也曾出现在粗提取液( 6和其他小分支 7整个描述分离),被淘汰。避免基因毒性可以是有益的,因为它减少了DNA损伤和随后的突变,可能会导致继发性恶性肿瘤。Cdc25A,分类致癌基因( 20., 21)是调节两部分类型,因此我们也调查了其他致癌基因的表达,与肿瘤生长和发展。F4.6.3实质性的影响原癌基因的镇压和c-Jun只有轻微影响。更加有效F4.3.7抑制Stat3 Tyr705的磷酸化,从而抑制其功能,这是众所周知的,在肿瘤进展中发挥作用( 22]。这个分数进一步压抑JunB c-Jun,原癌基因比F4.6.3更有效。

自 p . odorata也用作伤口愈合药物,这个属性还包括组织再生和调节这一过程被称为“上皮间充质转变”(EMT) [ 23, 24]。EMT的最突出特点是收购移动表型( 25, 26]。如果瞬态和严格监管,EMT是有益的生物,因为它有助于急性炎症和组织修复 27- - - - - - 29日]。相反,慢性状态发生的EMT导致疾病如癌症的进展( 30.]。癌细胞的流动是一个先决条件的内部和外渗脉管系统,组织入侵和转移性传播( 23, 31日),它是由蛋白质,使细胞可塑性和运动。因此,在癌细胞motility-related基因产品的变更,如桩蛋白( 32, 33],ROCK1 [ 34),MLC2应力纤维的形成( 35]和MYPT [ 36),增加流动性的指标,因此癌症恶化。也如白血病细胞分化HL60附加到ECM和血管细胞通过血管壁和轮回,入侵组织( 37- - - - - - 39,增加疾病的进展。因此,HL60细胞具有促进蛋白质的细胞运动尽管他们通常在悬浮生长。治疗F4.3.7 ROCK1镇压造成本构和检测水平以下,与F4.6.3并非如此(图 5 (d))。还与F4.3.7 MYPT表达减少在治疗。桩蛋白成为调节由F4.3.7 F4.6.3治疗和略,这也是理由MLC2的磷酸化。自 p . odorata成功地用于组织恢复和愈合的皮肤擦伤,流动性的增加细胞(成纤维细胞、上皮细胞、巨噬细胞等)必须关闭组织破坏。这个属性,然而,在癌症治疗是有害的,取消该活动可能是有益的。因此,未来的研究必须解决的问题是否F4.3.7便于癌细胞治疗,而F4.6.3展示先进的伤口愈合的特性。

 4所示。结论

通过分馏spindle-damaging活动变得丰富,这反映在增加 α微管蛋白乙酰化后的激活还8和3和细胞凋亡的典型核形态。对细胞凋亡的影响和细胞凋亡的编排调节器激活相似的分数。早期作品相比,基因毒性成分激活相关的被淘汰。

重要的是,F4.6.3诱导流动标记,而F4.3.7抑制流动性标记的表达或不干扰他们的组成型表达。这个属性结合F4.3.7在肿瘤发展的抑制作用的差别也反映出了对这些小君的致癌基因家族和Stat3的镇压活动。

这些研究结果可以提供一个基础疗法的发展(1)支持F4.6.3或伤口愈合(2)干扰肿瘤进展F4.3.7。

 确认

作者希望感谢托尼Jager准备数据。这项工作是支持的基金g . Krupitza创新和跨学科的癌症研究。

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